Summary
Detta protokoll mäter spatial inlärning och minne med Barnes labyrinten. En roman Damsel-i-nöd-paradigm används för att bedöma rörelseaktivitet och prosocial beteende hos möss.
Abstract
Barnes labyrinten är ett tillförlitligt mått på spatial inlärning och minne som inte kräver mat begränsning eller exponering för extremt stressande stimuli. Barnes labyrinten kan även bedöma andra mus beteenden, såsom allmän motivation att fly från labyrinten plattform och undersökande beteende. Barnes labyrinten kan mäta om en genetisk mutation eller miljömässiga variabel kan påverka förvärv och bibehållande av rumsliga minnen, samt ge information om Sökstrategin anställd av möss. Här använder vi Barnes labyrinten för att upptäcka ett minne underskott i vuxna möss efter en enda utvecklingsmässiga etanol exponering händelse. Nyligen beskriven Damsel-i-nöd paradigm exponerar en manlig mus till en kvinnlig mus instängd i en kammare i fältet öppna center Arena. Det ger en möjlighet för musen att socialt svara fångade honan och uppvisar prosocial beteende. Damsel-i-nöd paradigm kan också användas för att undersöka mus beteende i en ny arena och mäta rörelseaktivitet. Både Barnes labyrinten och protokollen Damsel-i-nöd kräver minimal finansiella investeringar och de flesta aspekter av testerna kan konstrueras från gemensamma lab leveranser. Dessa flexibla och tillgängliga verktyg kan också användas för att upptäcka beteendemässiga förändringar under loppet av utveckling.
Introduction
Syftet med detta protokoll är att mäta spatial inlärning och minne hos möss med Barnes labyrint samt social lyhördhet och locomotion använda dam-i-nöd paradigm. Vanligen används spatial inlärning och minne tester för gnagare inkluderar radial arm labyrinten, som mäter en Muss förmåga att hitta dolda mat i en arm av en multi-ekrad apparatur, och Morris vatten labyrinten, som förlägger en mus i ett stort badkar eller pool av vatten och bedömer hur lång tid det tar för att hitta en dolda undervattens plattform. Normalt är utbildning för dessa paradigm sträcker sig över flera prövningar och tillåter mätning av både lärande förvärv priser och bevarande genom kortsiktiga och långsiktiga minnet prövningar.
Trots att radiell-arm labyrint och Morris vatten labyrint tillförlitligt sätt att testa minne hos gnagare, presenterar de komplikationer för några forskare. Båda labyrinter använda frihetsberövande eller stark aversiva stimuli som förstärkning1. Radial arm labyrinten använder mat deprivation för att säkerställa att gnagare är ordentligt motiverade att hitta mat belöning. I Morris vatten labyrinten, kan effekterna av stress induceras av en påtvingad simtur förändra resultaten i möss2.
Barnes labyrinten är en alternativ rumsuppfattning uppgift som kräver gnagare att lära sig placeringen av ett hål för att undkomma den ljusa, öppna labyrint surface3. Svag aversiva stimulering (ljus eller ljud) används sedan för att öka sannolikheten för att möss kommer att fly från plattformen. Barnes labyrinten inte kräver mat deprivation, så mängden animaliska förberedelse är mindre än i den radiella arm labyrint. Det kan användas utan konflikter av forskare som undersöker beteenden eller molekyler som är associerad med äta, hormonell reglering eller hypotalamus vägar.
Barnes labyrinten har också fördelar över Morris vatten labyrinten. Det är mindre stressande än Morris vatten labyrinten, orsakar mindre förhöjda nivåer av kortikosteron i möss4. Dessutom, det är mycket enklare att montera och kräver mindre dedikerade utrymmet under testning förfarande och lagring.
Dam-i-nöd analysen är ett enkelt tvådelad experiment som kan bedöma rörelseaktivitet följt av prosocial beteende. Dam-i-nöd analysen syftar till att bedöma utforskande beteenden och social lyhördhet av en manliga gnagare som svar på en anhållna kvinnliga gnagare. En vanligt förekommande metod för att bedöma sällskaplighet (liksom preferens för sociala nyhet) är användningen av Crawley: s tre kammare sällskaplighet test som bedömer det fria valet av en mus att tillbringa tid nära eller bort från andra möss5.
Liknar Crawleys tre kammare sällskaplighet test, Damsel-i-nöd analysen mäter också fritt val angående hur att spendera tid i närvaro av en annan mus, men det ger också mätningar för djupare aspekter av social funktion: 1) i den Dam-i-nöd assay, fångade kvinnliga musen hålls i mitten av ett öppet fält, så den manliga potentiella aversion mot ett öppet fält ställs mot hans köra till socialt utforska eller undersöka en bedrövad kvinnlig hawaiimonark. (2) dam-i-nöd modellen ger också ett sätt att bedöma prosocial och empatiskt beteende som svar på den fångade mus, vilken inte har undersökts ofta hos möss.
Djur empati är definitivt observerbara och mätbara, men inte många paradigm existerar för detta ändamål. Till exempel hos råttor, kan en instängd bur mate framkalla ett tillstånd av prosocial motivation, där råttor kommer att arbeta som gratis det fångade djuret. I själva verket kommer råttor välja att hjälpa det fångade djuret även innan du öppnar en liknande behållare innehållande choklad mellanmål, sedan åt choklad och dela den med de nyligen frigivna råtta6.
Åtgärder av empati hos möss omfattar vanligtvis vållande av smärta; möss som titta på andra möss i smärta är faktiskt mer känsliga för smärta sig7,8. Återhållsamhet stress är ett kännetecknas fenomen hos gnagare och har varit tillsammans med chock att undersöka stressreaktioner, som ett mått av empati i möss9,10.
I området i närheten finns det etiska överväganden i samband med inducerad smärta eller chock, så behövs stress-inducerande alternativ. Vi utvecklat Damsel-i-nöd paradigm som ett mått på empatisk beteende i avsaknad av antingen smärta eller chockbehandling. Fångade möss i våra dam-i-nöd-protokollet visar tydliga tecken på ångest efter endast flera stunder som de är oförmögna att vända inom små behållare, men de är oskadda samtidigt som den ger en möjlighet för andra möss att bemöta deras nöd.
