Summary
Этот протокол меры пространственного обучения и памяти с помощью Барнс лабиринт. Роман парадигмы девицы в беде используется для оценки двигательной активности и социальная поведение у мышей.
Abstract
Лабиринт Барнс является надежной мерой пространственного обучения и памяти, которая не требует питания ограничение или воздействия крайне стрессовых раздражителей. Барнс лабиринт может также оценить другие расширения функциональности мыши, таких как общей мотивации, чтобы вырваться из лабиринта платформы и произвольное поведение. Барнс лабиринт может измерять ли генетической мутации или переменной среды может повлиять на приобретение и сохранение пространственных воспоминания, а также предоставить информацию о стратегии поиска, используемых мышей. Здесь мы используем Барнс лабиринт для выявления дефицита памяти в взрослых мышей после воздействия события единого развития этанола. Недавно описан парадигмы девицы в беде предоставляет мужчины мыши женского мышь в ловушке в камере в открытом поле центр арены. Это дает возможность для мыши социально реагировать захваченных женщин и социальная поведение. Девица в беде парадигма также может использоваться для изучения поведения мыши в Роман Арена и мера двигательной активности. Лабиринт Барнс и девицы в беде протоколы требуют минимальных финансовых инвестиций и большинство аспектов тесты могут быть построены от общих поставок лаборатории. Эти гибкие и доступные инструменты могут также использоваться для выявления поведенческих изменений в течение развития.
Introduction
Целью настоящего Протокола является измерение пространственного обучения и памяти у мышей с использованием Барнс лабиринт, а также социальная отзывчивость и передвижения с использованием парадигмы девицы в беде. Часто используемые пространственного обучения и памяти тесты для грызунов включать Радиальный/консольный торцовочный лабиринт, который измеряет способность мыши найти скрытые еду в одной руке со спицами multi аппарата, и Моррис воды лабиринт, который помещает мышь в большой ванне или бассейне воды и Определяет, сколько времени потребовалось, чтобы найти скрытые подводные платформы. Как правило, обучение для эти парадигмы охватывает несколько судебных процессов и позволяет измерение обоих обучения цены приобретения и удержания через краткосрочной и долгосрочной памяти испытаний.
Хотя радиально АРМ лабиринт и Моррис воды лабиринт надежных способов тестирования памяти на грызунах, они представляют собой осложнения для некоторых исследователей. Обе лабиринты использовать лишение или сильной отрицательной стимулы как подкрепление1. Радиальный/консольный торцовочный maze использует лишение пищи обеспечить надлежащим образом мотивированы, чтобы найти пищи награды грызунов. В лабиринте воды Моррис последствия стресса, вызванного вынуждены плавать может изменить результаты в мыши2.
Лабиринт Барнс является альтернативным пространственной осведомленности задача, которая требует грызунов узнать позицию отверстие для того чтобы избежать лабиринт яркие, открытые поверхности3. Слабой отрицательной стимуляции (свет или звук) применяется для повышения вероятности того, что мышь будет бежать от платформы. Барнс лабиринт не требует лишение пищи, поэтому количество животных подготовки меньше, чем в Радиальный/консольный торцовочный лабиринт. Он может использоваться без конфликта исследователи, которые изучают поведение или связанные с еды, гормональной регуляции или каналы гипоталамические молекул.
Барнс лабиринт также имеет преимущества над лабиринтом воды Моррис. Это менее напряженный, чем Моррис воды лабиринт, вызывая менее повышенный уровень кортикостерона в мышей4. Кроме того она гораздо проще собрать и требует меньше выделенного пространства во время процедуры тестирования и хранения.
Девица в беде assay является простой эксперимент двух частей, которые можно оценить двигательной активности, следуют социальная поведение. Девица в беде assay предназначен для оценки произвольного поведения и социальной реакции мужчины грызунов в ответ на зависшие женского грызунов. Часто используемый метод для оценки коммуникабельность (а также предпочтение социальной новизна) является использование Кроули-трехкамерный коммуникабельность теста, который оценивает свободный выбор мыши проводить время вблизи или от других мышей5.
Подобно Кроули-трехкамерный коммуникабельность тест, девицы в беде assay также меры свободный выбор о том, как провести время в присутствии другой мыши, но он также обеспечивает измерения для более глубоких аспектов социального функционирования: 1) в Пробирного девицы в беде, захваченных женщин мыши проводится в центре открытого поля, поэтому мужчины потенциальных отвращение к открытом поле выступают против его диск социально исследовать или расследовать проблемные девушки conspecific. 2 девицы в беде модель также предоставляет способ оценки социальная и чуткими поведение в ответ на ловушку мышь, которая не была изучена часто у мышей.
Животных эмпатии определенно заметных и поддающихся измерению, хотя для этой цели существует не так много парадигм. Например у крыс, захваченных Кейдж Мате может побудить государство социальная мотивации, где крыс будет работать на свободное захваченные животного. В самом деле крысы будет выбрать, чтобы помочь ловушку животных даже перед открытием подобный контейнер, содержащий шоколад закуска, затем доступ шоколад и поделиться им с освобожденным крыса6.
Меры эмпатии в мышей, как правило, включают причинение боли; действительно мышей, которые смотреть другие мышей в боль более чувствительны к боли сами7,8. Сдержанность стресс это явление характеризуется грызунов и сопровождается шоком для изучения реакции стресса, как одной из мер эмпатии в мышей9,10.
Есть этические соображения, связанные с индуцированных боли или шок, поэтому необходимы стресса заставить альтернатив. Мы разработали девицы в беде парадигмы как мера чуткими поведения в отсутствие боли или шоковой терапии. Захваченных мышей в наши девицы в беде протокол признаки явной бедствия после лишь несколько моментов как они не могут развернуться в небольшой контейнер, но они целым и невредимым, обеспечивая возможность для других мышей, чтобы ответить на их бедственном положении.
Чтобы начать оценку девицы в беде, мужчины мыши помещается в большой роман Арена, содержащий небольшой пустой центрального цилиндра. Произвольного поведения, записываются на несколько минут, включая пересекли сколько разделов арены и сколько времени провел в районе центральной открытой. Этот метод обеспечивает быстрый и простой способ исключает двигательного дефицита как потенциальных confounder в ситуации обучения, которая требует скоординированного движения для успешного завершения. Она также обеспечивает основной показатель сколько отвращение в открытом поле центр присутствует. Обе эти меры могут повлиять на производительность лабиринт Барнс.
