Analysere rumlige læring og Lis opførsel i mus ved hjælp af Barnes labyrint og jomfru i nød paradigmer

Summary

Denne protokol måler fysisk læring og hukommelse ved hjælp af Barnes labyrint. En roman jomfru i nød paradigme bruges til at vurdere bevægeapparatet aktivitet og Lis opførsel i mus.

Abstract

Barnes labyrinten er en pålidelig måling af rumlige indlæring og hukommelse, der ikke kræver mad begrænsning eller udsættelse for ekstremt stressende stimuli. Barnes labyrint kan også vurdere andre mus adfærd, såsom generelle motivation til at flygte fra labyrinten platform og sonderende adfærd. Barnes labyrint kan måle, om en genetisk mutation eller miljømæssig variable kan påvirke erhvervelse og fastholdelse af rumlige erindringer, samt give oplysninger om den søgestrategi, ansat af mus. Her bruger vi Barnes labyrint for at opdage en hukommelse underskud i voksen mus efter en enkelt udviklingsmæssige ethanol eksponering begivenhed. Den nyligt beskrevne jomfru i nød paradigme udsætter en mandlig mus til en kvindelig mus fanget i et kammer i feltet åben center i arenaen. Det giver mulighed for musen socialt reagere på den fangne kvindelige og udstille Lis adfærd. Jomfru i nød paradigme kan også bruges til at undersøge mus adfærd i en roman arena og foranstaltning bevægeapparatet aktivitet. Både Barnes labyrint og protokollerne jomfru i nød kræver minimal finansielle investeringer og de fleste aspekter af testene kan konstrueres fra fælles lab forsyninger. Disse fleksible og tilgængelige værktøjer kan også bruges til at registrere adfærdsmæssige ændringer i løbet af udvikling.

Introduction

Formålet med denne protokol er at måle rumlige indlæring og hukommelse i mus ved hjælp af Barnes labyrint samt sociale lydhørhed og bevægelse ved hjælp af jomfru i nød paradigme. Almindeligt anvendt fysisk læring og hukommelse test for gnavere omfatter radial arm labyrint, som måler en mus evne til at finde skjulte mad i en arm af en multi-spoked apparater, og Morris vand-labyrint, som lægger en mus i en stor balje eller pulje af vand og vurderer, hvor lang tid det tager for at finde en skjult undersøiske platform. Typisk, uddannelse for disse paradigmer strækker sig over flere forsøg og giver mulighed for måling af både lære erhvervelse priser og lagring gennem kortsigtede og langsigtede hukommelse forsøg.

Selvom radial-arm labyrint og Morris vand labyrint er pålidelige måder at teste hukommelsen hos gnavere, nuværende de komplikationer for nogle forskere. Begge labyrinter bruge afsavn eller stærk afskrækningsmiddel stimuli som forstærkning¹. Radial arm labyrint bruger mad afsavn til at sikre, at gnavere er ordentligt motiveret til at finde en fødevare belønning. I Morris vand labyrint, kan effekter af stress induceret af en tvungen svømmetur ændre resultater i mus².

Barnes labyrinten er en alternativ rumlige bevidsthed opgave, der kræver gnavere at lære placeringen af et hul for at undslippe den lyse, åbne labyrint overflade³. Svage afskrækningsmiddel stimulation (lys eller lyd) er derefter anvendt til at øge sandsynligheden for, at mus vil flygte fra platformen. Barnes labyrint kræver ikke mad afsavn, så mængden af animalsk forberedelse er mindre end i den radiale arm labyrint. Det kan bruges uden konflikt af forskere, der undersøger adfærd eller molekyler knyttet til at spise, hormonelle forordning eller hypothalamus veje.

Barnes labyrinten har også fordele i forhold til Morris vand labyrint. Det er mindre stressende end Morris vand-labyrint, forårsager mindre forhøjede niveauer af corticosterone i mus⁴. Desuden, det er meget enklere at samle og kræver mindre dedikeret plads under test procedure og opbevaring.

Jomfru i nød assay er en simpel to-delt eksperiment, der kan vurdere bevægeapparatet aktivitet efterfulgt af Lis adfærd. Jomfru i nød assay er designet til at vurdere sonderende adfærd og sociale lydhørhed af en mandlig gnaver i svar på en fanget kvindelige gnaver. En almindeligt anvendt metode til at vurdere selskabelighed (samt præference for sociale nyhed) er brugen af Crawleys tre-kammer selskabelighed test, der vurderer det frie valg af en mus til at tilbringe tid i nærheden af eller fra andre mus⁵.

Lig Crawleys tre-kammer selskabelighed test, jomfru i nød analysen også måler frit valg om, hvordan man tilbringe tid i overværelse af en anden mus, men det giver også målinger for dybere aspekter af social funktion: 1) i den Jomfru i nød assay, afholdes der fanget kvindelige musen midt på en åben mark, så den mandlige potentielle aversion mod en åben mark er op mod hans kørsel til socialt udforske eller undersøge en nødlidende kvindelig conspecific. 2) jomfru i nød-modellen giver også en måde at vurdere Lis og empatisk adfærd som reaktion på den fangne mus, der ikke har været hyppigt udforskes i mus.

Animalske empati er absolut observerbare og målelige, men ikke mange paradigmer eksisterer til dette formål. For eksempel i rotter, kan en fanget bur kammerat fremkalde en tilstand af Lis motivation, hvor rotter vil arbejde for at befri de fangne dyr. Faktisk vil rotter vælger at hjælpe de fangne dyr selv før du åbner en lignende beholder indeholdende en chokolade mellemmåltid, så adgang til chokoladen og dele det med den nyligt frigivne rotte⁶.

Foranstaltninger af empati i mus typisk involverer påførelse af smerte; mus, der ser andre mus i smerte er faktisk mere følsomme over for smerte sig^7,8. Tilbageholdenhed stress er karakteriseret fænomen i gnavere og har været koblet med chok at undersøge stress reaktioner, som en foranstaltning af empati i mus^9,10.