För att påbörja bedömningen Damsel-i-nöd, placeras en manlig mus i en stor roman arena som innehåller en liten tom centralcylindern. Utforskande beteenden registreras i flera minuter, inklusive hur många delar av arenan korsas och hur mycket tid som spenderas i området central öppen. Denna metod ger en snabb och enkelt sätt att utesluta rörelseapparaten underskott som en potentiella confounder i en lärandesituation som kräver samordnad rörelse för avslutad. Det ger också ett grundläggande mått på hur mycket motvilja till fältet öppen center är närvarande. Båda åtgärderna kan påverka Barnes labyrint prestanda.
Efter den inledande prospektering, hanen tas bort från arenan och en kvinnlig mus placeras i en sluten, små tydliga centrala cylindern (liknande som används för att samla blod från möss). Sedan den ursprungliga manliga mus återinförs i arenan och undersökande beteende görs igen. Dam-i-nöd paradigm bedömer om en mus är intresserade av en social interaktion baserat på ändringar i beteendemönster när en instängd kvinna är närvarande (poängsätts av tid i centrum torget och antalet gräva episoder) och om den mus uppvisar prosocial beteende mot fångade honan (poängsätts av mängden cylinder utredningar och kontakt evenemang med fångade honan). Dam-i-nöd analysen kan användas för att mäta en benägenhet för sociala nyhet (liknar Crawleys tre kammare sällskaplighet test) beroende på huruvida forskare svälla en bekanta eller nya mus.
Tillsammans, tillåta Barnes labyrinten och dam-i-nöd experiment korrekt utvärdering av mus inlärningsförmåga och social lyhördhet i avsaknad av extremt stressande stimuli. Som med alla beteendemässiga analyser, ska dessa experiment utföras med stor känslighet mot djur upplevelsen, minimera obehag upplevs av djuret.
Som de flesta labyrinter, kan skillnader i rörelseaktivitet påverka prestanda på Barnes labyrinten, så forskarna bör också bedöma rörelseaktivitet, särskilt när användande Barnes labyrinten för att bedöma lärande i möss med mutationer som kan försämra rörelse (som t.ex. de finns i musmodeller för Huntingtons sjukdom, eller de utsätts för gifter som kan orsaka hyperaktivitet eller fördröja rörelse, såsom etanol). Dessutom, labyrint och kammare ytor bör rengöras noggrant och sängkläder ändrats mellan varje djur att undvika doft cue förvirrar.
Ännu viktigare, alla material kan fabriceras på plats med minimal finansiell investering och små fysiska fotavtryck av dessa analyser innebär att dessa experiment kan replikeras i nästan någon inställning, vilket ger stor flexibilitet. Denna typ av hjälpmedel tillåter god vetenskap ska utföras på mindre institutioner med begränsade resurser eller i situationer där pilotdata behöver samlas snabbt i avsaknad av betydande stöd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Hampden-Sydney College eller Randolph-Macon College (där vissa arbete tidigare utfördes).
1. grundläggande bostäder av möss
- Hus på möss i plast burar med fasta bottnar och sidor, och ett lager av mjuka sängkläder och häckande material såsom papper fragmentering. Använd sängkläder som består av strimlad majskolvar eller träspån, och säkerställa att sängkläder byts regelbundet för sanitet.
- Ge tillgång till mat och vatten ad libitum. Toppen av plast buren hus en mat hopper. Fördela korrekt formulerade mus mat pellets från mat uppsamlaren och ger en Vattenautomat. Se till att buren toppen har ett luftfilter för att skydda möss från utanför föroreningar.
- Upprätthålla de naturliga dygnsrytmen av mössen genom att följa en 12 timmar ljus-mörk-cykel i bostäder anläggningen. Genomföra beteendemässiga tester på samma tid på dagen, helst under djurets mörka cykel, såsom under kvällstimmarna.
Obs: Bör vara försiktig att skilja möss i huset. Olika metoder för särskiljande möss finns tillgängliga, såsom örat stämplingar, öronmärken och svans märkningar.
2. Barnes labyrint test: konstruktion
- Skaffa en cirkulär träskiva som är 120 cm i diameter.
- Skär 20 runda hål (4,5 cm i diameter) runt omkretsen av cirkeln. Placera varje hål för att vara 2,5 cm med labyrint eggen och 13 cm förutom angränsande hål.
- Släta ytor och måla dem glänsande vit (en ljus färg rekommenderas).
- Utse en sida av labyrint styrelsen för insättning av liten kopp krokar ungefär 2-3 cm från varje 20 hål och förlägger två krokar för varje hål (ett på vardera sidan av varje hål).
- Använda grunt svart (plast) diskar för att täcka hål på sidan av labyrint med krokar. Använda krokar för att säkra tjocka gummiband för att hålla diskarna på undersidan av labyrinten.
- Montera säkert Barnes labyrinten 120 cm över marken och bort från andra likaså höga föremål som bord eller stolar. En låda eller pall kan användas för att stödja mitten av labyrinten.
- Placera stora vita affischer med en form på varje vägg (triangel, cirkel och korset) som extra-labyrint ledtrådar på 3 sidor av labyrinten. Upprätthålla affischerna på väggarna runt i labyrinten för varje prövning.
- På sista sidan av labyrint, ställer du in en solid svart gardin att dölja observatörer så att data kan registreras korrekt utan forskarna att vara synlig för möss på labyrinten.
- Avbryta en videokamera över arenan med ett fågelperspektiv av hela labyrinten ytan.
- Ren alla ytor av labyrinten (svart diskar och måltavlan låda ingår) med vatten sedan en 70-procentig etanol lösning före och efter varje mus rättegång.
- Placera en 100 W ljuskälla 25 cm över mitten av labyrint (slå på/av vid start/målgång rättegång) och se till att ha diskar och krokar mot golvet.
Obs: Alla andra overhead lampor i rummet bör vara avstängd under provningen. Tillägg av en ultraljud buller maker hängde bredvid 100 W ljus rekommenderas. Slå den på/av vid start/målgång av varje prövning.
