Summary
目前的议定书包括了一个分类和清洁秀丽线虫年龄匹配种群的方法。它使用一个简单, 廉价, 高效的定制工具, 以获得大量的实验种群的线虫进行研究。
Abstract
秀丽线虫(C. 线虫) 是一种在一系列基础和生物医学研究中使用的成熟的模型有机体。在线虫研究社区内, 需要一种负担得起和有效的方法来维持大型、年龄匹配的线虫种群。在这里, 我们提出了机械分拣和清洁线虫的方法。我们的目标是提供一个经济高效, 高效, 快速, 简单的过程, 以获得相同大小和生命阶段的动物在实验中使用。这个工具,秀丽筛, 使用一个定制的盖子系统, 线程到普通锥形实验室管和排序C. 线虫的基础上的体型。我们还证明,秀丽筛有效地转移动物从一个文化板块到另一个允许快速排序, 同步和清洁, 而不影响健康标志, 包括运动和应力诱导基因记者。这种易于使用和创新的工具是一种快速、高效和无压力的选项, 用于维护C. 线虫种群。
Introduction
线虫蠕虫,秀丽线虫, 是一个首要的模型有机体。除了他们在实验室里培养的直接和受控性质外, 他们的整个基因组都是1序列, 每个细胞的发育命运都是2。由于这些特点,线虫是一种广泛使用的模型有机体的遗传学研究。然而, 随着这些有益特征的出现, 研究者们面临着一些挑战。由于它们的快速生成时间,线虫种群可以迅速耗尽食物和/或成为混合种群的多个世代和发展阶段出现一次。因此, 在固体线虫生长培养基 (NGM) 上进行的实验要求研究人员在细菌性食物来源耗尽和新幼虫发育之前, 将动物物理地移到新鲜的盘子里。这可能是单调乏味的, 因为需要经常转移动物, 以防止实验种群与后代混合。尽管如此, 一些实验需要大量的动物和延长的时间点 (例如, 在成年时期的 DNA 或 RNA 提取)。这就加剧了精确维持同步种群和转移大量动物的挑战。
目前在 NGM 上养殖线虫的方法是将动物从盘子中采摘或洗涤成盘子;化学处理动物 (例如, 与 DNA 复制抑制剂 fluorodeoxyuridine 或 FUDR);或者使用流式细胞仪对多井板中的动物进行排序。采摘涉及使用一个手工具, 用薄白金线或睫毛, 手动转移个人或多个动物3,4。这种方法是准确的, 但需要的技能和时间, 是一个限制的研究涉及大量的动物。采摘也可能对动物造成身体伤害和压力, 可能会使个体受到不自然和不一致的干扰和强迫。洗涤包括用缓冲液冲洗培养皿, 通过玻璃巴斯德吸管将溶液与动物转移到一个新的培养板上。该方法速度快, 效率高, 但不准确, 因为多代和动物发育阶段大量转移。化学处理, 如 FUDR, 可以溶解在培养基中, 以防止后代的生产通过阻断任何 DNA 复制, 从而, 配子生产和卵子的发展。这种方法虽然有效, 但必须在发育成熟后应用, 以不扰乱正常的发育过程, 这意味着在其管理3之前仍然需要转移动物。这种方法还会影响多细胞信号通路, 对动物的年龄产生明显的影响 (例如, 延长寿命或改变 proteostasis), 这取决于使用5的线虫的应变, 6,7,8,9,10。流式细胞术方法将单个的线虫从一个多井板块自动分类转移到另外11。虽然这种方法是非常有效和有效的, 流式细胞术设备是令人望而却步的昂贵和无法进入的许多研究人员。另一种转移动物的方法是使用温度敏感的突变模型, 如fer-15和fem-1, 当温度调整12时, 它们变得不育。虽然使用变种动物在某些情况下是有用的, 这些特定菌株的增长速度比野生型动物慢, 它们依赖于改变的基因组, 作为衰老或健康蠕虫的不良代表。此外, 依赖温度转移诱导不孕也导致没有一个静态环境, 和温度变化已经很容易地显示影响基因表达13,14, 15. 研究小组以前发表过一些技术, 描述使用网格筛选C. 线虫的大小为16。但是, 我们无法找到以前的工作测试, 以了解与使用此类过滤器有关的总体健康结果的任何变化。