Der er etiske overvejelser forbundet med inducerede smerte eller stød, så stress-fremkaldende alternativer er nødvendige. Vi udviklede jomfru i nød paradigme som en foranstaltning af empatisk adfærd i mangel af enten smerte eller chokbehandling. De fangne mus i vores jomfru i nød protokollen viser åbenlys tegn på nød efter kun flere øjeblikke som de er i stand til at vende rundt i den lille beholder, men de er uskadt samtidig give mulighed for andre mus til at reagere på deres nød.

Til at begynde jomfru i nød vurderingen, er en mandlig mus placeret i en stor roman arena indeholder en lille Tom centrale cylinder. Sonderende adfærd registreres i flere minutter, herunder hvor mange dele af arenaen er krydset og hvor meget tid er brugt i det centrale åbne område. Denne metode giver en hurtig og nem måde at udelukke bevægeapparatet underskud som en potentiel confounder i en læring situation, der kræver koordinerede bevægelse for en vellykket gennemførelse. Det giver også et grundlæggende mål for hvor meget aversion mod det åbne center-område er til stede. Begge foranstaltninger kunne påvirke Barnes labyrint ydeevne.

Efter den indledende udforskning, Hannen er fjernet fra arena og en kvindelig musen placeres i en lukket, lille klar centrale cylinder (svarende til, bruges til at indsamle blod fra mus). Derefter, den oprindelige mandlige mus er genindført i arenaen, og sonderende adfærd er igen scorede. Jomfru i nød paradigme vurderer, om en mus er interesseret i en social interaktion baseret på ændringer i adfærdsmønstre, når en fanget kvinde er til stede (scoret af tid tilbragt i den midterste firkant og antallet af grave episoder), og om den musen udstiller Lis adfærd over for den fangne kvindelige (scoret af mængden af cylinder undersøgelser og kontakt begivenheder med den fangne kvindelige). Jomfru i nød analysen kan bruges til at måle en tilbøjelighed til sociale nyhed (svarende til Crawleys tre-kammer selskabelighed test) afhængigt af hvorvidt forskerne fælde en bekendt eller roman mus.

Sammen, Barnes labyrint og jomfru i nød eksperimenter giver mulighed for nøjagtig evaluering af mus indlæring evner og sociale lydhørhed i mangel af ekstremt stressende stimuli. Som med alle adfærdsmæssige assays, skal disse forsøg udføres med stor følsomhed mod den animalske oplevelse, minimere ubehag oplevet af dyret.

Ligesom de fleste labyrinter, kan forskelle i bevægeapparatet aktivitet påvirke ydeevnen på Barnes labyrint, så forskere skal også vurdere bevægeapparatet aktivitet, især når du bruger Barnes labyrint for at vurdere læring i mus med mutationer, der kan forringe bevægelse (såsom dem fundet i Huntington's chorea musemodeller, eller de udsat for giftstoffer, som kan fremkalde hyperaktivitet eller forsinke bevægelse, såsom ethanol). Derudover labyrint og kammer overflader skal rengøres grundigt og sengetøj skiftet mellem hvert dyr at undgå duften cue tilintetgør.

Vigtigere, alle materialer kan være fremstillet på stedet med minimal finansielle investeringer og den lille fysiske fodaftryk af disse assays betyder at disse eksperimenter kan replikeres i næsten enhver indstilling, giver mulighed for stor fleksibilitet. Denne type af tilgængelighed tillader god videnskab skal udføres på mindre institutioner med begrænsede ressourcer eller i situationer hvor pilot data skal indsamles hurtigt i mangel af betydelig støtte.

Protocol

Alle metoder, der beskrives her blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Hampden-Sydney College eller Randolph-Macon College (hvor nogle arbejde blev tidligere udført).

1. grundlæggende boliger af mus

1. Hus mus i plastic bure med solid bund og sider, og et lag af blødt sengetøj og nesting materiale såsom papir neddeling. Bruge sengetøj, som består af strimlet majs kolber eller træspåner, og sikre at strøelse ændres regelmæssigt for sanitet.
2. Giver adgang til mad og vand ad libitum. Toppen af den plast bur huser en mad hopper. Dispensere korrekt formuleret mus mad pellets fra mad hopper og give en vand dispenser. Sikre, at bur top udstyret med et luftfilter for at beskytte mus fra uden for forurenende stoffer.
3. Vedligeholde de naturlige døgnrytme i mus ved at følge et 12-timers lys-mørke cyklus i bolig facilitet. Foretage adfærdsmæssige test på det samme tidspunkt på dagen, ideelt under dyrets mørke cyklus, som i løbet af aftenen.
   Bemærk: Pleje bør tages til at skelne mus i huset. Forskellige metoder for karakteristiske mus er tilgængelige, såsom øre slag, øremærker og hale markeringer.

2. Barnes Maze test: byggeri

1. Få en cirkulær træplade, 120 cm i diameter.
2. Skær 20 cirkulære huller (4,5 cm i diameter) langs omkredsen af cirklen. Placer hvert hul for at være 2,5 cm fra labyrint kant og 13 cm ud over nærliggende huller.
3. Glatte overflader og male dem blank hvid (en lyse farver anbefales).
4. Indstillede én side af labyrinten bestyrelsen for indsættelse af lille kop kroge omkring 2-3 cm fra hvert af de 20 huller og sted to kroge for hvert hul (en på hver side af hvert hul).
5. Bruge lavvandede sort (plast) diske til at dække huller på den side af labyrinten med kroge. Bruge kroge til at sikre tykke elastikker for at holde diske på bunden af labyrinten.
6. Sikkert montere Barnes labyrint 120 cm over jorden og fra andre tilsvarende høje genstande som borde eller stole. En boks eller afføring kan bruges til at støtte i midten af labyrinten.
7. Placer store hvide plakater med en figur på hver væg (trekant, cirkel og cross) som ekstra-labyrint stikord på 3 sider af labyrinten. Vedligeholde plakater på væggene rundt i labyrinten for hvert forsøg.
8. Opret en solid sort gardin skjule observatører, så data kan registreres præcist uden forskerne bliver synlig for mus på labyrinten på sidste side af labyrinten.
9. Suspendere en video kamera over arena med et fugleperspektiv af hele labyrinten overflade.
10. Rengøre enhver overflade af labyrinten (sort diske og Indskyde boks inkluderet) med vand derefter en 70% ethanol løsning før og efter hver mus retssag.
11. Placer en 100 W lyskilde 25 cm over midten af labyrinten (Drej tænd/sluk ved start/slut af retssagen) og sørg for at have diske og kroge står over for sal.
    Bemærk: Alle andre overhead lys i rummet skal være slukket under testen. Tilføjelse af en ultralyd støj maker hang ved siden af 100 W lys anbefales. Slå det tænd/sluk ved start/slut af hvert forsøg.