3. Barnes labyrint test: förfarande
Anmärkning: Se till att alla labyrint komponenter rengörs med vatten och 70% etanol lösning före och efter varje prövning, möjliggör tid att torka helt innan du testar meritförteckningar. Vara säker på att ha rengöring leveranser redo liksom timers för prövningar.
- Hus alla möss i grupper medan du använder en pålitlig identifieringsmetod. Hålla möss utanför testning rummet när de inte aktivt körs på labyrinten. Detta är att de inte utsätts för den ultraljud noisemaker förtidigt.
- Hantera möss genom att försiktigt plocka upp och hålla dem från basen av svansen, med tassarna hålls på handen.
- För utbildning, har mössen springa på labyrinten dagligen en gång per dag i 7 dagar i rad för att bedöma lärande/förvärv.
Obs: En enda långsiktig studie kan göras vid en senare tidpunkt att bedöma minne/lagring. Det nuvarande protokollet utbildade unga möss början postnatal dag 32 och en långsiktig studie utfördes på vuxna vid 4 månaders ålder. - Slumpmässigt tilldela varje mus till en målet hål att använda hela testperioden. Hålen kan märkas 1-20 på botten av labyrinten eller på utsidan av labyrint omkretsen, där de inte är synliga för musen i labyrinten.
- Ersätta den tilldela hål disken med en liten svart låda (23 x 11 cm). Sätt fast det Barnes labyrinten med hjälp av gummiband ansluten till närmaste krokar.
Obs: Rutan mål är grunt nog så att musen kan enkelt går ner i det eller innehåller ett steg för att säkerställa att musen inte behöver hoppa ner i den. - Placera muspekaren på mitten av labyrinten under en kopp till acclimate i 30 sekunder tills provningen börjar. Börja spela in video.
- Slå på den lätta och ultraljud noisemaker. Lyfta koppen via en sträng mekanism för att undvika polarisering rubriken inledande av djuret. Starta en timer och sitter bakom ridån att observera.
- När musen kommer in målet hål, täcka hålet med samma ogenomskinliga cup används i början av rättegången eller en pärm och stänga av den ultraljud noisemaker. Om musen inte har angett mål efter 5 minuter har förflutit, corral musen i målet hålet.
- Se till att musen kommer in i hålet. När musen är inne i rutan mål, täcka hålet och stänga noisemaker. Låt musen för att förbli i rutan mål 1 minut ostört.
- Även om målet hålet förblir konstant för varje mus under hela utbildningstiden, köra möss i slumpmässig ordning varje dag för att säkerställa att de inte följer några ledtrådar/dofter kvar av tidigare musen.
4. Barnes labyrint testning: Dataanalys
- Under de Barnes labyrint prövningarna, rekord tidsinställda följande data: total tid spenderas på labyrint, tid för att hitta målet, och ange målet hål om målet är angett.
- Spåra övergripande rörelse av musen för att bestämma antalet fel (antal felaktiga hål utforskade) före och efter målet finns. Också spela in avståndet från målet hål till det första hålet som utforskade (avstånd mäts i antal hål bort), tillsammans med några anmärkningsvärda grooming beteende.
- Spåra förflyttningar av varje djur på ett papper med ett diagram över labyrinten under varje prövning och använda den för att analysera sökstrategier, samt fastställa antalet hål som utforskades i kvadranten mittemot målet. Använd video analys för att bekräfta stigar.
5. damsel-i-nöd testning: konstruera återhållsamhet kammaren
- Skär en tydlig cylinder till en längd som motsvarar ¾ av längden på kvinnliga musen från basen av svansen till topp av näsan. Se till att måtten på cylindern är sådana att musen placeras inuti inte kan vända.
Obs: Vi skär kon slutet av en 50 mL konisk slang ner till göra en 4 cm lång slang för 1-månad-gammal möss och en 8 cm lång tube för 4 månader gamla möss. - Cap båda ändarna på cylindern så att en av locken kan tas bort och anbringas på nytt. 3-4 hål, cirka 0,5 cm vardera, i varje cap. Se till att hålen är tillräckligt stora för att tillåta näsa-röra mellan möss och andning12.
Obs: Alternativt, en enhet för mus återhållsamhet vid blodinsamling kan användas.
6. damsel-i-nöd testning: förbereda arenan
- Säkerställa att arenan är en ogenomskinlig topless plast fyrkantig ruta 38 x 38 cm med 19 cm väggar. Fyll det jämnt med majs sängkläder till en höjd av cirka 2,5 cm.
Obs: Majskolv sängkläder gör gräva händelser lättare att upptäcka. - Avbryta en videokamera över arenan så att helheten av arenan är i sikte.
7. flicka-i-nöd testning: undersökande beteende åtgärd
- Placera stängda och Tom stress kammaren i mitten av arenan.
- Börja inspelning med svävande kameran.
- Välj en manlig mus. Om mössen markeras för identifiering, observera detta mannens identitet. om inte, markera den här musen så att det kan särskiljas efter återkomsten till buren.
- Placera försiktigt manliga musen under en kopp på det nedre vänstra hörnet i arenan. Efter 30 sekunder, ta bort koppen via en sträng mekanism.
- Låt musen för att utforska i 10 min, noga med för att hålla sig borta från dess synfält under inspelning. I slutet av de 10 min, ta bort musen från arena och returnera den till en anläggning bur för nästa 5 min12.
- Stoppa inspelningen och spara videofilen med en lämplig identifierare.
8. damsel-i-nöd testning: Social lyhördhet åtgärd
- Använd samma arena och inspelning setup som i måttet undersökande beteende.
- Välj en kvinnlig mus. Om mössen markeras för identifiering, observera detta kvinnans identitet; om inte, markera den här musen så att det kan särskiljas när det är tillbaka till buren.
Obs: En littermate, Bur mate eller romanen musen kan användas, beroende på forskningsfrågan. Om flera prövningar utförs, upprätthålla typ av relation över alla prövningar. - Hålla kvinnliga musen försiktigt genom basen av svansen eller hals återhållsamhet, vid behov, och sänka den i återhållsamhet kammaren. Nära den öppna änden bakom det och se till att det inte går att vända.
Överväg bittålig handskar, eftersom kvinnliga musen blir resistenta mot att ange återhållsamhet kammaren. - Börja inspelning med svävande kameran.