После первоначального исследования самец удаляется от арены и женского мыши помещается в закрытых, небольшие ясно центрального цилиндра, (аналогичный тому, который используется для сбора крови от мышей). Затем оригинальный мужской мыши вновь на арену, и произвольное поведение снова забил. Девица в беде парадигмы оценивает ли мышь заинтересована в социального взаимодействия на основе изменений в поведенческих моделей, когда женщина ловушке присутствует (забил, время, проведенное в центре площади и количество серий рытье) и является ли мышь экспонатов социальная поведение по отношению к ловушке самка (забил на количество цилиндров расследований и контактных события с захваченных девушки). Девица в беде assay может использоваться для измерения склонность к социальной Новинка (аналогично Кроули-трехкамерный коммуникабельность тест) в зависимости от ли исследователи ловушки мыши знакомые или роман.
Вместе Барнс лабиринт и девицы в беде эксперименты позволяют точной оценки мыши возможности обучения и социальной реакции в отсутствие крайне стрессовых раздражителей. Как и в случае всех поведенческих анализов, эти эксперименты должны быть выполнены с большой чувствительностью к животного опыт, свести к минимуму неудобства, испытываемые животного.
Как большинство лабиринтов различия в двигательной активности могут влиять производительность на лабиринт Барнс, поэтому исследователи также следует оценить двигательной активности, особенно при использовании Барнс лабиринт для оценки обучения у мышей с мутациями, которые могут ухудшить движения (такие, как те нашли в моделях мыши болезни Гентингтона, или тех, кто подвергается токсинов, которые могут вызывать гиперактивность или замедлить движение, например этанола). Кроме того лабиринт и камеры поверхности должны быть тщательно очищены и постельные принадлежности, изменилось между каждое животное, чтобы избежать запах кий путает.
Главное все материалы могут быть изготовлены на месте с минимальными финансовыми инвестициями и физическую компактность этих анализов означает, что эти эксперименты могут быть воспроизведены практически в любых условиях, что позволяет большую гибкость. Этот тип доступности позволяет хорошо науки выполняться в небольших учреждениях с ограниченными ресурсами или в ситуациях, где экспериментальные данные должны быть собраны быстро в отсутствие существенной поддержки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) колледжа Hampden-Сидней или колледж Рэндольф-Макон (где некоторые ранее работ).
1. Основные жилья мышей
- Дом мышей в пластиковые клетки с твердых Боттомс и сторонами и слой мягкой кровати и раскроя материалов, таких как измельчение бумаги. Использовать постельные принадлежности, которая состоит из измельченных кукурузные початки или опилок и убедитесь, что постельное белье меняется регулярно для санитарии.
- Обеспечить доступ к продовольствию и воде ad libitum. В верхней части пластиковый каркас дома пищи бункера. Обойтись должным образом сформулированные мыши питания гранулы из пищи бункера и обеспечивать распределитель воды. Убедитесь, что в клетке верхней имеет воздушный фильтр для защиты мышей от внешних загрязнений.
- Поддерживайте естественный циркадные ритмы мышей, после 12-часовой цикл свето тени в объекте жилищного строительства. Проведение поведенческого тестирования в то же время суток, идеально во время темных цикла животных, таких как в вечерние часы.
Примечание: Следует различать мышей в корпусе. Доступны различные методы для отличительный мышей, такие как ухо штампов, ушные бирки и хвост маркировки.
2. Барнс лабиринт тестирование: строительство
- Получение круговой деревянная доска, которая составляет 120 см в диаметре.
- Вырежьте 20 круглые отверстия (4,5 см в диаметре) по периметру круга. Позиция каждого отверстия 2,5 см от края лабиринт и 13 см отдельно от соседних отверстий.
- Гладкие поверхности и покрасить их глянцевый белый (рекомендуется яркий цвет).
- Назначить одной стороны правления лабиринт для вставки малого Кубка крючки примерно 2-3 см от каждого из 20 отверстий и место двух крючков для каждого отверстия (один на обе стороны каждого отверстия).
- Мелкий черный (пластик) диски используются для покрытия отверстия на стороне лабиринт с крючками. Используйте крючки для фиксации толстые резинки для того чтобы держать диски на нижней части лабиринта.
- Надежно прикрепите Барнс лабиринт 120 см над поверхностью земли и от других аналогичным образом Талль объекты, как таблицы и стулья. Коробки или стула может использоваться для поддержки в середине лабиринта.
- Место большие белые плакаты с одной формы на каждой стене (треугольник, круг и крест) как загородный лабиринт сигналы на 3 сторонах лабиринта. Поддерживать плакаты на стенах вокруг лабиринта для каждого разбирательства.
- На последней стороне лабиринт создать сплошной черный занавес для скрытия наблюдателей, так что данные могут быть записаны точно без исследователи невидимой для мышей на лабиринт.
- Приостановите видео камеры над Арена с птичьего полета на поверхности всего лабиринта.
- Очистите каждый поверхность лабиринта (черный диски и целевой поле включены) с водой затем 70% этанола раствор до и после каждой мыши судебного разбирательства.
- Наведите центр лабиринта (включение/выключение на старт/финиш судебного разбирательства) 100 Вт источник света 25 см и обязательно иметь диски и крючки, сталкивается с пола.
Примечание: Все другие верхний свет в комнате должен быть выключен во время тестирования. Рекомендуется Добавление ультразвуковой шум чайник, висели рядом с 100 W свет. Поверните его включения/выключения на начала и окончания каждого судебного разбирательства.
3. Барнс лабиринт тестирование: процедура
Примечание: Убедитесь, что все компоненты лабиринт убираются с водой и 70% этанола раствор до и после каждого судебного разбирательства, что позволяет время, чтобы полностью высохнуть перед тестированием резюме. Убедитесь, что у очистки готовых медикаментов, а также таймеры для испытаний.