因此, 在C. 线虫研究社区中需要一种负担得起的、高效的、快速的、准确的方法, 在培养皿之间转移大量的动物。我们开发了一种改进的、可访问的设备 (命名为秀丽筛), 并为其制造和操作提供了相关的协议, 以满足C. 线虫研究社区的需要。在此, 我们分享秀丽筛的设计和使用方法, 我们证明, 它的使用不影响共同的健康或任何压力标记相比, 标准手工采摘和治疗与常用的,限制生育的化学 FUDR。
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Protocol
1.秀丽筛的施工与使用
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施工协议
- 从50毫升圆锥管获得2盖子 (图 1A)。
- 使用本生燃烧器和热金属探针或烙铁或阶梯钻头, 从底部的内唇中取出中心区域 (当从底端看图 1B)。
注: 使用热切割塑料盖子是最好的刀片, 因为有更少的伤害风险。 - 用弯曲的文件或旋转研磨工具 (如Dremel) 清洁和打磨切割的边缘和表面。见图 1C。
- 将单丝网格的圆切到适当的直径 (图 1D)。为此, 在一条单丝尼龙网板上跟踪一个盖子, 并在绘制的线内切割。
- 当胶水应用于塑料时, 将凹槽/斜线插入盖子的顶面, 以增强两个盖子的附着力 (图 1E)。
- 用乙醇清洁盖子, 让它们干。
- 将氰胶水涂在两个盖子的顶面, 保持到外边缘。
注意: 小胶水有很长的路要走。 - 根据表 1, 将单丝网格放在一个胶合盖子上 (图 1F)。将第二盖子倒在网格的顶部;两个盖子必须有他们的顶端在一起。紧紧地压在一起 (图 1G)。确保网格绷紧。
注: 作为安全措施, 使用镊子将网格放在盖子上。 - 一旦胶水的初始层干了, 就在盖子之间的外间隙涂上一圈氰胶。大方, 因为这增加了完整性, 防止任何剥离或泄漏。
- 用单丝网孔尺寸将过滤器贴上标签。
注: 在这里, 我们使用两个网孔 sizes—20µm 和50µm。
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使用协议
- 预湿筛。
- 吸管一个盐水溶液, 如 M9 [5 克氯化钠, 6 克 Na2HPO4, 3 克的 2 PO 4, 1升的超纯 H2O 和1毫升的 MgSO4 (1 M)]17, 通过筛的中心, 直到液滴形成, 凝结, 并从过滤器底部的中心滴下 (图 2A)。或者, 将不起毛的擦拭 (例如, Kimwipe) 放在底部, 在网格上形成或散布一个湿气滴。
- 把筛子放在50毫升圆锥管上。将管标为 "废物管" (图 2B)。
- 从琼脂盘上清洗一个群的线虫。
- 用 M9 缓冲器冲洗盘子, 一次将含有蠕虫的介质放在单丝网1毫升的上面 (图 2C)。确保在网格的中心进行操作。把盘子里的虫子都洗干净。
注: 一般情况下, 3 毫升的 M9 为60毫米板是足够的。 - 为了尽量减少在吹打中丢失的蠕虫的数量, 请使用玻璃巴斯德吸管将蠕虫从盘子中移出并放到网格中心 (根据需要重复)。
- 用 M9 缓冲区从顶部冲洗过滤器。再次, 确保在网格的中心操作, 并冲洗该区域的所有蠕虫。清洗尽可能多的时间, 以确保所有的细菌和较小的蠕虫已经通过网格。
- 用 M9 缓冲器冲洗盘子, 一次将含有蠕虫的介质放在单丝网1毫升的上面 (图 2C)。确保在网格的中心进行操作。把盘子里的虫子都洗干净。
- 从筛子上收获大小匹配的动物。
- 将一个新的50毫升圆锥管连接到筛顶部, 并将1.2.2.3 的成虫从台阶上的蠕虫朝向新收集管的内部 (图 2D)。
- 卸下第一管 (废管), 快速翻转筛板和新管以防止水滴迁移 (图 2E)。
注意: 如果不育是不需要的, 使用不起毛的擦拭 (例如, Kimwipe) 在翻转之前, 从网格底部的灯芯液。 - 用 M9 将网格冲洗到新的上50毫升管中 (图 2F)。再次, 在网格中心运行, 并保持在网格底部的水滴。
- 允许蠕虫解决或轻轻地旋转下来 (例如, < 16 x g) 约1分钟 (图 2G)。