- Placera fasthållningsanordningen kammaren med fångade kvinnliga musen släpper i mitten av arenan empati och låt honan att acklimatisera i 10 min. Var noga med för att förbli ur honans synfält.
- Efter kvinnliga musen blivit i återhållsamhet kammaren för 5 min, placera markerade manliga musen tillbaka i arenan empati med samma process som innan. Tillåta manliga musen en ytterligare 5 min att utforska arenan, igen ta hand för att förbli ur synfältet av möss.
- Stoppa inspelningen och spara videofilen med en lämplig identifierare.
- I slutet av det 5 min, ta bort både möss från arena och placera dem i sina burar. Ersätta majs sängkläder och sanera både arenan och stress kammare med 70% etanol12.
9. damsel-i-nöd testning: dataanalys
- Spårning programvara kan användas, men videon kan också analyseras manuellt. När videofilen är synliga på datorn, overlay ett öppet blad över skärmen och beskriva kvadraten på arenan med en markör. Dela upp kvadrattal arena i nio lika fack.
- Granska video data för de första 5 min av första förberedande åtgärden. De rekordmånga av fack korsade (motorisk aktivitet/undersökande beteende), tid i stadens fyrkantig arena (öppna fältet aversion) antal gräva och grooming episoder, och många gånger musen rörde återhållsamhet som tom center kammaren.
Obs: Scoring görs inte för de andra 5 min av hanens 10 minuters ursprungliga utforskning, inte heller för 10 min honan är fångade i den centrala kammaren i avsaknad av hanen. - Granska videodata för 5 min social lyhördhet åtgärden omedelbart efter manlign återinförs i arenan med fångade honan. Spela in samma data som för den första förberedande åtgärden, men dessutom registrera antalet gånger manliga musen rörde näsor med fångade kvinnliga musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Barnes labyrinten
För att illustrera hur Barnes labyrinten kan användas, undersökte vi huruvida en enda tidiga etanol exponering orsakade en skillnad i lärande under loppet av mus utveckling. C57Bl6/J möss injicerades antingen med en 2,5 g/kg etanol lösning (n = 8) eller med saltlösning (n = 6) två gånger, två timmars mellanrum, på postnatal dag 6. Vi tränade djuren på Barnes labyrinten under tonåren (P30) och sedan utförs en enda långsiktig studie i vuxen ålder (4 månader). Vår insamlade data kan delas in i flera huvudkategorier: 1) noggrannhet genom tid och fel hastighet, (2) målet posten och 3) mappning prospektering sökvägen.
Noggrannhet av tid och fel:
Mätningar omfattar flera viktiga aspekter: latensen att nå det första hålet (den tid det tar för musen för att undersöka eventuella första hålet efter börjar rättegången) kommer att illustrera om musen är att lära sig att det ska gå att hitta på escape hål ( Figur 1A). Fördröjning att hitta målet hål (poängsätts av en initial sänkning av näsan över ytan av målet hål) är kunna hitta rätt hål (figur 1B). Med varje session, bör tid att köra träningspasset minska, vilket indikerar att djuren lär sig labyrinten.
Antalet fel hål utredningar (kallas fel) musen utför innan att hitta rätta hålet (figur 1 c) anger om djuret är kunna gå relativt rakt till målet fly hål. Det totala antalet gånger en mus utforskar en Felaktiga hål under loppet av studien ger en rudimentär åtgärd av rörelseaktivitet och undersökande beteende. (Figur 1 d). Alla möss utbildades framgångsrikt på Barnes labyrinten över en 7-dagars testperiod under tonåren (representeras här av dagliga sessioner på postnatal dagar 32-39), indikeras av en minskning av felprocenten och tid att hitta målet hål. Det fanns ingen statistisk skillnad i lärande mellan etanol och kontroll djuren under utbildningstiden.
Inträde målsatsen:
Latensen faktiskt ange målet hålet är vanligen används som kriterier för lyckad labyrint slutförandet, men sannolikt ger inte så mycket information som andra aspekter av testning. Inträde i målet kan också räknas som en 0 eller 1. Om musen kommer in målet innan den 5 min förflyta, provning anses framgångsrik, men om musen inte övergår målet, en pärm eller bok bör användas till corral djuret till mål så det upplevelser i kammaren under säkerhet. På de första utbildningsdagar, bör det förväntas att se låga priser träder i målet och djur som tar de hela 5 minuterna på labyrinten. I efterföljande dagar, bör testning ta mindre tid.
Att göra flera fel efter att hitta målet indikerar låg motivation att ange rutan mål och kan även upptäcka onormal komfort med en situation som är vanligtvis aversiva möss (upphöjd plattform, ljusa ljus, öppna fält, ultraljud buller). Stor skillnad mellan fel som gjorts före hitta målet och det totala antalet hål explorations under en rättegång indikerar dålig motivation att ange mål escape kammaren (figur 2A). Om möss inte anger målet fly hål efter upptäckten, kan starkt ljus eller buller läggas till testning situationen som milt skadliga stimuli.
I vårt experiment lades en ultraljud buller utsändare ovan labyrinten på test dag 5 att införa extra motivation för att ange målet. Före införandet av ultraljud buller, hade inga saltlösning behandlade möss någonsin angett målet, men entréer spetsade efter införandet av buller. Betydligt fler möss (saltlösning och etanol kombinerat) anges målet på rättegång 6 jämfört med rättegång 4 (t-test, p = 0,0014) (figur 2B).
Sökvägsmappning:
Mappning av sökvägen till musen kan hjälpa till att bedöma information lagring och inlärningsstrategier, liksom. Avståndet mellan första utforskade hålet och målet hål är en bra indikator på minne för målplatsen, som detta spår där musen går först och hur nära de är att målet (figur 3A). Räkna med denna åtgärd att variera kraftigt i början av utbildningen, men det första hålet som besökte bör närma sig målet som mössen lär målplatsen.
