Summary
O protocolo atual inclui uma metodologia para a classificação e a limpeza das populações de idade-combinadas de elegans de Caenorhabditis. Ele usa um simples, barato e eficiente ferramenta sob medida para obter uma grande população experimental de nematoides para pesquisa.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um organismo de bem-estabelecida modelo usado em toda uma gama de pesquisas básicas e biomédica. Dentro da comunidade de pesquisa nematoide, há uma necessidade de uma maneira acessível e eficaz para manter as populações grandes, idade-combinadas de c. elegans. Aqui, apresentamos uma metodologia para mecanicamente classificação e limpeza c. elegans. O nosso objectivo é fornecer um processo econômico, eficiente, rápido e simples para obter animais de tamanhos uniformes e estágios de vida para a sua utilização em experiências. Esta ferramenta, o crivo de Caenorhabditis , usa um sistema de tampa custom-built que tópicos para tubos comuns de laboratório cónico e classifica c. elegans com base no tamanho do corpo. Também demonstramos que a peneira Caenorhabditis efetivamente transfere animais de placa de uma cultura para outra que permite uma classificação rápida, sincronizando e limpeza sem afetar marcadores de saúde, incluindo a motilidade e stress-inducible repórteres do gene. Esta ferramenta acessível e inovadora é uma opção rápida, eficiente e não estressante para manter as populações de c. elegans .
Introduction
O verme nematoide, Caenorhabditis elegans, é um organismo modelo premier. Além da natureza simples e controlada do seu cultivo em laboratório, todo o seu genoma é sequenciado1 e o destino do desenvolvimento de cada célula é conhecido2. Devido a estas características, c. elegans é um organismo modelo amplamente usado para estudos genéticos. No entanto, juntamente com estas características benéficas vem alguns desafios para os pesquisadores. Devido ao seu tempo de geração rápida, as populações de c. elegans rapidamente podem ficar sem comida e/ou se misturam as populações com várias gerações e estádios de desenvolvimento presentes ao mesmo tempo. Assim, experimentos realizados na mídia de crescimento sólido de nematoides (NGM) exigem pesquisadores mover fisicamente os animais para placas frescas antes da fonte de alimento bacteriana esgota e desenvolvem novas larvas. Isto pode ser tedioso como uma transferência frequente dos animais é necessária para evitar as populações experimentais de tornar-se misturado com gerações de prole. Ainda, alguns experimentos requerem ambos grande número de animais e de pontos de tempo prolongado (por exemplo, extração de DNA ou RNA na idade adulta). Este compostos os desafios com precisão, mantendo uma população sincronizada e transferir um grande número de animais.
Métodos atuais de transferência de c. elegans cultivadas em NGM estão escolhendo ou lavar os animais de placa para placa; quimicamente, tratando os animais (por exemplo, com o DNA replicação inibidor fluorodeoxyuridine ou FUDR); ou usando citometria de fluxo para classificar os animais em placas multi bem. Colheita envolve o uso de uma ferramenta de mão, feito com um arame fino de platina ou um cílio, para transferir manualmente o indivíduo ou vários animais3,4. Esse método é preciso, mas requer habilidade e tempo e é uma limitação de estudos envolvendo um grande número de animais. Escolher o maio também ser fisicamente prejudiciais e estressante para os animais potencialmente sujeitando indivíduos quantias antinatural e inconsistente de perturbação e força. Lavar roupa envolve um prato de cultura com uma solução tampão de lavagem e transferir a solução com os animais através de uma pipeta Pasteur de vidro para uma nova placa de cultura. Este método é rápido e eficiente, mas não é exato, como várias gerações e estádios de desenvolvimento dos animais são transferidos em massa. Tratamentos químicos, tais como FUDR, podem ser dissolvidos na mídia cultivo para impedir a produção de descendência através de bloquear qualquer replicação do DNA e, portanto, o desenvolvimento de ovos e produção de gametas. Pouco eficaz, este método deve ser aplicado após a maturação do desenvolvimento como para não perturbar os processos do desenvolvimento normais, e isso significa que ainda há um requisito para transferir os animais antes da sua administração3. Esse método também influencia vários celulares vias de sinalização, resultando em efeitos visíveis dos animais com a idade (por exemplo, uma extensão de vida útil ou um proteostasis alterada) dependendo da cepa de c. elegans usado5, 6,7,8,9,10. Métodos de citometria de fluxo automaticamente classificar e transferir individual c. elegans de uma placa multi bem para outro11. Enquanto este método é muito eficaz e eficiente, equipamento de citometria de fluxo é proibitivamente caro e inacessível para muitos pesquisadores. Uma alternativa para transferência de animais é usar modelos mutantes que são sensível, tais como fer-15 e fem-1, que se tornam estéreis com ajuste de temperatura12de temperatura. Enquanto usar animais mutantes é útil em algumas situações, estas cepas específicas crescem mais lentamente do que os animais selvagem-tipo e eles contam com um genoma alterado, servindo como pobres representantes para vermes envelhecimento ou saudáveis. Além disso, a dependência de uma mudança de temperatura para induzir esterilidade também resulta na ausência de um ambiente estático, e mudanças de temperatura foram prontamente mostradas para influenciar o gene expressões13,14, 15. grupos de pesquisa têm publicado anteriormente técnicas descrevendo o uso de uma malha para filtrar c. elegans por tamanho16. No entanto, fomos capazes de encontrar trabalhos anteriores testes para qualquer alteração nos resultados saúde geral podem ser associados com o uso de tais filtros.