- Дом мышей в группах при использовании метода надежной идентификации. Держите мышей за пределами тестирования номер, когда они не работают активно на лабиринт. Это чтобы убедиться, что они не подвергаются ультразвуковой шумовиком преждевременно.
- Обрабатывать мышей, осторожно подбирая и удерживая их от основания хвоста, с лапы на руку.
- Для обучения, у мышей работать на лабиринт ежедневно раз в день в течение 7 дней подряд, чтобы оценить обучения/приобретения.
Примечание: Единый долгосрочный процесс может быть сделано на более поздний срок для оценки памяти/удержания. Текущий протокол обучение подростков мышей, начало в послеродовой день 32 и долгосрочный судебного разбирательства была исполнена в взрослых в возрасте 4 месяцев. - Случайным образом назначьте каждой мыши целевой отверстие для использования на протяжении всего периода испытаний. Отверстия могут быть помечены 1-20 на нижней части лабиринта или на внешней стороне периметра лабиринт, где они видны не мышь в лабиринте.
- Замените диск назначенные отверстие с небольшой черный ящик (23 x 11 см). Прочно прикрепите к Барнс лабиринт с помощью резиновых полос, подключенных к ближайшей крючки.
Примечание: Поле цель мелкой достаточно так, что мышь можно легко шаг в него или содержит шаг, чтобы обеспечить, что мышь не придется прыгать вниз в нее. - Место мыши на центр лабиринт под чашку, чтобы акклиматизироваться на 30 секунд до начала испытания. Начните запись видео.
- Включите свет и ультразвуковые шумовиком. Поднимите Кубок через механизм строки во избежание смещения начальный заголовок животного. Запустите таймер и сидеть за занавесом соблюдать.
- После того, как указатель мыши входит в цель отверстие, закройте отверстие с же непрозрачный Кубок, используемые в начале судебного разбирательства или связыватель и выключить ультразвуковой шумовиком. Если мышь не вошел целевой после 5 минут прошло, загон мыши в цель отверстие.
- Убедитесь, что указатель мыши входит в отверстие. Когда указатель мыши находится внутри поле цель, закройте отверстие и выключить шумовиком. Позволяет мыши, чтобы оставаться в поле Целевой объект за 1 минуту спокойно.
- Хотя целевой дыра будет оставаться неизменными для каждой мыши на протяжении всего периода обучения, запустите мышей в случайном порядке каждый день чтобы обеспечить, что они не следуют любые сигналы/запахи оставленные предыдущих мыши.
4. Барнс лабиринт тестирования: Анализ данных
- Во время испытаний лабиринт Барнс, записывать следующие приурочен данных: общее время, затраченное на лабиринт, время, чтобы найти цель и время ввести целевой дыра, если цель вводится.
- Отслеживать общее движение мыши, чтобы определить количество ошибок (количество неправильно отверстий исследовал) до и после цели. Также записать расстояние от целевого отверстие в первое отверстие, изучены (расстояние измеряется в количество отверстий в автомобиле), наряду с любой заметной, груминг поведение.
- Отслеживать движения каждого животного на кусок бумаги с диаграммой лабиринта в ходе каждого судебного разбирательства и использовать его для анализа стратегии поиска, а также определить количество отверстий, которые были изучены в квадранте напротив цели. Используйте видео анализ для подтверждения пути.
5. девица в бедствие тестирование: строительство сдержанность камеры
- Вырежьте ясно цилиндр на длину, равную ¾ длины женский мыши от основания хвоста до кончика носа. Убедитесь, что размеры цилиндра таковы, что мыши внутри нельзя повернуть вокруг.
Примечание: Мы вырезать конус конце 50 мл Конические трубки вниз, чтобы сделать трубу длиной 4 см для мышей 1-месяц старый и 8 см длиной трубки для 4-месячного мышей. - Таким образом, чтобы один из шапки можно снять и прикрепить крышку обоих концах цилиндра. 3-4 отверстий, примерно 0,5 см каждый, в каждой крышке. Убедитесь, что отверстия являются достаточно большими, чтобы позволить нос прикосновения между мышами и дыхание12.
Примечание: Кроме того, устройство для мыши сдержанности во время сбора крови может использоваться.
6. девица в бедствие тестирование: подготовка арены
- Убедитесь, что арена является непрозрачным топлесс пластиковый квадрат 38 x 38 см с стены 19 см. Заполните его равномерно с постельным бельем кукурузы на высоту примерно 2,5 см.
Примечание: Постельные принадлежности кочана делает копать события легче обнаружить. - Приостановите видео камеры над Арена, таким образом, чтобы полностью арены в представлении.
7. девица в бедствие тестирование: произвольное поведение мера
- Место закрытой и пустой стресс камеры в центре арены.
- Начало записи с отсрочкой камерой.
- Выберите мужчины мыши. Если мышей, помечаются для идентификации, обратите внимание, этот мужской личности; Если нет, то Марк эта мышь, так что его можно выделить после возвращения к клетке.
- Осторожно поместите мужчины мыши под чашку в левом нижнем углу на арене. После 30 секунд удалите Кубок через механизм строки.
- Позволяет мыши, чтобы исследовать за 10 мин, заботясь, чтобы остаться из ее поля зрения во время записи. В конце 10 мин удалите мышь от арены и вернуть его в клетку Холдинг для следующих 5 мин12.
- Остановить запись и сохранить видео файл с соответствующим идентификатором.
8. девица в бедствие тестирование: социальная отзывчивость мера
- Используйте же Арена и записи установки как мера произвольное поведение.
- Выбор женского мыши. Если мышей, помечаются для идентификации, обратите внимание, эта женщина личность; Если нет, то Марк эта мышь, так что можно выделить, после того, как он возвращается к клетке.
Примечание: Помёте, Кейдж мат или Роман мышь может использоваться, в зависимости от исследования вопрос. Если выполняются несколько испытаний, поддерживать тип отношения через все испытания. - Женский аккуратно возьмите мышь в основание хвоста, или шеи сдержанность, при необходимости и опустить его в камеру сдержанность. Закрыть открытый конец позади него и убедитесь, что он не в состоянии повернуть вокруг.
Примечание: Наденьте укус стойкие перчатки, как женский мышь будет устойчив к поступающего в камеру сдержанность. - Начало записи с отсрочкой камерой.