Även om ingen statistisk skillnad i lärande upptäcktes mellan etanol och kontroll djuren under loppet av utbildningen, när dessa möss var åter kör som vuxna använder en enda långsiktiga rättegång (4 månader), hade etanol-injiceras djuren en svårare tid att minnas där målet hål var belägen (figur 3B)12. Denna skillnad i minne lagring hittades inte i det ursprungliga Barnes labyrint utbildning, så använder labyrinten igen vid en senare tidpunkt som tillät oss för att plocka upp subtila skillnader i lärande-minne, som de som finns med en enda utvecklingsmässiga etanol förgiftning händelse. Ett representativt diagram över den Barnes labyrint yta tillåter forskare att mappa musen tog vägen, inklusive antalet fel och ett register över det första hålet besökte (figur 3 c).
Tid i den motsatta kvadranten motsvarar mängden tid en mus utforskar ett avsnitt av labyrinten över andra, speciellt en motsatsen till målet. Det är möjligt för en forskare att erhålla och beräkna alla andra åtgärder som musen kör labyrinten, men denna åtgärd kräver analys vid ett senare tillfälle. En mus som lärande bör minska tid att utforska hål i motsatt kvadrant. På den långsiktiga vuxen rättegång, etanol behandlade möss utforskade betydligt fler hål i motsatt kvadrant från målet, som indikerar ett fel att komma ihåg rätt allmänna rumsliga plats (p = 0,03) (figur 4A).
Det är viktigt att bryta upp denna kartläggning mätningar in fel gjort före och efter att faktiskt hitta målet. Antalet fel innan du hittar målet kan avslöja om lärande sker, men det också kan berätta om musens sökstrategi. Istället för slumpmässigt besöka hål, kan musen anta en strategi för att snabbt hitta målet. Under långsiktig rättegången, alla etanol-behandlade djur används en sekventiell-till-hål-Sök i en ringformad mode tills hålet hittades, medan betydligt mindre saltlösning behandlade möss anställda denna teknik (p = 0,004) (figur 4B och 4 D). Alternativt kan möss rikta en allmänna riktningen av labyrinten (figur 4 c), vilket indikerar att spatial inlärning sker och djuret är sannolikt använder externa ledtrådar till chef för närheten av målet hål.
Dam-i-nöd
Dam-i-nöd arenan uppfördes och används för att testa C57Bl6/J möss undersökande och sociala beteende på båda 1M (n = 15) och 4M (n = 12) ålder. En empati arena utnyttjades där manliga musen placeras i ett hörn (figur 5A). Mus undersökande beteende kvantifieras som antalet rutor korsade i 5 min på den nya arenan. Våra resultat visar att äldre möss (4 månad) korsa mer rutor än yngre möss (1 månad) (p < 0,0001) (figur 5B).
Därefter var fångade honan placerad i en cylinder i mitten av arenan (figur 5A). När honan är fångade i kammaren, kan undersökande beteende igen kvantifieras som antalet rutor korsade. Förekomsten av det fångade kvinnligt påverkar manliga undersökande beteende. Oavsett ålder utforska hanmöss mindre i närvaro av en instängd kvinna. Juvenila hanar utforskade arenan mindre (mätt som antalet rutor korsade i närvaro av en instängd kvinna mus än när enbart (1 månad: t-test, p = 0,001; menar man ensam 46 ± 4,34 rutor jämfört med kvinnliga 26.13 ± 3.42 rutor). Denna skillnad var också uppenbart i vuxna (4 månader: t-test, p < marginal på 0,000001; menar man ensam 151,5 ± 5.31 rutor jämfört med kvinnliga 103,08 ± 0.3.59 rutor) (figur 5B).
Dessutom bör mängden tid en mus i mellersta torget under en 5-minuters-period också bedömas. Tid i centrum torget bör jämföras i närvaro och frånvaro av kvinnliga som ett mått på socialt intresse. Våra resultat visar att män tillbringar mer tid i centrum torget i närvaro av det instängd kvinnligt. Unga män tillbringade mer tid att utforska stadens arena i närvaro av en instängd kvinna mus än när enbart (1 månad: p = 0,05; menar manliga ensam 13,14 ± 2,79 s vs. med kvinnliga 33.42 ± 9,32 s). Denna skillnad sågs också hos vuxna (4 månader: p = 0,001; menar manliga ensam 14,80 ± 1,89 s vs. med kvinnliga 52.87 ± 8,9 s) (figur 5 c).
Forskare bör dessutom också kvantifiera antalet gräva händelser i arenan, vilket kan vara en åtgärd av ångest eller prosocial beteende mot det instängd kvinnligt. Denna åtgärd var betydligt annorlunda i närvaro av kvinnligt för 1 månad (1 M) möss men inte 4 månad (4 M) möss. Unga män tillbringade mer tid att gräva under deras tid i arenan i närvaro av en instängd kvinna mus än när enbart (1 månad: p = 0,027; menar manliga ensam 0.4 ± 0.27 gånger jämfört med kvinnliga 3,2 ± 1,09 gånger). Denna skillnad sågs inte hos vuxna (4 månader: p = 0,65; menar man ensam 1.33 ± 0,54 gånger vs. med kvinnliga 1 ± 0.49 gånger) (figur 5 d).
Antalet gånger som en manlig berör återhållsamhet kammaren som innehåller fångade honan och antalet gånger som djuren rörde näsor genom lufthålen är åtgärder av prosocial beteende. I våra resultat, hanmöss berört röret som innehåller fångade honan betydligt oftare som vuxna (4 månader) än som ungfisk (1 månad) (p = 0,00001; menar 1 månad 4,73 ± 0,95 gånger vs. 4 månader 15.92 1,64 gånger) (figur 5E). Vuxna män även initierat mer instängd kvinnliga kontakt evenemang. Hanmöss berört näsor med fångade honan genom lufthålen betydligt oftare som vuxna (4 månader) än som ungfisk (1 månad) (p = 0,002; menar 1 månad 3,93 ± 1 gånger vs. 4 månader 8.67 ±.94 gånger). (Figur 5F).
Ultraljud inspelningsutrustning användes att lyssna för ultraljud vocalizations över 20 kHz av honmöss, och det användes också lyssna efter ultraljud vocalizations av fångade manliga möss i en ”bachelor-i-nöd” återföring paradigm. Ingen vocalizations upptäcktes i antingen situation som förväntas, eftersom tidigare forskning hittade inga ultraljud vocalizations möss under aversiva stimuli exponering (t.ex. fysiskt begränsande eller elstötar)11.