- 从蠕虫颗粒中吸取缓冲液, 最好是 > 0.5 毫升, 或者在不干扰颗粒的情况下尽可能多地去除液体。
- 用玻璃巴斯德吸管将蠕虫吸进 NGM 板上, 让它们干。在一个新的板块上的多个水滴的空间, 使他们干得更快 (图 2H)。
- 清洁筛网。
- 用乙醇和反渗透水轻轻、彻底地冲洗筛子。让它干吧。
- 将其存储在一个干净的容器中, 以便无限期地使用。
- 当网格出现 "凹陷" 时, 丢弃它。
- 预湿筛。
2.秀丽筛分选方法的验证
- 一般维护
- 为所有实验, 养殖蠕虫在标准线虫成长媒介17 (1 L NGM 包括2.5 克蛋白胨, 17 克琼脂, 3 g 氯化钠, 975 毫升二蒸馏水, 1 毫升5毫克/毫升胆固醇, 1 毫升 1 M CaCl2, 1 毫升的1米 MgSO4, 25 毫升1米 KHPO4, 0.5 毫升的100毫克/毫升链霉素) 在25摄氏度。
- 实验治疗管理
- 比较三治疗组: 摘、fluorodeoxyuridine (FUDR) 和秀丽筛。
- 对于 FUDR 治疗组, 添加100毫克/毫升 FUDR 到 NGM 培养基, 最终浓度为100微米, 以防止任何后代的生产, 并转移蠕虫每隔一天的新鲜 NGM 板, 以避免食物枯竭。
- 对于拾取组, 请使用白金循环手动选择和传输蠕虫。
- 对于秀丽筛治疗组, 请遵循步骤1.2 并将蠕虫吸管移到 NGM 板上。
- 比较三治疗组: 摘、fluorodeoxyuridine (FUDR) 和秀丽筛。
- 秀丽筛分率
- 为了量化筛检对C. 线虫的有效程度, 在25摄氏度 (即产卵后48小时), 将 N2 动物的年龄同步到1天, 然后通过采摘新鲜的 NGM 盘子 (共计 N = 50 或 N = 100 动物每atment 集团)。
- 经过24小时的恢复, 将人口转移到新的 NGM 板与秀丽筛后, 上述协议 (见步骤 1.2) 和计数成功转移动物的数量。
- 计算百分比收益率, 因为与转移开始时的起始数相比, 转移的动物数量的比率乘以 100 (%)。
- Healthspan 化验
注: 评分 healthspan 参数的运动类, 咽泵率, 以及前和后温和触摸反应在天 2, 4, 6 和8的成年年龄同步 N2 动物维持在25摄氏度。- 动力跟踪
- 根据基于类的系统 (类 a、B 和 C) 来分配运动分数, 方法如下. 18. 比较三个实验组在统计分析软件中使用序号逻辑统计模型的效果。
注意: a 类个体自发地以正常的、正弦的模式运动。B 类个体在明显的非正弦运动中移动, 可能需要刺激来鼓励运动。C 类个体移动他们的头和/或尾巴响应刺激, 但不能移动横跨琼脂。
- 根据基于类的系统 (类 a、B 和 C) 来分配运动分数, 方法如下. 18. 比较三个实验组在统计分析软件中使用序号逻辑统计模型的效果。
- 咽泵率
- 在600X 的最终放大率为1分钟的显微镜下, 将动物末端咽球的研磨运动进行计数。
- 用α = 0.05 和 Bonferroni 后测试的方法进行统计分析, 并进行单因子 = 0.05。
- 触摸响应
- 记录一个温柔的触摸反应和比较三治疗组。根据 Calixto 所描述的方法进行化验. 19。
- 记录前和后接触的反应, 轻轻抚摸睫毛采摘垂直横跨尾部或头部 (5x 每, 交替头和尾巴) 的动物。
- 将任何运动的相反方向的中风作为1点的比例为0到5的前和后反应。
- 进行统计分析与α = 0.05 和 Bonferroni 后测试与α = 0.05 的单向方差计算。
- 动力跟踪
- 繁殖力测定
- 为了确定使用秀丽筛对生殖的影响, 生长年龄同步 N2 动物到2天成年在25摄氏度。
- 60 h 在蛋以后放置, 转移动物到新的 NGM 板材与白金挑选或秀丽筛子并且给他们 4 h 恢复 (干燥被筛的板材为 20–30 min)。
- 恢复后, 单独将动物通过睫毛 NGM 板, 给他们24小时产卵, 并删除动物。允许每个板块的子代在正常条件下发育25摄氏度, 另24小时。