3. Barnes Maze test: Procedure

Bemærk: Sikre, at alle labyrint komponenter rengøres med vand og 70% ethanol løsning før og efter hvert forsøg, giver mulighed for tid til at tørre helt, før testning CV'er. Være sikker på at have rengøring leverancer klar samt timere for prøver.

1. Parlamentet alle mus i grupper, mens du bruger en pålidelig identifikationsmetode. Holde mus uden for den test værelse, når de ikke kører aktivt på labyrinten. Dette er at sikre, at de ikke udsættes for den ultrasonic noisemaker for tidligt.
2. Håndtere mus ved forsigtigt samle op og holde dem fra bunden af halen, med poterne holdt på ens side.
3. Uddannelse, har mus kører på labyrinten daglige én gang om dagen i 7 dage i træk for at vurdere læring/erhvervelse.
   Bemærk: En enkelt langsigtede retssag kan gøres på et senere tidspunkt at vurdere hukommelse/opbevaring. Den nuværende protokol uddannet unge mus begynder på postnatal dag 32 og en langvarig retssag blev udført i voksne på 4 måneder i alder.
4. Tilfældigt tildele hver mus til en målet hul til at bruge hele testperioden. Hullerne kan mærkes 1-20 på bunden af labyrinten eller på ydersiden af labyrinten omkredsen, hvor de ikke er synlige for musen i labyrinten.
5. Erstatte den tildelte hul disk med en lille sort boks (23 x 11 cm). Fast vedhæfte det til Barnes labyrinten ved hjælp af elastikker forbundet til de nærmeste kroge.
   Bemærk: Den Indskyde boks er lavvandet nok til, at musen kan nemt træder ned i det eller indeholder et skridt for at sikre, at musen ikke skal hoppe ned i det.
6. Placer musen på midten af labyrinten under en kop til at acclimate til 30 sekunder, indtil prøven begynder. Starte videooptagelse.
7. Tænde lys og ultralyd noisemaker. Løfte cup via en streng mekanisme til at undgå at påvirke den første overskrift af dyret. Starter en timer og sidde bag gardinet til at observere.
8. Når musen ind i målet hullet, dække hullet med samme uigennemsigtig cup bruges i begyndelsen af retssagen eller et bindemiddel og slukke den ultrasonic noisemaker. Hvis musen ikke trådt målet efter 5 minutter er gået, corral musen ind i målet hullet.
   1. Sikre musen ind i hullet. Når musen er inde i boksen destination, dække hullet og slukke for noisemaker. Tillad musen til at forblive i den Indskyde boks i 1 minut uforstyrret.
9. Selv om målet hullet vil forblive konstante for hver mus i hele uddannelsesperioden, køre mus i en tilfældig rækkefølge hver dag for at sikre, at de ikke følger nogen stikord/dufte efterladt af tidligere musen.

4. Barnes Maze test: Dataanalyse

1. Ved Barnes labyrint, registrere følgende timet data: samlet tid brugt på labyrinten, tid til at finde mål og tid til at angive målet hul, hvis målet er indsat.
2. Spore den samlede bevægelse af musen til at bestemme antallet af fejl (antal forkerte huller udforsket) før og efter målet er fundet. Også registrere afstanden fra målet hullet til det første hul udforsket (afstand måles i antal huller væk), sammen med nogen bemærkelsesværdige grooming adfærd.
3. Spore bevægelser af hvert dyr på et stykke papir med et diagram af labyrinten under hver retssag og bruge den til at analysere Søg strategier, samt bestemme antallet af huller, der blev undersøgt i kvadrant overfor målet. Brug video analyse til at bekræfte stierne.

5. Frøken-i-nød test: konstruere tilbageholdenhed kammer

1. Skære en klar cylinder til en længde svarende til ¾ af længden af den kvindelige mus fra bunden af halen til spidsen af næsen. Sikre, at dimensionerne af cylinderen, musen placeret inde ikke kan dreje rundt.
   Bemærk: Vi skære kegle slutningen af en 50 mL konisk slange ned for at gøre en 4 cm lang slange for 1 måned gamle mus og en 8 cm lange rør for 4-måned-forhenværende mus.
2. Cap begge ender af cylinderen, sådan, at en af caps kan fjernes og påsættes igen. Punch 3-4 huller, ca 0,5 cm hver, i hver cap. Sikre at hullerne er stor nok til at tillade næse-rørende mellem mus og vejrtrækning¹².
   Bemærk: Alternativt, en anordning til musen tilbageholdenhed under blod samling kan bruges.

6. Frøken-i-nød test: forbereder arenaen

1. Sikre at arenaen er en uigennemsigtig topløs plastik Firkantet kasse med 38 x 38 cm med 19 cm vægge. Fyld det ensartet med majs sengetøj til en højde på ca. 2,5 cm.
   Bemærk: Majskolbe sengetøj gør grave begivenheder lettere at opdage.
2. Suspendere en video kamera over arenaen, således at hele arenaen er i betragtning.