Figur 1 : Barnes labyrint noggrannhet representativa resultat av tid och fel kurs. Möss injicerades antingen med en 2,5 g/kg etanol lösning eller med koksaltlösning två gånger 2 timmars mellanrum på postnatal dag 6. Vi tränade djur en gång dagligen i 7 dagar under tonåren, sedan utförs en enda långsiktig studie i vuxen ålder11. (A) fördröjning att nå de första hålet (den tid det tar för musen för att undersöka eventuella första hålet efter börjar rättegången) avslöjar om musen är att lära sig hitta fly hålet. (B) fördröjning att hitta målet hål (poängsätts av en initial sänkning av näsan över ytan av målet hål) är kunna hitta rätt hålet. (C) antalet fel hål utredningar (kallas fel) musen gör innan att hitta rätta hålet anger om djuret är kunna gå relativt rakt till målet fly hål. (D), totalen antalet gånger en mus utforskar en Felaktiga hål under loppet av studien ger en rudimentär åtgärd av rörelseaktivitet och undersökande beteende. Felstaplar representera SEM11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Framgångsrika Barnes labyrint slutförande. Latensen faktiskt ange målet hål används ofta som kriterier för lyckad labyrint slutförande, men djuren får inte ange målet hålet efter upptäckt. (A) A stor skillnad mellan fel som begåtts innan hitta målet och det totala antalet hål explorations under en rättegång indikerar dålig motivation att ange mål escape kammaren. I vårt experiment lades ett ultraljud buller på rättegång 5 att inducera möss att ange målet. (B) betydligt fler möss (saltlösning och etanol kombinerat) anges målet på rättegång 6 jämfört med rättegång 4 (t-test, p = 0,0014). Ingen etanol möss höll utforska efter att hitta målet av dag 7. Felstaplar representera SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Barnes labyrint motivation. Mappa musen sökvägar kan ge information om motivation. (A), avståndet mellan det första utforskade hålet och målet hål är en bra indikator på minne för målplatsen, som denna åtgärd spår där musen går först och hur långt de är från målet. (B) även om ingen statistisk skillnad i lärande upptäcktes mellan etanol och kontroll djuren under loppet av utbildningen, när dessa möss var åter kör som vuxna använder en enda långsiktiga rättegång (4 månader), etanol-injiceras djuren hade en svårare tid att minnas där målet hål var belägen. (C), en representativ diagram över den Barnes labyrint yta tillåter forskare att mappa musen tog vägen, inklusive antalet fel och ett register över det första hålet besökte. Den här musen gick raka vägen till målet inom 16 sekunder, men aldrig anges det under loppet av 5 minuter och utforskade 41 hål efteråt. Detta beteende visar låg motivation att ange målet. Felstaplar representera SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Barnes labyrint sökstrategi. Mappa musen sökvägar kan avslöja sökstrategier och ge information om lärande strategi. (A) på den långsiktiga vuxen rättegång, etanol behandlade möss utforskade betydligt fler hål i motsatt kvadrant från målet, som indikerar ett fel att komma ihåg rätt allmänna rumsliga plats (* p = 0,03). (B) under långsiktig rättegången, alla etanol-behandlade djur används en sekventiell-till-hål-Sök i en ringformad mode tills hålet hittades, medan betydligt mindre av saltlösning behandlade möss anställda denna teknik (** p = 0,004) (B D). Rättegången dag 6 resultat är bilden för en (C) saltlösning behandlas mus och (D) etanol behandlas mus. Möss kan rikta en allmänna riktningen av labyrinten (C), vilket indikerar att spatial inlärning sker och djuret är sannolikt använder externa ledtrådar till chef för närheten av målet hål. Quadrant score är oftast mycket bättre för möss använder denna strategi. (D) den sekventiella hål till hål Sök är en ring strategi, där musen går till någon kant av labyrinten och ser i varje hål att hitta målet. Quadrant score är dåliga med stor variation när möss använder strategin ring. Felstaplar representera SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: Dam-i-nöd. (A), Damsel-i-nöd arena är indelad i 9 rutor. Manliga musen placeras i ett hörn och manliga beteende observeras. Kvinnliga musen, instängd i en cylinder behållare, placeras i det centrala torget i arenan. (B) undersökande beteende inom arenan ökar mellan tonåren (1 månad = 1 M) och vuxen ålder (4 månader = 4 M). Övergripande, manliga möss utforskade mindre i närvaro av en instängd kvinna. I tillägg, juvenil möss utforskade mindre än vuxna möss i närvaro av det instängd kvinnligt. (C) Social lyhördhet kan också mätas med den tid som en mus tillbringar i centrum torget där fångade musen hålls. Både unga och vuxna män tillbringade mer tid i centrum torget i närvaro av det instängd kvinnligt. (D) unga män tillbringade mer tid att gräva under deras tid i arenan i närvaro av en instängd kvinna mus än när enbart. (E) hanmöss berört röret som innehåller fångade honan betydligt oftare som vuxna än som ungfisk. (F) vuxna män även initierat mer instängd kvinnliga kontakt händelser än ungfisk. Felstaplar representera SEM (*** p < 0,0001, ** p 0,001, * p 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Barnes labyrinten och dam-i-nöd experimenten är billiga, snabba och relativt enkelt sätt utvärdera spatial inlärning, rörelseaktivitet och prosocial beteendet hos möss. Andra fördelar är avsaknad av overt stressfaktorer, smärta eller mat begränsning för djuret. Som de flesta lärande/minne paradigm är en nackdel med Barnes labyrinten antalet försök som krävs för djuren att lära där målet hål ligger och ange.
Datainsamling:
Data bör samlas konsekvent när observerar musens aktiviteter och beteenden i båda paradigmer. För Barnes labyrinten inkluderar detta inspelning när det första hålet är nådde, antal fel/fel hål det utforskar, tiden då det når målet hål, och den tidpunkt då det träder i målet hål. Forskare bör dessutom mappa sökvägen till varje mus på labyrinten. Data kan spåras med hjälp av en papperskarta av Barnes labyrinten samtidigt som musen kör labyrinten och timing och hål nummer kan bekräftas med hjälp av videofilmer. När spåra djur, kan det vara bra att ändra penna färger en gång varje minut för att hålla koll på potentiellt överlappande hål upptäcktsfärder. Datorstödd tracking system finns för att säkerställa noggrannhet och tillförlitlighet, till exempel idTracker, Ctrax eller tracktor, och några är gratis eller öppen källkod.