注: 睫毛采摘是一个人的睫毛固定在巴斯德吸管的末端与指甲油和乙醇消毒。 - 计算可行的 F1 生成个体的数量。使用α = 0.05 的 T 检验进行统计分析。
注意: 存活的后代被认为是成功孵化并通过常规幼虫周期开始发育的卵子。
- 荧光记者应激反应测定
- 执行三种常用的荧光报告器检测, 以发现潜在的应力标记: DAF-16::GFP 转移到细胞细胞核的应变 [TJ356-zIs356 (pDAF-16::D af-16-gfp;rol-6)]20;hsp-16.2 表达式 [TJ375-gpIs1 (热休克-16.2p:: GFP)]21;和一个 sod-3 表达 [CF1553-muIs84 ([pAD76] sod-3 p:: GFP + 轧辊-6 [su1006]]22。
- 为每种化验, 文化年龄同步动物从三治疗小组在20°c 并且审查他们在3天: 使用消极控制 (每天, 转移一组动物手工用白金采摘), 一个正面控制 (在每日依据, 手动转移一组动物与白金采摘加上一个既定的压力源), 和秀丽筛 (通过筛的动物, 并允许他们恢复30分钟 NGM 就在成像之前)。
- 在 DAF-16::GFP 化验中, 热休克的阳性对照动物在37摄氏度30分钟前成像20。为 hsp-16.2 化验, 热休克阳性对照动物90分钟, 20 小时前成像21。对于 sod-3 的检测, 在成像22前将100毫米百草枯的阳性对照动物治疗为4小时。
- 立即收获的蠕虫与睫毛采摘和装载他们到一个盖玻片与 1 ul 36% 泊洛沙姆407表面活性剂解决方案, 以固定蠕虫。
- 将安装的蠕虫与另一盖玻片三明治。将两个盖玻片安装到标准的玻璃显微显微镜幻灯片上, 并在倒置荧光显微镜 (用于总放大倍数 80X) 和 FITC 过滤器的恒定曝光中使用8X 放大倍数图像。
- 为了检测三组之间的任何差异在 DAF-16::GFP 化验, 分类的动物根据 DAF-16::GFP 记者的位置 (核如果记者移位到细胞核, 胞浆如果记者位于细胞质, 和中间如果记者位于原子核和细胞质。
- 在统计分析软件中使用序号物流统计模型对结果进行比较。对于 hsp-16.2 和 sod-3 表达式检测, 使用单路方差分析法 = 0.05 和 Tukey 的后临时测试与α = 0.05 比较的总荧光的头部区域。
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Representative Results
秀丽筛由2个螺钉盖组成, 保证了编织尼龙丝网的面积小于所需发育年龄的体径, 用于用简单的洗涤技术提取生物体的活种群。它附着在标准锥形管上, 使用网格屏幕按身体直径对动物进行机械分类, 使所需的动物在试管中准备好进行进一步的维护和试验 (例如, 转移或遗传收获)。一个温和的手工洗涤与秀丽筛是快速的, 约5分钟每60–100毫米板, 和有机体很容易从网格中恢复。
以下动物的产量百分比秀丽筛分用
为确定秀丽筛的产量百分比, 对成年动物的20微米和50微米孔径网格进行了测试。对两种筛网尺寸进行了 > 90% 成功动物转移的平均产量 (表 1)。
不同大小间隙的单丝网可用于分离不同生命期的动物。20微米间隙的网格适合洗涤发育的胚胎和幼虫阶段小于第四幼虫阶段, 保留后者 (L4; 以平均身体直径32微米) 和任何动物在以后的生活阶段, 而网与50微米空白将允许所有其他生活阶段除了成人 (平均身体直径70微米) 被冲走 (表 2)。
秀丽筛子使用不影响 healthspan 指标
动力:在C. 线虫中, 正常的正弦运动 (即运动) 随着年龄的18下降, 是整体健康的标志。为了确定秀丽筛对运动的影响, 在2、4、6和8的成年期, FUDR 和秀丽筛治疗组的运动评分进行比较。每组动物 (n = 10/组) 在成年时期 (2、4、6和8的成年期) 表现出正常和自发的运动模式 (a 类);p > 0.05 为所有天的多比较,图 3)。