- Место сдержанности камеры с захваченных женщин мыши внутри в центре арены эмпатии и позволяют девушки, чтобы акклиматизироваться на 10 мин. Позаботьтесь, чтобы оставаться вне поля зрения женского.
- После того, как женщина мышь была в зале сдержанность на 5 мин, место заметное мужчины мыши обратно в Арена эмпатии, используя такой же процесс, как раньше. Разрешить мужчины мыши еще 5 минут для изучения на арене, вновь обращая внимание, чтобы оставаться вне поля зрения мышей.
- Остановить запись и сохранить видео файл с соответствующим идентификатором.
- В конце 5 мин удалите оба мышей от арены и поместите их в их клетках. Заменить постельные принадлежности кукурузы и дезинфицировать Арена и стресс камеры с 70% этанол12.
9. девица в бедствие тестирования: анализ данных
- Отслеживания программного обеспечения могут быть использованы, но видео может быть также анализируется вручную. После того, как видео файл отображается на компьютере, наложение прозрачный лист над экраном и наметить на площади Арена, с помощью маркера. Разделите на площади Арена на девять равных отсеков.
- Просмотрите видео данные за первые 5 мин первоначальные исследовательские меры. Записать количество отсеков пересекли (опорно-двигательной активности произвольного поведения), время, проведенное в центре площади Арена (открытое поле отвращение), количество копать и ухаживание эпизодов, и количество раз, мыши коснулся пустой центр сдержанность камеры.
Примечание: Озвучивание делается не для второй 5 мин мужчин 10 минутах первоначального разведочного, ни за 10 мин самка удерживается в Центральной камере в отсутствие мужчин. - Просмотрите видео данные за 5 мин меру социальной реакции сразу же после того, как самец вновь на арену с захваченных девушки. Запись этих данных как для первоначальной исследовательские меры, но дополнительно записывать количество раз мужчины мыши коснулся носами захваченных женщин мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Лабиринт Барнс
Чтобы проиллюстрировать, как могут быть использованы в лабиринте Барнс, мы исследовали, привело ли единый раннего воздействия этанола разница в обучении в течение развития мыши. C57Bl6/J мышей либо вводили 2,5 мкг/кг этанола раствор (n = 8) или с солевой раствор (n = 6) дважды, два часа друг от друга, в послеродовой период день 6. Мы обучены животных на лабиринт Барнс в подростковом возрасте (P30), а затем выполняется одно долгосрочное испытание в зрелом возрасте (4 месяца). Собранные данные можно разделить на несколько основных категорий: 1) точность времени и ошибок, 2) целевой записи и 3) карт разведки путь.
Погрешность по времени и ошибок:
Время измерения охватывают ряд важных аспектов: задержка достичь в первое отверстие (время, необходимое для мыши расследовать любые первое отверстие после начала судебного разбирательства) будет иллюстрируют если мышь является обучение, что он должен пойти найти отверстие (побег Рисунок 1A). Задержка для поиска целевой отверстие (забил снижая первоначальный носа по всей плоскости целевой дыра) способен найти правильные отверстия (рис. 1B). С каждой сессии следует уменьшить время выполнения учебной сессии, указав, что животные учатся лабиринт.
Количество неправильно отверстие расследований (называют ошибки) мыши выполняет до местонахождения правильные отверстия (рис. 1 c) указывает, является ли животное относительно пойти прямо к целевой побег отверстие. Общее количество раз, мышь исследует неправильный отверстие в течение судебного разбирательства дает элементарные меры двигательной активности и произвольного поведения. (Рис. 1 d). Все мыши успешно прошли на лабиринт Барнс за 7-дневный период тестирования в подростковом возрасте (который здесь представлен ежедневных сеансов на послеродовых дней 32-39), обозначается снижением ошибок и время найти целевой дыра. Нет никакой статистической разницы в обучении между этанола и контроля животных в течение периода обучения.
Целевой показатель вступления:
Задержка на самом деле ввести целевой дыра обычно используется в качестве критериев для завершения успешного лабиринт, но скорее всего не дают столько информации, как другие аспекты тестирования. Вступление в целевой объект также может быть забит как 0 или 1. Если указатель мыши входит цель, прежде чем пройти 5 мин, испытание считается успешным, но если мышь не цель, связыватель или книга должна использоваться для Корраль животное в цель, поэтому он испытывает безопасность камеры под. В первые дни обучения его следует ожидать увидеть низкие темпы вступления в цель и животных, которые принимают все 5 минут на лабиринт. В последующие дни тестирование должно занять меньше времени.
Сделать несколько ошибок после нахождения цели указывает, низкая мотивация ввести поле цель и может также обнаружить аномальные комфорт с ситуацией, которая обычно отрицательной для мышей (повышенных платформа, яркий свет, открытые поля, ультразвуковой шум). Большая разница между ошибки, сделанные до нахождения цели и общее количество отверстие исследования во время судебного разбирательства указывает бедных мотивации, чтобы ввести целевой побега камеры (рис. 2A). Если мышь не вступаем целевой побег отверстие после открытия, яркие огни и шум могут добавляться к тестированию ситуации как мягко вредных раздражителей.
В нашем эксперименте эмитентом ультразвуковой шум был добавлен выше лабиринт тест день 5 ввести дополнительную мотивацию для входа целевой. До введения ультразвуковой шум не физиологическим обработанных мышей когда-либо вступил мишени, но входов, подскочили после введения шум. Значительно больше мышей (солевой раствор и этанола в сочетании) вступил цель Суда 6 по сравнению с 4 суда (t-теста, p = 0,0014) (рис. 2B).
Отображение пути:
Отображение пути мыши может помочь оценить сохранение информации и стратегии, а также обучения. Расстояние между первой разведанные отверстие и отверстие целевой является хорошим индикатором памяти целевые места, как эта треков, где мыши идет первым и как близко они к цели (рис. 3A). Ожидать, что эта мера широко варьируются в начале обучения, но первое отверстие посетил должен приблизиться к цели, как мышей учиться в целевое расположение.