7. Frøken-i-nød test: sonderende adfærd foranstaltning

1. Placere lukkede og Tom stress kammer i midten af arenaen.
2. Begynd optagelsen med den suspenderede kamera.
3. Vælg en mandlig mus. Hvis musene er markeret for identifikation, Bemærk denne mandlige identitet; Hvis ikke, markere denne mus, så den kan adskilles efter hjemkomsten til buret.
4. Anbring forsigtigt den mandlige mus under en kop i nederste venstre hjørne i arenaen. Efter 30 sekunder, fjerne cup via en streng mekanisme.
5. Tillad musen til at udforske i 10 min, at tage sig til at holde sig i dets synsfelt under optagelsen. I slutningen af 10 min, fjerne musen fra arena og returnere det til en bedrift bur for de næste 5 min.¹².
6. Stoppe optagelsen og gemme video-fil med en passende identifikator.

8. Frøken-i-nød test: Social Responsiveness foranstaltning

1. Brug den samme arena og optagelse setup som i den sonderende adfærd foranstaltning.
2. Vælg en kvindelige mus. Hvis musene er markeret for identifikation, Bemærk denne kvindelige identitet; Hvis ikke, markere denne mus, så det kan skelnes, efter det er tilbage til buret.
   Bemærk: En littermate, bur kammerat eller roman mus kan bruges, afhængigt af forskningsspørgsmål. Hvis flere forsøg udføres, opretholde typen relation på tværs af alle forsøg.
3. Hold den kvindelige mus forsigtigt ved bunden af halen eller ved hals tilbageholdenhed, hvis det er nødvendigt, og sænk den til tilbageholdenhed kammer. Lukker den åbne ende bag det og sikre, at det er ude af stand til at vende rundt.
   Bemærk: Overveje iført bid-resistente handsker, som den kvindelige mus vil være modstandsdygtige over for at indtaste tilbageholdenhed kammeret.
4. Begynd optagelsen med den suspenderede kamera.
5. Placer tilbageholdenhed kammer med den fangne kvindelige mus inde i midten af arenaen empati og lad kvinde til at acclimate til 10 min. Sørge for at forblive ud af kvindens synsfelt.
6. Efter den kvindelige mus har været i tilbageholdenhed kammer i 5 min, læg markant mandlige musen tilbage i empati arena ved hjælp af den samme proces som før. Tillade mandlige musen en ekstra 5 min at udforske arena, igen at tage sig til at forblive ud af synsfeltet af mus.
7. Stoppe optagelsen og gemme video-fil med en passende identifikator.
8. I slutningen af 5 min, fjerne begge mus fra arena og placere dem i deres bure. Erstatte majs sengetøj og desinficere både arenaen og stress kammer med 70% ethanol¹².

9. Frøken-i-nød test: analyse af Data

1. Tracking software kan bruges, men videoen kan også analyseres manuelt. Når videofilen er synlig på computeren, overlay en gennemsigtig plade over skærmen og skitsere square Arena ved hjælp af en markør. Divider den arena i ni lige store rum.
2. Gennemgå video data for de første 5 min af den første sonderende foranstaltning. Skal du registrere antallet af rum krydsede (bevægeapparatet aktivitet/sonderende adfærd), tid brugt i center square arena (friland aversion), antallet af grave og grooming episoder og antal gange musen rørt Tom center tilbageholdenhed kammer.
   Bemærk: Scoring er ikke gjort i den anden 5 min af den mandlige 10 minutters indledende udforskning, heller ikke for 10 min hunnen er fanget i den centrale sal i mangel af mandlige.
3. Gennemgå video data for 5 min af social responsiveness foranstaltning, umiddelbart efter mandlige er genindført i arenaen med den fangne kvindelige. Registrerer de samme data, som den første sonderende foranstaltning, men desuden registrere antallet af gange den mandlige mus rørt næser med den fangne kvindelige mus.

Representative Results

Barnes labyrint

For at illustrere, hvordan Barnes labyrint kan bruges, undersøgte vi, om en enkelt tidlig ethanol eksponering forårsaget en forskel i læring i løbet af musen udvikling. C57Bl6/J mus var enten injiceres med en 2,5 g/kg ethanol løsning (n = 8) eller med saltvand (n = 6) to gange, to timer fra hinanden, på postnatal dag 6. Vi trænede dyr på Barnes labyrint i ungdomsårene (P30), derefter udført en enkelt langsigtede retssag i voksenalderen (4 måneder). Vores indsamlede data kan opdeles i flere hovedgrupper: 1) nøjagtighed af tid og fejl, 2) Målet post og 3) kortlægning udforskning sti.

Nøjagtighed af tid og fejl:

Tidsmålinger omfatter flere vigtige aspekter: ventetid til at nå det første hul (den tid det tager for musen til at undersøge enhver første hul efter start forsøget) vil illustrere hvis musen er ved at lære at det er meningen for at gå finde undslippe hul ( Figur 1A). Ventetid til at finde målet hullet (scoret af en indledende sænkning af næsen på tværs af flyet i målet hullet) er i stand til at finde den korrekte hul (figur 1B). Med hver session, bør tid til at køre træningen falde, der angiver, at dyrene læring labyrinten.

Antallet af forkerte hul undersøgelser (benævnte fejl) musen udfører før at finde det rigtige hul (figur 1 c) angiver, om dyret at gå relativt direkte til målet undslippe hul. Det samlede antal gange, en mus udforsker en forkert hul i løbet af retssagen giver en rudimentær foranstaltning af bevægeapparatet aktivitet og sonderende adfærd. (Fig. 1 d). Alle mus blev korrekt uddannet på Barnes labyrint over en 7-dages testperiode i ungdomsårene (repræsenteret her af daglige sessioner på postnatal dage 32-39), angivet ved et fald i fejlprocenten og tid at finde målet hullet. Der var ingen statistisk forskel i læring mellem dyrenes ethanol og kontrol i løbet af uddannelsesperioden.

Posten målbeløbet:

Ventetid til faktisk angiver målet hullet er almindeligt anvendt som kriterium for vellykket labyrint afslutning, men sandsynligvis give ikke så mange oplysninger som andre aspekter af den test. Indrejse i målet scorede også som et 0 eller 1. Hvis musen træder målet før 5 min forløbe, den prøvning anses for vellykket, men hvis musen ikke træder målet, en projektmappe eller bog bør anvendes til at corral dyret ind i målet, så det oplever sikkerhed kammer under. På de første dage, bør det forventes at se lave priser træder i målet og dyr, der tager de fulde 5 minutter på labyrinten. I de efterfølgende dage, bør testning tage mindre tid.