咽泵率:随着年龄的推移,线虫的咽部肌肉泵的能力下降, 是 healthspan23的另一个生物标志物。为了确定秀丽筛对动物咽部泵率的影响, 选择, FUDR 和秀丽筛治疗组比较2天, 4, 6 和8的成年 (n = 8 到10每组)。在6天 (p < 0.001) 和 8 (p < 0.001) 进行采摘和 FUDR 方法的动物之间有显著的差异。此外, 筛和 FUDR 组在6天 (p < 0.001) 和成年8天 (p < 0.001) 之间有显著差异。然而, 在任何一天 (p > 0.05,图 4), 采摘和秀丽筛组之间没有统计学意义上的差异, 表明筛不影响这一措施的 healthspan。
柔和的触摸响应:对机械刺激的反应是评估衰老或一般健康24,25的生理指标;因此, 对不同的转移方法对前、后柔和触点反应的影响进行了测试。FUDR、秀丽筛治疗组 (n = 8/组), 无论是前方还是向后, 在任何一天的测试中均无统计学意义差异 (p > 0.4 用于所有比较;图 5A和5B)。
生育力:为了确定秀丽筛是否影响了线虫产生的存活后代数量, 在3天的24小时内产生的个体后代被计算和比较 (n = 每组20到 22)。秀丽筛的使用并没有显著影响与挑选治疗组相比产生的后代数量 (p = 0.61,图 6)。
分子记者化验
DAF-16 核易位:在C. 线虫中, 转录因子 DAF-16 的活化与增加的抗应力26有关。DAF-16 的核定位研究了转基因线虫菌株 TJ356, 表达 DAF-16 融合到绿色荧光蛋白 (DAF-16::GFP)20。在正常生长条件下, DAF-16::GFP 主要在细胞质, 但在各种压力下 (如热应力), 它迅速移位进入核20。为了检验秀丽筛对 DAF-16 易位的影响, 在阳性对照组 (热应激) 与年龄匹配的 day-5 成人中, DAF-16::GFP 定位进行了比较, 阴性对照组 (手动转接),秀丽筛治疗组 (n = 10/组)。转移与秀丽筛没有影响 DAF-16::GFP 的核易位, 并且显示了相似的表型对阴性控制动物 (p > 0.05,图 7)。
hsp-16.2记者:像 HSP-16.2 这样的小型热休克蛋白是一种应激反应的生物标志物, 它们在暴露于热休克或氧化应激剂21、27时高度表达。TJ375 菌株有一个 GFP 报告基因融合的 hsp-16.2 启动子在正常情况下不活跃21。然而, 暴露在热休克, HSP-16.2 蛋白表达的诱导, 和动物显示高含量的 GFP 表达21。为了测试秀丽筛对16.2 介导的应力响应的参与, 在 day-5 成人中, 对照组对年龄匹配动物的咽区 (n = 10 动物/组) 的荧光密度进行了比较 (热压力), 阴性对照组 (采摘) 和秀丽筛治疗组。与秀丽筛的转移没有显著诱发热休克蛋白的表达-16.2:: gfp (热休克-16.2:: gfp) 相比, 阴性对照 (p > 0.05,图 8)。
sod-3记者:在C. 线虫中, 超氧化物歧化酶 3 (SOD-3) 编码的抗氧化剂基因在氧化应激28期间被调节。线虫菌株 CF1553 表达绿色荧光蛋白 (GFP) 标记的 SOD-3 启动子, 其表达由氧化应激剂 (如百草枯5) 引起。为了测试秀丽筛分选对线虫抗氧化反应的影响, 对年龄匹配的 day-5 成年人头部区域的荧光密度进行了比较 (100 微米百草枯治疗), 阴性控制人口 (手工采摘) 和秀丽筛转移的人口。与阴性对照 (p > 0.05,图 9) 相比,秀丽筛的转移没有显著诱发 sod-3::gfp 的表达。