Хотя не статистическая разница в обучении был найден между этанола и контроля животных в течение периода подготовки, когда эти мышей были повторно запустить как взрослые, используя единый процесс долгосрочный (на 4 месяца), вводят этанола животные имели трудное время Вспоминая, где находится целевой дыра (рис. 3B)12. Эта разница в памяти хранения не был найден в первоначальный лабиринт Барнс, обучение, так с помощью лабиринт снова в более позднее время, позволил нам подобрать тонкие различия в обучения и памяти, например с событием интоксикации единого развития этанола. Представитель схема Барнс, лабиринт поверхности позволяет исследователям для сопоставления путь мышь взял, включая количество ошибок и запись первого отверстия посетил (рис. 3 c).
Время, проведенное в противоположных квадранта соответствует количество времени мышь исследует одну часть лабиринта над другими, специально одно противоположное целевого объекта. Это возможно для исследователя для получения и вычисления все другие меры, как мышь работает лабиринта, но эта мера требует анализа в более позднее время. Мыши, который учится следует уменьшить время, проведенное изучение отверстия в противоположных квадранта. На долгосрочный взрослых суда, лечение этанола мышей изучена значительно больше отверстия в противоположных квадранта от цели, указывающее неспособность вспомнить правильный общий пространственное расположение (p = 0,03) (рис. 4A).
Важно разрушить этот сопоставления измерений в ошибки, сделанные до и после на самом деле выяснить цель. Количество ошибок, прежде чем найти цель может выявить если обучение происходит, но он также может рассказать нам о стратегии поиска мыши. Вместо того, чтобы случайно посещения отверстия, мышь может принять стратегию быстро найти цель. Во время долгосрочного суда, все этанола лечить животных используется последовательный поиск отверстие и отверстие в кольцевой моды до тех пор, пока отверстие было найдено, тогда как значительно меньше солевых лечение мышей работает эта техника (p = 0,004) (Рисунок 4B и 4 D). Кроме того мышей можно ориентировать общее направление лабиринт (рис. 4 c), который указывает, что происходит пространственного обучения и животное вероятно использует внешние сигналы для головы для близости целевой дыра.
Девица в беде
Девица в беде Арена была построена и используется для проверки разведочных и социальное поведение мышей C57Bl6/J в обоих 1M (n = 15) и 4M (n = 12) возраста. Эмпатия Арена была использована, где мужчины мыши помещен в углу (Рисунок 5A). Произвольное поведение мыши количественно как количество квадратов, перешли в 5 мин на новой арене. Наши результаты показывают, что старых мышей (4 месяца) крест больше квадратов чем молодых мышей (1 месяц) (p < 0.0001) (Рисунок 5B).
Далее захваченных девушки был помещен в цилиндре в центре арены (Рисунок 5A). После того, как самка удерживается в камере, произвольное поведение может быть квантифицировано снова как количество квадратов пересекли. Присутствие захваченных женщин влияет произвольного поведения мужчин. Независимо от возраста самцов мышей исследовать меньше присутствии женщина ловушке. Несовершеннолетних мужчины исследовал Арена меньше (как измеряется количество квадратов, пересек в присутствии женщина ловушке мыши чем при монотерапии (на 1 месяц: t-теста, p = 0,001; означает мужчины только 46 ± 4.34 квадратов против женщин 26.13 ± 3,42 квадраты). Эта разница также проявилось в взрослых (на 4 месяца: t-теста, p < 0,000001; средний мужчина только 151,5 ± 5.31 квадраты с женской 103.08 ± 0.3.59 квадратов против) (Рисунок 5B).
Кроме того следует также оценить количество времени, мыши провел в середине площади в течение 5 минут. Время, проведенное в центре площади следует сравнить в присутствие и отсутствие женщин как показатель социального интереса. Наши результаты показывают, что мужчины тратят больше времени в центре площади в присутствии девушки ловушке. Несовершеннолетних мужчины тратят больше времени прогулок в центре арены присутствии женщина ловушке мыши чем при монотерапии (на 1 месяц: p = 0,05; означает мужчин только 13,14 ± 2,79 s против с женской 33,42 ± 9.32 s). Эта разница также наблюдаются у взрослых (на 4 месяца: p = 0,001; означает мужчин только 14.80 ± 1,89 s против с женской 52.87 ± 8,9 s) (рис. 5 c).
Кроме того исследователи должны также определить количество копать событий на арене, которая может быть мерой тревоги или социальная поведение по отношению к ловушке девушки. Эта мера значительно отличалась в присутствии девушки на 1 месяц (1 М) мышах, но не 4 месяца (4 М) мышах. Несовершеннолетних мужчины провел больше времени копать во время их на арене присутствии женщина ловушке мыши чем при монотерапии (на 1 месяц: p = 0,027; средний мужской одиночку 0.4 ± 0,27 раз против с женской 3,2 ± 1.09 раз). Эта разница не был замечен в взрослых (на 4 месяца: p = 0,65; означает мужчины только 1.33 ± 0,54 раз против. с женский 1 ± 0,49 раз) (рис. 5 d).
Количество раз, мужчина затрагивает сдержанность камеру, содержащую захваченных девушки и количество животных коснулась носом в воздухе отверстия являются мерами социальная поведения. В наших результатах, самцов мышей коснулся трубки, содержащие захваченные женщины значительно чаще, как взрослые (4 месяца) чем как несовершеннолетних (1 месяц) (p = 0,00001; средний ± 1 месяц 4,73 0,95 против. 4 месяца 15.92 ± 1,64 раза) (Рисунок 5E). Взрослые самцы также инициировала более ловушке женский контакт события. Самцов мышей коснулся носы с захваченных женщин через отверстия воздуха значительно более часто, как взрослые (4 месяца) чем как несовершеннолетних (1 месяц) (p = 0,002; означает 1 месяц 3.93 ± 1 раз против ± 4 месяца 8.67.94 раз). (Рисунок 5F).
Для прослушивания ультразвуковые вокализации выше 20 кГц ультразвуковой записывающее оборудование использовалось самок мышей, и оно также использовалось для прослушивания ультразвуковые вокализации захваченных мышей-самцов в парадигме «бакалавра в дистресс» разворота. Без огласовок были обнаружены в любой ситуации, которая, как ожидается, так как предыдущие исследования нашли не ультразвуковые вокализации мышей при отрицательной стимулы воздействия (например, физического стеснения или электрическим током)11.