Gør flere fejl efter at finde målet angiver lav motivation til at angive boksen destination og kan også afsløre unormale komfort med en situation, der er typisk afskrækningsmiddel til mus (ophøjet platform, lys, åben lysfelt, ultralyd støj). En stor forskel mellem fejltagelser før at finde målet og det samlede antal hul udforskninger under rettergangen angiver fattige motivationen til at angive mål undslippe kammer (figur 2A). Hvis mus ikke indtaster målet undslippe hul efter opdagelsen, kan lys eller støj føjes til den teste situation som mildt sagt skadelige stimuli.

I vores eksperiment, blev en ultrasonic støj emitter tilføjet over labyrinten test dag 5 at indføre ekstra motivation til at angive destinationen. Forud for indførelsen af den ultrasonic støj, havde ingen saltvand behandlede mus nogensinde indtastet mål, men indgange spiked efter indførelsen af støjen. Betydeligt flere mus (saltvand og ethanol kombineret) angivet målet på retssag 6 i forhold til Trial 4 (t-test, p = 0.0014) (figur 2B).

Stien kortlægning:

Kortlægning stien til musen kan hjælpe med at vurdere oplysninger opbevaring og lære strategier, så godt. Afstanden mellem den første udforskede hul og målet hullet er en god indikator for hukommelse til destinationsplaceringen, som dette spor hvor musen går første og hvor tæt de er på mål (figur 3A). Forventer, at denne foranstaltning til at variere meget i begyndelsen af uddannelsen, men det første hul besøgte bør komme tættere på målet som mus lære destinationsplaceringen.

Selv om ingen statistisk forskel i læring blev fundet mellem dyrenes ethanol og kontrol i løbet af uddannelsesperioden, når disse mus blev igen kører som voksne ved hjælp af en enkelt langsigtede retssag (på 4 måneder), havde ethanol-indsprøjtning dyrene sværere ved at huske, hvor målet hul var placeret (figur 3B)¹². Denne forskel i hukommelse opbevaring blev ikke fundet i den indledende Barnes labyrint uddannelse, ved hjælp af labyrinten igen på et senere tidspunkt gav os mulighed for at afhente subtile forskelle i indlæring/hukommelse, som dem der findes med en enkelt udviklingsmæssige ethanol forgiftning begivenhed. En repræsentativ diagram af Barnes labyrint overflade giver forskere til at knytte stien musen tog, herunder antallet af fejl og et referat af det første hul besøgte (figur 3 c).

Tid brugt i den modsatte kvadrant svarer til den tid en mus udforsker én sektion af labyrinten over andre, specielt den ene modsatte af målet. Det er muligt for en forsker at anskaffe og beregne alle andre foranstaltninger, som musen kører labyrinten, men denne foranstaltning kræver analyse på et senere tidspunkt. En mus, der er ved at lære skal falde tidsforbrug udforske huller i den modsatte kvadrant. På lang sigt voksne retssag, ethanol behandlede mus udforsket betydeligt flere huller i den modsatte kvadrant fra målet, der angiver en fiasko at huske den rette generelle geografiske placering (p = 0,03) (figur 4A).

Det er vigtigt at bryde op denne kortlægning målinger i fejl før og efter rent faktisk at finde målet. Antallet af fejl før at finde målet kan afsløre hvis læring foregår, men det kan også fortælle os om den mus søgestrategi. I stedet for tilfældig besøger huller, kan musen vedtage en strategi for at hurtigt at finde målet. Under de langsigtede retssagen, bruges alle ethanol-behandlede dyr en sekventiel hul til hul søgning i en ring-formet mode indtil hullet blev fundet, mens betydeligt færre saltvand behandlet mus ansat denne teknik (p = 0,004) (figur 4B og 4 D). Alternativt, mus kan målrette en generel ledelse af labyrinten (figur 4 c), som angiver, at fysisk læring sker og dyret sandsynligvis bruger eksterne stikord til hovedet for nærhed af målet hullet.

Jomfru i nød

Jomfru i nød arena blev bygget og brugt til at teste C57Bl6/J mus sonderende og sociale adfærd på begge 1M (n = 15) og 4M (n = 12) af alder. En empati arena blev udnyttet, hvor den mandlige musen placeres i et hjørne (figur 5A). Musen sonderende adfærd er kvantificeret som antallet af firkanter krydsede i 5 min i den nye arena. Vores resultater viser, at ældre mus (4 måneder) krydse flere pladser end yngre mus (1 måned) (Pedersen < 0,0001) (figur 5B).

Næste, den fangne kvinde blev anbragt i en cylinder midt i arena (figur 5A). Når hunnen er fanget i salen, kan sonderende adfærd igen kvantificeres som antallet af firkanter krydsede. Tilstedeværelsen af den fangne kvindelige påvirker mandlige sonderende adfærd. Uanset alder udforske mandlige mus mindre i overværelse af en fanget kvinde. Unge hanner udforsket arena mindre (målt som antallet af firkanter krydsede i en fanget kvindelige mus end når alene (på 1 måned: t-test, p = 0,001; betyde mand alene 46 ± 4.34 firkanter vs med kvindelige 26.13 ± 3.42 firkanter). Denne forskel fremgik også hos voksne (4 måneder: t-test, p < 0.000001; betyde mand alene 151.5 ± 5.31 firkanter vs med kvindelige 103.08 ± 0.3.59 firkanter) (figur 5B).