图 1:秀丽筛施工.该工具的 "自行动手" 制造过程将显示出来。这些面板显示 (A) 两个50毫升圆锥管帽 (B), 其中心已被拆除, (C) 切割边缘平滑, (D F) 谁是配有单丝网与预期的生活阶段的线虫(有关详细信息, 请参阅协议)。(G) 还显示已完成的筛网。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2:秀丽筛使用的分步图像表示法.(a) 筛的预湿与一滴 M9 溶液, (B) 适合在50毫升圆锥管顶部。(C) 1 毫升的蠕虫 M9 溶液在筛上 pipetted, (D) 将50毫升圆锥管放在筛子的顶部, 并面对管内的蠕虫, (E) 与新附着的上部管的筛子迅速翻转 o(G) 用 M9 将所需的动物放入新的50毫升管中冲洗, 并允许蠕虫在管的底部重力沉降。(H) 蠕虫被 pipetted, 并放置在新鲜的 NGM 板上。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3:秀丽筛在整个寿命期间没有影响运动.这一数字显示了在2、4、6和8的成年时期, 用于采摘、FUDR 和秀丽筛治疗组的动物的运动类分布。类动物正常和自发地移动, B 类动物异常移动并且可能需要刺激, 并且 C 类动物不能移动。秀丽筛、摘 FUDR 组无差异 (p > 0.05)。采用序贯物流模型对三项复制 (每治疗板10只动物) 进行了分析。B 类动物。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4:秀丽筛使用不影响咽泵的整个寿命.这一数字显示的咽泵率的采摘, FUDR 和秀丽筛治疗组, 比较2天, 4, 6 和8的成年。星号表示在指定的天数 (** p < 0.05) 中, 拾取、筛和 FUDR 治疗组之间的意义。秀丽筛与选组无差异 (p > 0.05)。用单向方差分析法和 Bonferroni 后试验对两种复制 (每治疗板10只动物) 进行了研究。条形表示平均值的标准误差。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5:秀丽筛使用不影响整个寿命的前接触反应.这些面板显示 (A) 前和 (B) 后接触反应计数的采摘, FUDR 和秀丽筛治疗组相比, 天 2, 4, 6 和8的成年。对每个治疗组分别进行了两次复制, 并与单向方差分析和 Bonferroni 后检查 (p = 0.4 和p = 0.9 的前后) 进行了比较。条形表示平均值的标准误差。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6:秀丽筛不影响成年3天存活后代的数量。这一数字显示了 day-3 成人在24小时产卵后的存活后代, 为母兽提供了3天的成年期。条形表示平均值的标准误差。N = 20-22 动物从至少二个单独生物复制每治疗小组。治疗组与t检验进行比较, (p > 0.05)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7:秀丽筛不影响 DAF-16::GFP 核易位.这些面板显示有代表性的图像的 DAF-16 易位 (a) 热休克组 (阳性对照), (B) 一个采摘组 (阴性对照), (C)秀丽筛治疗组。(D) 阳性对照组的动物显示 DAF-16 核易位的活化。秀丽筛没有诱导核易位和显示胞浆融合蛋白类似的动物在阴性对照组。N = 10 个动物每治疗小组从至少三个分开的生物复制。治疗组与单向方差分析和 Tukey后的临时试验进行比较。刻度条 = 100 微米。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8:秀丽筛不影响 hsp16.2 的表达:: gfp.比较了热休克组 (阳性对照)、选组 (阴性对照) 和秀丽筛治疗组的 HSP-16.2 表达式 (任意荧光单元)。星号表示 hsp16.2 的高表达式:: gfp 为阳性对照组, 与其他治疗组有显著差异 (** p < 0.05)。秀丽筛不影响 hsp16.2:: gfp 表达和显示荧光强度类似动物在阴性对照组 (p > 0.05)。对每个治疗组进行三次复制, 并与单向方差分析和 Tukey 的后验试验进行比较。请单击此处查看此图的较大版本.