Рисунок 1 : Барнс лабиринт точности представитель результаты по времени и ошибок. Мышей либо вводили с этанола раствор 2,5 мкг/кг или физиологического раствора дважды 2 часов в день послеродового 6. Мы обучены животных один раз в сутки, 7 дней в подростковом возрасте, а затем выполняется одно долгосрочное испытание в зрелом возрасте11. (A) задержка достичь Первый показывает отверстие (время, необходимое для мыши расследовать любые первое отверстие после начала судебного разбирательства), если мышь учиться найти дыру побег. (B) задержки для поиска целевой отверстие (забил снижая первоначальный носа по всей плоскости целевой дыра) сможете найти правильный отверстие. (C) количество неправильно отверстие расследований (называют ошибки) мыши делает до нахождения правильного отверстие указывает, является ли животное относительно пойти прямо к целевой побег отверстие. (D) общее количество раз, мышь исследует неправильный отверстие в течение судебного разбирательства дает элементарные меры двигательной активности и произвольного поведения. Планки погрешностей представляют SEM11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Завершение успешного Барнс лабиринт. Задержка на самом деле ввести целевой дыра обычно используется как критерии для завершения успешного лабиринт, но животные не могут вступать в цель отверстие после открытия. (A) A большой разницы между ошибки, сделанные до нахождения цели и общее количество отверстие исследования во время судебного разбирательства указывает на бедных мотивации, чтобы ввести целевой Побег палаты. В нашем эксперименте ультразвуковой шум был добавлен на суде 5 побудить мышей, чтобы ввести целевой. (B) значительно больше мышей (солевой раствор и этанола в сочетании) вступил цель Суда 6 по сравнению с 4 суда (t-теста, p = 0,0014). Не этанола мышей держали изучения после обнаружения цели днем 7. Планки погрешностей представляют SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Барнс лабиринт мотивации. Отображение пути мыши может предоставить информацию о мотивации. (A) расстояние между первой разведанные отверстие и отверстие целевой является хорошим показателем памяти целевые места, как эта мера треков, где мышь идет первым и как далеко они находятся вдали от цели. (B) хотя не статистическая разница в обучении был найден между этанола и контроля животных в течение периода подготовки, когда эти мышей были повторно запустить как взрослые, используя единый процесс долгосрочный (на 4 месяца), вводят этанола животных имел трудное время вспомнить, где находится целевой дыра. (C) A представитель схема Барнс, лабиринт поверхности позволяет исследователям для сопоставления путь мышь взял, включая количество ошибок и запись первого отверстия посетил. Эта мышь пошли прямо к цели 16 секунд, но никогда не вступил он в течение 5 минут и потом изучить 41 отверстия. Это поведение указывает, низкая мотивация ввести целевой объект. Планки погрешностей представляют SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Стратегия поиска Барнс лабиринт. Отображение пути мыши можно выявить стратегии поиска и предоставлять информацию о стратегии обучения. (A) на долгосрочные взрослых суда, лечение этанола мышей изучена значительно больше отверстия в противоположных квадранта от цели, указывающее неспособность вспомнить правильный общий пространственное расположение (* p = 0,03). (B) во время долгосрочного суда, все этанола лечить животных используется последовательный поиск отверстие и отверстие в кольцевой моды до тех пор, пока отверстие было найдено, тогда как значительно меньше физраствора лечение мышей работает эта техника (** p = 0,004) (B D). Испытательный день 6 результаты изображены солевой раствор (C) лечение мыши и мыши этанола лечение (D). Мышь можно ориентировать общее направление лабиринт (C), который указывает, что происходит пространственного обучения и животное вероятно использует внешние сигналы для головы для близости целевой дыра. Как правило квадрант результаты гораздо лучше для мышей, используя эту стратегию. (D) последовательных отверстие в отверстие Поиск — это кольцо стратегия, где идет к любому краю лабиринт мыши и выглядит в каждое отверстие, чтобы найти цель. Квадрант баллы бедных с большой разницей, когда мышь использовать стратегию кольцо. Планки погрешностей представляют SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Девицы в беде. (A) девицы в беде Арена делится на 9 квадратов. Мужчины мыши помещен в углу, и наблюдается поведения мужчин. Женского мыши, захваченных в контейнере цилиндр помещается на центральной площади арены. (B) произвольное поведение в рамках Арена увеличивает между подросткового возраста (1 месяц = 1 М) и зрелом возрасте (4 месяца = 4 М). В целом, мужской мышей изучена меньше присутствии женщина ловушке. В дополнение, несовершеннолетних мышей изучена меньше взрослых мышей в присутствии девушки ловушке. (C) социальная отзывчивость также может измеряться по времени, затрачиваемого мыши в центре площади, где проводится ловушку мыши. Несовершеннолетних и взрослых самцов провел больше времени в центре площади в присутствии девушки ловушке. (D) несовершеннолетних мужчины провел больше времени копать во время их на арене присутствии женщина ловушке мыши чем, когда в одиночку. (E) мышей-самцов коснулся трубка, содержащая захваченных женщины значительно чаще, как взрослых, чем как несовершеннолетних. (F) взрослые самцы также инициировала более ловушке женский контакт событий, чем несовершеннолетних. Планки погрешностей представляют SEM (*** p < 0,0001, ** p 0,001, * p 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Лабиринт Барнс и девицы в беде экспериментов являются недорогой, быстрый и относительно легко способы оценки пространственного обучения, двигательной активности и социальная поведение у мышей. Другие преимущества включают в себя отсутствие явной стресс, боль или ограничение питания для животного. Как большинство парадигмы обучения и памяти недостатком лабиринт Барнс является количество судебных процессов, необходимых для животных, чтобы узнать, где находится целевой дыра и войти.