Desuden skal mængden af tid en mus i den midterste firkant over en 5-minutters periode også vurderes. Tidsforbrug i den midterste firkant skal sammenlignes i tilstedeværelse og fravær af kvindelige som en foranstaltning af samfundsmæssig interesse. Vores resultater viser, at mænd bruger mere tid i den midterste firkant i nærværelse af den fangne kvindelige. Unge hanner brugte mere tid på at udforske centrum af arena i overværelse af en fanget kvindelige mus end når alene (på 1 måned: p = 0,05; betyde mandlige alene 13.14 ± 2,79 s vs med kvindelige 33.42 ± 9.32 s). Denne forskel var også ses hos voksne (4 måneder: p = 0,001; betyde mandlige alene 14,80 ± 1.89 s vs med kvindelige 52.87 ± 8,9 s) (figur 5 c).

Derudover bør forskere også kvantificere antallet af grave arrangementer i arenaen, som kunne være en foranstaltning af angst eller Lis adfærd over for den fangne kvindelige. Denne foranstaltning var væsentligt anderledes i nærværelse af kvindelige for 1 måned (1 M) mus men ikke 4 måned (4 M) mus. Unge hanner brugte mere tid grave i løbet af deres tid i arena i overværelse af en fanget kvindelige mus end når alene (på 1 måned: p = 0,027; betyde mandlige alene 0,4 ± 0,27 gange vs med kvindelige 3,2 ± 1,09 gange). Denne forskel blev ikke set hos voksne (4 måneder: p = 0,65; mener mand alene 1,33 ± 0,54 gange vs. med kvindelige 1 ± 0,49 gange) (fig. 5 d).

Antallet gange en mand rører tilbageholdenhed salen indeholdende den fangne kvindelige og antallet af gange dyrene rørt næser gennem luft huller er foranstaltninger af Lis adfærd. I vores resultater, mandlige mus rørt rør indeholdende den fangne kvindelige betydeligt hyppigere som voksne (4 måneder) end som ungfisk (1 måned) (p = 0.00001; betyde 1 måned 4.73 ± 0,95 gange vs. 4 måneder 15.92 ± 1,64 gange) (figur 5E). Voksne hanner også indledt mere fanget kvindelige kontakt begivenheder. Mandlige mus rørt næser med den fangne kvindelige gennem luft huller betydeligt hyppigere som voksne (4 måneder) end som ungfisk (1 måned) (p = 0,002; betyde 1 måned 3,93 ± 1 gange vs 4 måneder 8,67 ±.94 gange). (Figur 5F).

Ultralyd kontrolapparatet blev brugt til at lytte til ultralyd vocalizations over 20 kHz af kvindelige mus, og det blev også brugt til at lytte til ultralyd vocalizations af fanget mandlige mus i en "bachelor i nød" vending paradigme. Ingen lyde blev opdaget i enten situation, hvilket forventes, da tidligere forskning fandt ingen ultralyd vocalizations mus under afskrækningsmiddel stimuli eksponering (f.eks. fysiske tilbageholdenhed eller elektrisk stød)¹¹.

Figur 1 : Barnes labyrint nøjagtighed repræsentant resultater af tid og fejl. Mus blev enten injiceres med en 2,5 g/kg ethanol løsning eller med saltvand to gange 2 timer fra hinanden på postnatal dag 6. Vi trænede dyr én gang dagligt i 7 dage i løbet af ungdomsårene, så udføres en enkelt langsigtede retssag i voksenalderen¹¹. (A) ventetid til at nå de første hul (den tid det tager for musen til at undersøge enhver første hul efter starter retssagen) afslører, hvis musen er at lære at finde undslippe hul. (B) ventetid til at finde målet hullet (scoret af en indledende sænkning af næsen på tværs af flyet i målet hullet) er i stand til at finde den korrekte hul. (C) antallet forkerte hul undersøgelser (benævnte fejl) musen gør før at finde det rigtige hul angiver, hvis dyret er købedygtig gå relativt direkte til målet undslippe hul. (D) samlet antal gange, en mus udforsker en forkert hul i løbet af retssagen giver en rudimentær foranstaltning af bevægeapparatet aktivitet og sonderende adfærd. Fejllinjer udgør SEM¹¹. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Succesfulde Barnes labyrint afslutning. Ventetid til faktisk angiver målet hullet er almindeligt anvendt som kriterium for vellykket labyrint afslutning, men dyr kan ikke angive målet hullet efter opdagelsen. (A) A store forskel mellem fejl før at finde målet og det samlede antal hul udforskninger under rettergangen angiver fattige motivationen til at angive mål undslippe kammer. I vores eksperiment, blev en ultralyd støj tilføjet på retssag 5 at fremkalde mus til at angive destinationen. (B) betydeligt mere mus (saltvand og ethanol kombineret) angivet målet på retssag 6 i forhold til Trial 4 (t-test, p = 0.0014). Ingen ethanol mus holdt udforske efter at finde målet ved dag 7. Fejllinjer udgør SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Barnes labyrint motivation. Kortlægning mus stier kan give oplysninger om motivation. (A) afstand mellem den første udforskede hul og målet hullet er en god indikator for hukommelse til destinationsplaceringen, som denne foranstaltning spor hvor musen går første og hvor langt de er væk fra målet. (B) selv om ingen statistisk forskel i læring blev fundet mellem dyrenes ethanol og kontrol i løbet af uddannelsesperioden, når disse mus blev igen kører som voksne ved hjælp af en enkelt langsigtede retssag (på 4 måneder), dyrenes ethanol-indsprøjtning havde sværere ved at huske, hvor målet hul var placeret. (C) en repræsentativ diagram af Barnes labyrint overflade giver forskere til at knytte stien musen tog, herunder antallet af fejl og et referat af det første hul besøgte. Denne mus gik direkte til målet inden for 16 sekunder, men aldrig trådte det i løbet af 5 minutter og udforskede 41 huller bagefter. Denne adfærd indikerer lav motivation til at angive destinationen. Fejllinjer udgør SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : Barnes labyrint søgestrategi. Kortlægning mus stier kan afdække Søg strategier og give oplysninger om læring strategi. (A) på den langsigtede voksne retssag, ethanol behandlede mus udforsket betydeligt flere huller i den modsatte kvadrant fra målet, der angiver en fiasko at huske den rette generelle geografiske placering (* p = 0,03). (B) under de langsigtede retssagen, bruges alle ethanol-behandlede dyr en sekventiel hul til hul søgning i en ring-formet mode indtil hullet blev fundet, mens betydeligt færre af saltvand behandlet mus ansat denne teknik (** p = 0,004) (B D). Retssag dag 6 resultater er afbilledet for en (C) saltvand behandlet musen og (D) ethanol behandlet. Mus kan målrette en generel ledelse af labyrinten (C), som angiver, at fysisk læring sker og dyret sandsynligvis bruger eksterne stikord til hovedet for nærhed af målet hullet. Typisk, kvadrant scorer er meget bedre for mus ved hjælp af denne strategi. (D) den sekventielle hul til hul Søg er en ring strategi, hvor musen går til en vilkårlig kant i labyrinten og ser i hvert hul at finde målet. Kvadrant scorer er dårlig med stor variation, når musene bruger ring-strategien. Fejllinjer udgør SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Jomfru i nød. (A) jomfru i nød arena er opdelt i 9 firkanter. Den mandlige mus er placeret i et hjørne og mandlige adfærd er observeret. Den kvindelige mus, fanget i en cylinder container, er placeret i det centrale torv i arenaen. (B) sonderende adfærd inden for arenaen øger mellem ungdomsårene (1 måned = 1 M) og voksenalderen (4 måneder = 4 M). Samlede, mandlige mus udforsket mindre i overværelse af en fanget kvinde. I tilføjelse, juvenil mus udforsket mindre end voksne mus i nærværelse af den fangne kvindelige. (C) Social responsiveness kan også måles ved den tid, en mus bruger i den midterste firkant hvor fanget musen er afholdt. Både unge og voksne hanner brugte mere tid i den midterste firkant i nærværelse af den fangne kvindelige. (D) unge hanner brugte mere tid grave i løbet af deres tid i arena i overværelse af en fanget kvindelige mus end når alene. (E) mandlige mus rørt rør indeholdende den fangne kvindelige betydeligt hyppigere som voksne end som yngel. (F) voksne hanner også indledt mere fanget kvindelige kontakt begivenheder end ungfisk. Fejllinjer udgør SEM (*** p < 0,0001, ** p 0,001, * p 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Barnes labyrint og jomfru i nød eksperimenter er billig, hurtig og relativt nemme måder at evaluere rumlige læring, bevægeapparatet aktivitet og Lis adfærd i mus. Andre fordele omfatter mangel af åbenlys stressfaktorer, smerte eller mad begrænsning for dyret. Ligesom de fleste indlæring/hukommelse paradigmer er en ulempe af Barnes labyrint antallet af forsøg kræves for dyr til at lære, hvor målet hullet er placeret og Indtast.