För dam-i-nöd analysen, bör registrerade data innehålla hur många rutor hanen kommer in, den tid det tar för manlign för att nå kvinnligt, hur mycket tid som manlign tillbringar i centrum torget när fångade honan är närvarande jämfört med endast tomma cylindern , hur många kontakt händelserna där med cylindern, antalet gånger de djur som rört näsor genom kammaren, och hur många gånger gräva händelser förekom och i mitten är fyrkantiga.
Konstanter i beteendemässiga testning:
Som med alla beteendemässiga tester, är det viktigt att villkor hålls konstant mellan och inom djur prövningar för att säkerställa att miljövariabler inte blanda ihop resultaten av studien. Visuell, auditiv eller lukt stimuli i experimentell miljö kan orsaka beteendeförändringar hos mössen om avsedda eller inte13. Som sådan, bör vara försiktig att skydda mössen från störande yttre stimuli14. Arenan används för dam-i-nöd scenariot såväl Barnes labyrinten bör rengöras efter varje prov med vatten och sanerade med 70% etanol att säkerställa att inga kvardröjande indikatorer av tidigare möss påverkar en senare rättegång. Sängkläder bör dessutom ändras efter varje flicka-i-nöd-analysen. Insamling av uppgifter bör alltid registreras på video att tillåta de praktiker att granska data och säkerställa korrekt analys. Det kan vara en utmaning för forskaren att förbli dold bakom en gardin eller annars utom synhåll samtidigt samla in data, men det är viktigt att upprätthålla en konstant och störningsfri miljö för möss.
Barnes labyrint paradigm design och ändringar:
Det finns flera publicerade paradigm i bruk för Barnes labyrinten. Barnes labyrint utbildning protokoll varierar vanligtvis från 7-15 dagar, men protokollet kan förkortas. Ibland trunkera antalet träningspass att göra lärande uppgiften svårare kan isolera skillnader att längre protokoll missar15. Det kan användas med bara en överljus (som i den ursprungliga Barnes-studien), eller andra element kan läggas (t.ex. ett klarare ljus, en fläkt eller ett ljud) för att göra mössen mer motiverade att ange escape kammare3,16. Om du observerar dålig motivation att ange rutan mål under en pilotstudie, bör tillägg av dessa delar övervägas under själva utbildningen.
Inträde i rätt målet hål kommer sannolikt uppstå mindre snabbt utan dessa element, men forskare bör vara medveten om att dessa tillägg kan vara stress-inducerande stimuli. Närvaron eller frånvaron av aversiva stimuli kan manipuleras för att bedöma motivation att ange målet hål. Vår studie visade att prenatal etanol hade en effekt på sannolikheten att en mus skulle ange escape hålet under utbildningstiden när bara den ljusa ljuset användes, och detta fenomen var åtskild från faktiskt lära sig där målet hål var belägen.
Som sett i dagarna 1-4 av våra protokoll, var mössen inte mycket motiverade att ange hålet, att de tycktes hitta det enkelt nog. När ultraljud buller placerades ovanför labyrinten på dag 5, förbättrades dock poängen på de flesta Barnes åtgärder, inklusive sannolikheten att möss skulle ange målet kammaren efter att hitta den. Buller tycktes dramatiskt minska antalet främmande hål utredningar på rättegång dag 6 och 7, och av dag 7 höll ingen etanol möss att utforska efter att hitta målet (figur 2A). Men det är möjligt att detta är en naturlig följd av lärande labyrinten, gjorde djuren visas mer upprörd efter införandet av ultraljud buller och mindre benägna att utforska labyrinten. För kammaren att förbli en givande situation för mössen, forskarna måste också vara noga med att stänga av de aversiva stimuli (täcka hålet och stänga av buller) och tillåter djuret att förbli ostörd i kammaren för den tilldelade mängden tid för återhämtning innan du tar bort djuret.
Utformningen av Barnes labyrinten kan ha en inverkan på inlärning och minne bedömning. Det nuvarande protokollet använder extra-labyrint ledtrådar. Utöver asymmetrin av testning rummet, var affischer av fyra enkla svart-på-vit-bakgrund former (kvadrat, triangel, cirkel, cross) monterade på väggarna i rummet som visuella ledtrådar. Barnes labyrinten kan lösas med eller utan distala ledtrådar på väggarna i testning rummet eller kan lösas med en seriell sökstrategi. På grund av detta, kan med bara en ”första hål avstånd från målet” mätning missa relevanta skillnader i sättet att musen löser labyrinten och kan inte skilja rumsliga från icke-spatiala förmågor17. Flera åtgärder som analys bör användas, såsom att också undersöka antalet hål som utforskas i motsatt torget eller antalet fel innan målet. Mönstret av sökstrategi kan också analyseras.
Olika inavlade stammar av möss kan ha variabel prestanda på Barnes labyrinten, möjligen på grund av skillnader i synskärpa. Om en stam av möss med dålig synskärpa väljs för användning i Barnes labyrinten, kan tillägg av en liten vägg runt kanten av labyrinten öka thigmotaxis (vägg-kramar beteende) och öka användningen av en icke-visuell sökstrategi. Män hade bättre lärande prestanda än honor i DBA/2J och C3H/HeJ stammar, och även om bara hanar användes i det nuvarande protokollet, C57/Bl6 möss har inte befunnits Visa könsskillnader i minnet den Barnes labyrint18.
Dam-i-nöd paradigm design och ändringar:
För dam-i-nöd experimentet, en stor begränsning är att det finns inget sätt för förberedande musen till gratis kvinnliga musen eller ”damsel”, från röret i mitten av arenan. Omformande kammaren innehåller en release mekanism skulle vara en intressant framtida ändringar. En nackdel med dam-i-nöden är avsaknad av jämförande studier med paradigm, eftersom det är en ny bedömning för att mäta prosocial beteende.