Сбор данных:
Должны быть последовательно сбор данных при наблюдении мыши деятельности и поведения в обеих парадигм. Для Барнс лабиринт это включает в себя время, первое отверстие достигается, количество ошибок/неверно отверстий, которые он исследует, то время, когда он достигает целевой дыра и время, на котором он входит в отверстие целевой записи. Кроме того исследователи должны карта путь каждой мыши лабиринт. Данные могут быть отслежены с помощью бумажную карту Барнс лабиринта в то же время, что мышь работает лабиринт, и числа сроков и отверстие может быть подтверждено с помощью видео. При отслеживании животного, это может быть полезно изменить цвета пера каждую минуту для отслеживания потенциально перекрывающихся отверстие исследования. Систем автоматизированного отслеживания доступны для обеспечения точности и надежности, например idTracker, Ctrax или tracktor, и несколько бесплатных или открытым исходным кодом.
Для assay девицы в беде записанные данные должны включать сколько квадратов, самец входит, время, необходимое для мужчин, чтобы добраться до девушки, сколько времени мужчина проводит в центре площади, когда девушки ловушке присутствует по сравнению с только пустой баллон , сколько контактных происходящие там события с цилиндром, число раз, животных коснулся носы через камеры, и сколько раз рытье события произошли в целом и в центре площади.
Константы в поведенческих тестирования:
Как с всеми поведенческие тесты, важно, что условия являются неизменным между и внутри животных испытания, чтобы обеспечить, что переменные среды не смешивать результаты исследования. Визуальные, слуховые или обонятельные стимулы в экспериментальной среде может вызвать изменения в поведении в мышей, намеревается ли или не13. Таким образом следует позаботиться о том, чтобы оградить мышей от отвлекающих внешние раздражители14. Арена используется для сценария, девицы в беде и лабиринт Барнс должен быть очищен после каждого судебного разбирательства с водой и продезинфицировать с 70% этанола для обеспечения, что сохраняющиеся показатели предыдущих мышей не влияют пробу позднее. Кроме того постельные принадлежности должны быть изменены после калибровочных девицы в беде. Сбор данных всегда должны быть записаны на видео, чтобы позволить экспериментаторов для рассмотрения данных и обеспечения точного анализа. Это может быть проблемой для исследователя оставаться скрытым за занавеской или иначе из виду во время сбора данных, но это важно для поддержания постоянной, отвлечение свободной обстановке для мышей.
Барнс лабиринт парадигма проектирования и изменения:
Есть несколько опубликованных парадигмы в использовании для Барнс лабиринт. Барнс лабиринт подготовки протоколов обычно колеблется от 7-15 дней, но протокол может быть сокращен. Иногда усечение количество учебных занятий, чтобы сделать обучение задачи сложнее можно изолировать различия, что больше протоколов Мисс15. Он может использоваться с только накладные света (как и оригинальные исследования Барнс), или другие элементы могут быть добавлены (например, яркий свет, Вентилятор или шум) для того, чтобы сделать мышей более мотивированы, чтобы войти в Побег палаты3,16. Если вы наблюдаете бедных мотивации, чтобы ввести поле цель во время экспериментального исследования, добавление этих элементов следует рассматривать во время фактического обучения.
Вход в отверстие правильную цель скорее всего будет менее быстро происходят без этих элементов, но исследователи должны осознавать, что эти дополнения могут быть стресса заставить раздражителей. Наличие или отсутствие отрицательной стимулов можно манипулировать для оценки мотивации войти в цель отверстие. Наши исследования показали, что что пренатальная этанол имел влияние на вероятность того, что мышь вступит побег отверстие когда использовался только яркий свет, и это явление отличается от фактически обучения, где находится целевой дыра в период обучения.
Как видно в 1-4 дней нашего протокола, мышей не были очень мотивированы, чтобы войти в отверстие, хотя они, как представляется, достаточно легко найти ее. Однако когда ультразвуковой шум был помещен над лабиринт на 5 день, результаты улучшилось на большинстве Барнс мер, включая вероятность того, что мышей ввести целевые камеры после нахождения его. Шум, как представляется, резко сократить количество посторонних отверстие расследований на суде день 6 и 7, и на 7 день не этанола мышей держали изучения после нахождения цели (рисунок 2A). Хотя это возможно, это является естественным следствием обучения, лабиринт, животных представляется более взволнован после введения ультразвуковой шум и менее вероятно исследовать лабиринт. Чтобы Палата оставаться полезным положение для мышей, исследователи также должны быть осторожны выключить отрицательной раздражителей (Закройте отверстие и выключить шум) и позволяют животному остаются нетронутыми в камере за отведенное количество время восстановления перед удалением животного.
Дизайн Барнс лабиринт может иметь влияние на обучение и оценки памяти. Текущий протокол использует сигналы загородный лабиринт. В дополнение к асимметрии тестирование номер плакаты четырех простых форм черный на белом фоне (квадрат, треугольник, круг, крест) были установлены на стенах комнаты как визуальные подсказки. Барнс лабиринт может быть решена с или без дистальной сигналы на стенах тестирования номер или может быть решена с помощью последовательного поиска стратегии. Вследствие этого используя только «сначала отверстия расстояние от цели» измерения может пропустить соответствующие различия в способе решает лабиринт и не могут дифференцировать пространственных-пространственные способности17мыши. Следует использовать несколько анализа мер, например также изучает количество отверстий в напротив площади или количество ошибок перед целевым объектом. Шаблон поиска стратегии также могут быть проанализированы.
Различных штаммов инбредных мышей может иметь переменную производительность на лабиринт Барнс, возможно из-за различия в остроты. Если штамм мышей с плохой остроты выбирается для использования в лабиринте Барнс, добавлением небольших стены вокруг края лабиринта могут увеличить thigmotaxis (стены обнимать поведение) и увеличить использование невизуального поиска стратегии. Мужчины были лучше обучения производительность чем самки DBA/2J и C3H/HeJ штаммов, и хотя только мужчины были использованы в текущем протоколе, мышей C57/Bl6 не были найдены для отображения гендерные различия в память на лабиринт Барнс18.
Девица в беде парадигма проектирования и изменения:
Для эксперимента, девицы в беде основным ограничением является что нет никакого способа для произвольного мыши освободить женщин мыши, или «девицу,» из пробирки в центре арены. Реорганизации камеры содержать механизм бы интересных изменений в будущем. Недостатком девицы в беде является отсутствие сравнительных исследований с использованием парадигмы, как она является новой оценки для измерения социальная поведение.