图 9:秀丽筛不影响 sod-3::gfp 的表达.SOD-3 (在任意荧光单位) 的100微米百草枯组 (阳性对照), 筛选组 (阴性对照) 和秀丽筛治疗组显示。星号表示阳性对照组的 sod-3::gfp 表达高, 与其他组 (*** p < 0.05) 有显著差异。秀丽筛不影响 sod-3::gfp 的表达和显示荧光强度类似的动物在阴性对照组 (p > 0.05)。对每个治疗组进行三次复制, 并与单向方差分析和 Tukey 的后验试验进行比较。请单击此处查看此图的较大版本.
| 网格尺寸 | N = 50 | N = 100 |
| 20微米 | 95.33% | |
| 50微米 | 99.00% | 93.33% |
表 1: 网格尺寸的百分比率.这张表显示了20微米设备测试与 n = 50 成人为3复制和50微米设备测试与 n = 50 成人为2复制和与 n = 100 为3复制。
| 网格尺寸 | 发展阶段 | 车身直径 |
| 20微米 | 幼虫阶段4 | ~ 35 微米 |
| 50微米 | 1天成人 | ~ 70 微米 |
表 2: 平均体直径.该表显示平均体直径获得的平均3测量均匀分布在每个蠕虫15动物在每个测量生命期。
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Discussion
在这里, 我们介绍了设计和使用的方便, 有效的秀丽筛作为一个工具, 以排序和维护C. 线虫。这个工具有几个好处, 手工采摘个别动物, 洗涤人口, 化学处理 (例如, FUDR), 和更昂贵的方法分离动物。首先,秀丽筛有效和快速 (少于20分钟) 排序后代从大混合种群的动物 (表 2)。此外, 该工具的使用对动物的 healthspan 没有可检测的毒性作用 (图 3,图 4,图 5,图 6), 不诱导良好描述的基因压力记者 (图 7,图 8,图 9), 并减少了外国化学物质的数量, 可能会影响应用治疗的文化板块或任何分子化验之后。它的易用性是一个显著的优势;在他们的教育的任何阶段的研究员可以训练使用它 (图 1和图 2;协议)。
制造和使用筛网所需的材料 (例如, 吸管、缓冲器) 在标准研究实验室中很容易获得;因此, 如果损坏,秀丽筛是不昂贵的更换或修复。秀丽筛的自构造性质使其成为一种多功能的工具: 它可以用适合于不同的C. 线虫发育阶段和表型的网格大小来构造。秀丽筛也可用于其他线虫种类或隔离小有机体时进行的化验, 条件是在制造时使用适当的网格尺寸。
除了此工具为C. 线虫的种群维护提供的好处外, 该筛还可用于清洁动物, 然后再使用其他实验应用。例如, 随着微流体的发展, 对线虫的研究出现了芯片使用和清洗的问题。根据动物附着的细菌数量, 需要采取特殊的预防措施, 以免堵塞微流控芯片, 使其无法使用29。通常当C 线虫被转移到微流控芯片时, 细菌草坪上的残留物就会随之被携带。这种残渣会堵塞微流控通道, 造成芯片故障, 需要清洗或更换。该协议中的设备构造提供了一种方法, 不仅为微流体捕获同步动物, 而且还用于在将动物插入微流控装置之前对其进行清洗。通过去除收集动物时所占的碎片和细菌残留物, 微流控通道不易发生故障, 从而提高了单个芯片的使用寿命, 以及随后与它们进行的研究的吞吐量。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。提交人声明, 这项研究是在没有任何商业或金融关系的情况下进行的, 这可能被理解为潜在的利益冲突。
Acknowledgments
作者想感谢希瑟科里对研究设计的初步贡献, Swarup 博士米特拉对手稿的批判性审查。我们还要感谢迈克尔. 哈里斯博士在制作这一方法时提出的意见、改进和协助。这些菌株由秀丽遗传学中心提供, 由 NIH 研究基础设施项目办公室 (P40 OD010440) 资助。本出版物所报告的研究得到国家卫生研究院全国医学科学院的支持, UL1GM118991、TL4GM118992、RL5GM118990 和机构发展奖 (构想) 由国家卫生研究院全国医学科学院授予编号5P20GM103395-15。内容完全是作者的责任, 不一定代表国家卫生研究院的官方意见。UA 是 AA/《雇佣条例》的雇主和教育机构, 禁止对任何个人进行非法歧视: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
References
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