Dataindsamling:

Data bør indsamles konsekvent, når observere musens aktiviteter og adfærd i begge paradigmer. For Barnes labyrint omfatter dette optagetid første hullet er nået, antallet af fejl/forkert huller det udforsker, den tid hvor det når målet hullet, og det tidspunkt, hvor den træder ind i målet hullet. Derudover bør forskere kort stien til hver musen på labyrinten. Data kan spores ved hjælp af et papirkort over Barnes labyrint på samme tid, at musen kører labyrinten, og timing og hul tal kan bekræftes ved hjælp af video-optagelser. Når sporing af dyret, kan det være nyttigt at ændre pen farver en gang hvert minut for at holde styr på potentielt overlappende hul udforskninger. Computerstøttet tracking systemer er tilgængelige for at sikre nøjagtighed og pålidelighed, som idTracker, Ctrax eller tracktor, og et par er gratis eller open-source.

Til jomfru i nød assay, bør registrerede data omfatte hvor mange pladser mandlige ind, den tid det tager for den mandlige at nå frem til kvindelige, hvor meget tid mandlige anvender i den midterste firkant når den fangne kvindelige er til stede i forhold til kun den tomme cylinder , hvor mange kontakt begivenheder der er med cylinder, antallet af gange dyr rørt næser gennem salen, og hvor mange gange grave begivenheder opstod generelt og i centeret firkant.

Konstanter i adfærdsmæssige test:

Som med alle adfærdsmæssige test, er det kritisk at betingelser holdes konstant mellem og inden for dyre forsøg for at sikre, at miljømæssige variabler ikke forvirre resultaterne af undersøgelsen. Visuel, auditiv eller olfaktoriske stimuli i det eksperimenterende miljø kan forårsage adfærdsmæssige ændringer i mus, uanset om bestemt eller ikke¹³. Som sådan bør pleje tages til skjold mus fra distraherende eksterne stimuli¹⁴. Både arenaen bruges til jomfru i nød scenario og Barnes labyrint skal rengøres efter hver retssag med vand og desinficeres med 70% ethanol til at sikre, at ingen dvælende indikatorer for tidligere mus påvirke en senere retssag. Sengetøj bør desuden ændres efter hvert jomfru i nød assay. Indsamling af data bør altid være optaget på video at tillade eksperimentatorer at gennemgå dataene og sikre præcis analyse. Det kan være en udfordring for forskeren at forblive skjult bag et gardin eller ellers ude af syne samtidig med at indsamle data, men det er vigtigt at opretholde en konstant, distraktion-fri indstilling for mus.

Barnes labyrint paradigme design og ændringer:

Der er flere offentliggjorte paradigmer i brug for Barnes labyrint. Barnes labyrint uddannelse protokoller typisk spænder fra 7-15 dage, men protokollen kan forkortes. Undertiden afkortes antallet af kurser til at gøre læring sværere opgave kan isolere forskelle at længere protokoller gå glip af¹⁵. Det kan bruges med kun en overhead lys (som den oprindelige Barnes undersøgelse), eller andre elementer kan tilføjes (f.eks. en lysere lys, en fan eller en støj) for at gøre mus mere motiverede til at angive escape kammer^3,16. Hvis du observere fattige motivationen til at angive boksen Destination under en pilotundersøgelse, bør tilsætning af disse elementer overvejes under den egentlige træning.