Девица в беде можно дальнейшее изменение оценки коммуникабельность (определяемой как склонность тратить время с другой мыши), предпочтение социальной Новинка (наклонение расследовать Роман мыши, по сравнению с знакомой мышью), спаривания или агрессивным поведения (треппинг женщина в эструса или Роман мужчины в камере) и эволюционной биологии вопросы, как влияние общий генетический фон на альтруистическое поведение тенденции (ответ на захваченных помёте, по сравнению с захваченных не помёте мышь)19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы в колледже Хэмпден-Сидней дать признание и благодарность Шон Walden, Зак Leitner, Хантер ли и Антон Kheirani за их участие в тестировании протоколы для Барнс лабиринт и девицы в беде экспериментов. Мы также хотели бы поблагодарить Джеймс Фостер в колледж Рэндольф-Макон для строительства лабиринт Барнс и Рэндольф-Макон колледж Департамента биологии для предоставления тестирования пространства.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Damsel-in-Distress | |||
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | Any brand of 50 mL conical tube will work |
| Rubber bands | Sprano Brand | n/a | Size 62, used to keep caps held to plywood |
| hammer | Grainger | 6R252 | Any standard hammer will work |
| nail (size 8D) | Grainger | 4NFE3 | Similarly-sized nails should work just as well |
| opaque, topless plastic box | AcmePlastics | CUT-TO-SIZE-ACRYLIC-CAST-BLACK-SHEET-2025 | Opaque plastic, cut to size (30 cm L x 19 cm W x 3-6 cm H). Step may be added to ensure no more than a 3.5 cm entrance depth for the mouse. |
| video camera (smartphone) | N/A | N/A | Any camera-equipped smartphone will work |
| bite-resistant gloves | Kent Scientific | GLVDYN02 | Any brand offering appropriate protection |
| transparency sheet | Staples | 954145 | Any brand of clear plastic sheet will work, used for scoring |
| Barnes Maze | |||
| Petri Dishes | Corning | 353025 | Spray painted and used as covers for Barnes maze holes |
| Plywood (3/4 in.) | LP Building Products | 22487 | To construct Barnes maze |
| Spray Paint | Krylon | 1274937 | Used to paint petri dish caps black, white paint used to paint plywood |
| Cup Hooks (5/8 in.) | Ace Hardware | 5360615 | 2 used on either side of ventral hole surfaces; Rubber band wraps around hooks to hold cap flat |
| Poster Board | Creatology | n/a | Used at edges of maze as extra cues |
| Light Bulbs | Phillips | n/a | 100W light bulb, used to during the trials |
| Rubber bands | Sprano Brand | n/a | Size 62, used to keep caps held to plywood |
| Ultrasonic noisemaker | Victor mini PestChaser | M753SN | Used as aversive stimuli |
References
- Sunyer, B., Patil, S., Höger, H., Lubec, G. Barnes maze, a useful task to assess spatial reference memory in the mice. Protocol Exchange. 2007, (2016).
- Vorhees, V., Williams, M. T. Assessing Spatial Learning and Memory in Rodents. ILAR Journal. 55 (2), 310-332 (2014).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: A neurophysiological and behavioral study in the rat. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 93 (1), 74-104 (1979).
- Harrison, F. E., Hosseini, A. H., McDonald, M. P. Endogenous anxiety and stress responses in water maze and Barnes maze spatial memory tasks. Behavioural Brain Research. 198 (1), 247-251 (2009).
- Silverman, J. L., Yang, M., Lord, C., Crawley, J. N. Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 490 (2010).
- Bartal, I. B. A., Decety, J., Mason, P. Empathy and pro-social behavior in rats. Science. 334 (6061), 1427-1430 (2011).
- Langford, D. L., et al. Social modulation of pain as evidence for empathy in mice. Science. 312 (5782), 1967-1970 (2006).
- Smith, M. L., Hostetler, C. M., Heinricher, M. M., Ryabinin, A. E.
- Melia, K. R., Ryabinin, A. E., Schroeder, R., Bloom, F. E., Wilson, M. C. Induction and habituation of immediate early gene expression in rat brain by acute and repeated restraint stress. Journal of Neuroscience. 14 (10), 5929-5938 (1994).
- Watanabe, S. Empathy and reversed empathy of stress in mice. Public Library of Science (PloS) One. 6 (8), e23357 (2011).
- Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 46 (1), 28-34 (2007).
- Houlé, K., Abdi, M., Clabough, E. B. D. Acute ethanol exposure during late mouse neurodevelopment results in long term deficits in memory retrieval, but not in social responsiveness. Brain and Behavior. , (2017).
- Sales, G. D., Wilson, K. J., Spencer, K. E., Milligan, S. R. Environmental ultrasound in laboratories and animal houses: A possible cause for concern in the welfare and use of laboratory animals. Laboratory Animals. 22, 369-375 (1988).
- Crabbe, J. C., Walhsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: Interactions with laboratory environment. Science. 248, 1670-1672 (1999).
- Attar, A., Liu, T., Chan, W. T. C., Hayes, J., Nejad, M., Lei, K., Bitan, G. A shortened Barnes maze protocol reveals memory deficits at 4-months of age in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. PloS One. 8 (11), (2013).
- Inman-Wood, S. L., Williams, M. T., Morford, L. L., Vorhees, C. V. Effects of prenatal cocaine on Morris and Barnes maze tests of spatial learning and memory in the offspring of C57BL/6J mice. Neurotoxicology and Teratology. 22 (4), 547-557 (2000).
- Harrison, F. E., Reiserer, R. S., Tomarken, A. J., McDonald, M. P. Spatial and nonspatial escape strategies in the Barnes maze. Learning and Memory. 13 (6), 809-819 (2006).
- O'Leary, T. P., Savoie, V., Brown, R. E. Learning, memory and search strategies of inbred mouse strains with different visual abilities in the Barnes maze. Behavioural Brain Research. 216 (2), 531-542 (2011).
- Kaidanovich-Beilin, O., Lipina, T., Vukobradovic, I., Roder, J., Woodgett, J. R. Assessment of social interaction behaviors. Journal of Visualized Experiments. 48, (2011).