Dam-i-nöd kunde ändras ytterligare för att bedöma sällskaplighet (definierat som lust att spendera tid med en annan mus), preferens för sociala nyhet (lust att undersöka en ny mus jämfört med en bekant mus), parning eller aggressiv beteenden (svällning en kvinna i brunst eller en roman hane i kammaren) och evolutionsbiologi frågor, såsom följderna av delade genetiska bakgrunden på altruistiskt beteende tendenser (svaret på en instängd littermate jämfört med en instängd icke-littermate mus)19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi på Hampden-Sydney College ge bekräftelse och uppskattning till Sean Walden, Zach Leitner, Hunter Lee och Anton Kheirani för deras deltagande i de testprotokoll för Barnes labyrinten och dam-i-nöd experiment. Vi vill också tacka James Foster på Randolph-Macon College för byggandet av Barnes labyrinten och Randolph-Macon College Institutionen för biologi för att tillhandahålla testning utrymme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Damsel-in-Distress | |||
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | Any brand of 50 mL conical tube will work |
| Rubber bands | Sprano Brand | n/a | Size 62, used to keep caps held to plywood |
| hammer | Grainger | 6R252 | Any standard hammer will work |
| nail (size 8D) | Grainger | 4NFE3 | Similarly-sized nails should work just as well |
| opaque, topless plastic box | AcmePlastics | CUT-TO-SIZE-ACRYLIC-CAST-BLACK-SHEET-2025 | Opaque plastic, cut to size (30 cm L x 19 cm W x 3-6 cm H). Step may be added to ensure no more than a 3.5 cm entrance depth for the mouse. |
| video camera (smartphone) | N/A | N/A | Any camera-equipped smartphone will work |
| bite-resistant gloves | Kent Scientific | GLVDYN02 | Any brand offering appropriate protection |
| transparency sheet | Staples | 954145 | Any brand of clear plastic sheet will work, used for scoring |
| Barnes Maze | |||
| Petri Dishes | Corning | 353025 | Spray painted and used as covers for Barnes maze holes |
| Plywood (3/4 in.) | LP Building Products | 22487 | To construct Barnes maze |
| Spray Paint | Krylon | 1274937 | Used to paint petri dish caps black, white paint used to paint plywood |
| Cup Hooks (5/8 in.) | Ace Hardware | 5360615 | 2 used on either side of ventral hole surfaces; Rubber band wraps around hooks to hold cap flat |
| Poster Board | Creatology | n/a | Used at edges of maze as extra cues |
| Light Bulbs | Phillips | n/a | 100W light bulb, used to during the trials |
| Rubber bands | Sprano Brand | n/a | Size 62, used to keep caps held to plywood |
| Ultrasonic noisemaker | Victor mini PestChaser | M753SN | Used as aversive stimuli |
References
- Sunyer, B., Patil, S., Höger, H., Lubec, G. Barnes maze, a useful task to assess spatial reference memory in the mice. Protocol Exchange. 2007, (2016).
- Vorhees, V., Williams, M. T. Assessing Spatial Learning and Memory in Rodents. ILAR Journal. 55 (2), 310-332 (2014).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: A neurophysiological and behavioral study in the rat. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 93 (1), 74-104 (1979).
- Harrison, F. E., Hosseini, A. H., McDonald, M. P. Endogenous anxiety and stress responses in water maze and Barnes maze spatial memory tasks. Behavioural Brain Research. 198 (1), 247-251 (2009).
- Silverman, J. L., Yang, M., Lord, C., Crawley, J. N. Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 490 (2010).
- Bartal, I. B. A., Decety, J., Mason, P. Empathy and pro-social behavior in rats. Science. 334 (6061), 1427-1430 (2011).
- Langford, D. L., et al. Social modulation of pain as evidence for empathy in mice. Science. 312 (5782), 1967-1970 (2006).
- Smith, M. L., Hostetler, C. M., Heinricher, M. M., Ryabinin, A. E. Social transfer of pain in mice. Science Advances. 2 (10), e1600855 (2016).
- Melia, K. R., Ryabinin, A. E., Schroeder, R., Bloom, F. E., Wilson, M. C. Induction and habituation of immediate early gene expression in rat brain by acute and repeated restraint stress. Journal of Neuroscience. 14 (10), 5929-5938 (1994).
- Watanabe, S. Empathy and reversed empathy of stress in mice. Public Library of Science (PloS) One. 6 (8), e23357 (2011).
- Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 46 (1), 28-34 (2007).
- Houlé, K., Abdi, M., Clabough, E. B. D. Acute ethanol exposure during late mouse neurodevelopment results in long term deficits in memory retrieval, but not in social responsiveness. Brain and Behavior. , (2017).
- Sales, G. D., Wilson, K. J., Spencer, K. E., Milligan, S. R. Environmental ultrasound in laboratories and animal houses: A possible cause for concern in the welfare and use of laboratory animals. Laboratory Animals. 22, 369-375 (1988).
- Crabbe, J. C., Walhsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: Interactions with laboratory environment. Science. 248, 1670-1672 (1999).
- Attar, A., Liu, T., Chan, W. T. C., Hayes, J., Nejad, M., Lei, K., Bitan, G. A shortened Barnes maze protocol reveals memory deficits at 4-months of age in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. PloS One. 8 (11), (2013).
- Inman-Wood, S. L., Williams, M. T., Morford, L. L., Vorhees, C. V. Effects of prenatal cocaine on Morris and Barnes maze tests of spatial learning and memory in the offspring of C57BL/6J mice. Neurotoxicology and Teratology. 22 (4), 547-557 (2000).
- Harrison, F. E., Reiserer, R. S., Tomarken, A. J., McDonald, M. P. Spatial and nonspatial escape strategies in the Barnes maze. Learning and Memory. 13 (6), 809-819 (2006).
- O'Leary, T. P., Savoie, V., Brown, R. E. Learning, memory and search strategies of inbred mouse strains with different visual abilities in the Barnes maze. Behavioural Brain Research. 216 (2), 531-542 (2011).
- Kaidanovich-Beilin, O., Lipina, T., Vukobradovic, I., Roder, J., Woodgett, J. R. Assessment of social interaction behaviors. Journal of Visualized Experiments. 48, (2011).