Ibrugtagning korrekt målet hullet vil sandsynligvis forekomme mindre hurtigt uden disse elementer, men forskere bør være klar over, at disse tilføjelser kan være stress-fremkaldende stimuli. Tilstedeværelsen eller fraværet af afskrækningsmiddel stimuli kan manipuleres til at vurdere motivation til at angive målet hullet. Vores undersøgelse viste, at prænatal ethanol havde en effekt på sandsynligheden for, at en mus vil indtaste undslippe hul i uddannelsesperioden når kun den lyse lys blev brugt, og dette fænomen blev adskilt fra faktisk lære hvor målet hullet var placeret.

Som det ses i dage 1-4 af vores protokol, var musene ikke meget motiveret til at komme ind i hullet, selvom de syntes at finde det nemt nok. Dog når den ultrasonic støj var placeret over labyrinten på dag 5, scorer bedre på de fleste Barnes foranstaltninger, herunder sandsynligheden for, at mus vil indtaste mål kammer efter at finde den. Støjen, der syntes at dramatisk reducere antallet af uvedkommende hul undersøgelser på trial dag 6 og 7, og af dag 7 ingen ethanol mus holdt udforske efter at finde målet (figur 2A). Selv om det er muligt, dette er en naturlig konsekvens af at lære labyrinten, dyrene vises mere ophidset efter indførelsen af den ultrasonic støj og mindre tilbøjelige til at udforske labyrinten. I rækkefølge for kammer at forblive en givende situation for musene, skal forskerne også passe slå afskrækningsmiddel stimuli (dække hullet og slukke for larmen) og tillade, at dyr skal forblive uforstyrret i salen for det tildelte antal Recovery tid før fjernelse af dyret.

Design af Barnes labyrint kan have betydning for læring og hukommelse vurdering. Den nuværende protokol bruger ekstra-labyrint stikord. Ud over asymmetrien af test værelse, var plakater af fire enkle sort på hvid baggrund former (square, trekant, cirkel, kryds) monteret på væggene i rummet som visuelle stikord. Barnes labyrint kan løses med eller uden de distale stikord på væggene i den test værelse eller kan løses ved hjælp af et serielt søgestrategi. På grund af dette, kan ved hjælp af kun en "første hul afstand fra målet" måling savne relevante forskelle i den måde, at musen løser labyrinten og kan ikke differentiere rumlige fra ikke-fysisk evner¹⁷. Flere analyse foranstaltninger bør anvendes som også undersøge antallet af huller udforsket i den modsatte square eller antallet af fejl før målet. Mønster af søgestrategi kan også analyseres.

Forskellige indavlede stammer af mus kan har variable præstationer på Barnes labyrint, muligvis på grund af forskelle i synsstyrke. Hvis en stamme af mus med dårlig synsstyrken er valgt til brug i Barnes labyrint, kan tilføjelse af en lille mur omkring kanten af labyrinten øge thigmotaxis (væg-hugging adfærd) og øge brugen af en ikke-visuelle søgestrategi. Mænd havde bedre læring ydeevne end hunner i DBA/2J og C3H/HeJ stammer, og selv om kun hannerne blev brugt i den nuværende protokol, C57/Bl6 mus ikke er blevet konstateret for at vise kønsforskelle i hukommelsen på Barnes labyrint¹⁸.

Jomfru i nød paradigme design og ændringer:

For eksperimentet jomfru i nød er en stor begrænsning, der er ingen måde for sonderende musen at befri den kvindelige mus, eller "Frøken," fra røret i midten af arenaen. Redesigne kammer til at indeholde en mekanisme til frigørelse ville være en interessant fremtidig ændring. En ulempe ved jomfru i nød er fraværet af sammenlignende undersøgelser, paradigme, da det er en ny vurdering for måling af Lis adfærd.

Jomfru i nød kunne blive yderligere ændret for at vurdere selskabelighed (defineret som lyst til at tilbringe tid sammen med en anden mus), præference for sociale nyhed (tilbøjelighed til at undersøge en roman mus sammenlignet med en velkendt mus), parring eller aggressiv adfærd (diffusere en kvinde i estrus eller en roman mand i salen) og evolutionær biologi spørgsmål såsom virkningen af fælles genetiske baggrund på altruistisk adfærd tendenser (svar på en fanget littermate i forhold til en fanget ikke-littermate musen)¹⁹.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Damsel-in-Distress
50 mL conical tube	Fisher Scientific	14-432-22	Any brand of 50 mL conical tube will work
Rubber bands	Sprano Brand	n/a	Size 62, used to keep caps held to plywood
hammer	Grainger	6R252	Any standard hammer will work
nail (size 8D)	Grainger	4NFE3	Similarly-sized nails should work just as well
opaque, topless plastic box	AcmePlastics	CUT-TO-SIZE-ACRYLIC-CAST-BLACK-SHEET-2025	Opaque plastic, cut to size (30 cm L x 19 cm W x 3-6 cm H). Step may be added to ensure no more than a 3.5 cm entrance depth for the mouse.
video camera (smartphone)	N/A	N/A	Any camera-equipped smartphone will work
bite-resistant gloves	Kent Scientific	GLVDYN02	Any brand offering appropriate protection
transparency sheet	Staples	954145	Any brand of clear plastic sheet will work, used for scoring
Barnes Maze
Petri Dishes	Corning	353025	Spray painted and used as covers for Barnes maze holes
Plywood (3/4 in.)	LP Building Products	22487	To construct Barnes maze
Spray Paint	Krylon	1274937	Used to paint petri dish caps black, white paint used to paint plywood
Cup Hooks (5/8 in.)	Ace Hardware	5360615	2 used on either side of ventral hole surfaces; Rubber band wraps around hooks to hold cap flat
Poster Board	Creatology	n/a	Used at edges of maze as extra cues
Light Bulbs	Phillips	n/a	100W light bulb, used to during the trials
Rubber bands	Sprano Brand	n/a	Size 62, used to keep caps held to plywood
Ultrasonic noisemaker	Victor mini PestChaser	M753SN	Used as aversive stimuli