Há, assim, uma necessidade um método acessível, eficiente, rápido e preciso para transferir um grande número de animais entre placas de cultura dentro da comunidade de pesquisa de c. elegans . Nós desenvolvemos uma peça melhorada, acessível do equipamento (chamado Caenorhabditis peneira) e um protocolo associado para sua manufatura e operação que atenda às necessidades da comunidade de pesquisa de c. elegans . Aqui, partilhamos o projeto do Caenorhabditis peneira e métodos para sua utilização, e demonstramos que seu uso não afeta a saúde comum ou qualquer marcadores de estresse quando comparado a colheita manual padrão e um tratamento com o comumente usados, restrição da fertilidade química FUDR.
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Protocol
1. Caenorhabditis peneira construção e uso
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Protocolo de construção
- Adquira 2 tampas de tubos de Erlenmeyer de 50 mL (figura 1A).
- Remover a área do centro dentro do lábio interior das tampas (quando visto de baixo, figura 1B) usando um bico de Bunsen e uma sonda de metal quente ou um ferro de solda ou pisar a broca.
Nota: Usando o calor para cortar a tampa de plástico é preferível uma lâmina, porque há menos risco de lesão. - Limpar e lixar as bordas cortadas e cubra a superfície com um arquivo curvado ou um rotativo moer ferramenta (por exemplo, Dremel). Ver Figura 1.
- Corte o círculo da malha monofilamento para o diâmetro apropriado (Figura 1). Para isso, trace uma tampa sobre uma folha de malha de nylon monofilamento e corte apenas dentro da linha desenhada.
- Corte barras/sulcos na superfície superior das tampas para melhorar a aderência das duas tampas, quando a cola é aplicada para o plástico (Figura 1E).
- Limpe as tampas com etanol e deixe-os secar.
- Aplique a cola de cianoacrilato para a superfície superior de ambas as tampas, mantendo a borda externa.
Nota: um pouco de cola vai um longo caminho. - Coloque o engranzamento do monofilamento, de acordo com a tabela 1, em uma tampa colada (Figura 1F). Coloque a segunda tampa invertida em cima da malha; ambas as tampas devem ter seus topos juntos. Pressione firmemente juntos (Figura 1). Certifique-se de que a malha é esticada.
Nota: como medida de segurança, usar uma pinça para colocar a malha nas tampas. - Uma vez que a camada inicial de cola secou, aplica um anel de cola de cianoacrilato em torno o fosso exterior entre as tampas. Ser generoso como isso agrega integridade e impede qualquer peeling separado ou com vazamento.
- Rotule o filtro com o tamanho de poro de malha da malha monofilamento.
Nota: Aqui, usamos dois tamanhos de poros de malha — 20 µm e 50 µm.
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Protocolo de uso
- Pre-molhado da peneira.
- Pipetar uma solução salina, como M9 [5 g de NaCl, 6 g de Na2HPO4, 3 g de KH2PO4, 1 L de ultrapura H2O e 1 mL de MgSO4 (1m)]17, através do centro da peneira até formar uma gota , condensa e escorre para fora do centro da parte inferior do filtro (Figura 2A). Opcionalmente, aplicar um apagamento de fiapos (por exemplo, Kimwipe) para o fundo de forma ou espalhar uma gota de umidade na malha.
- Coloque a peneira sobre um tubo cónico de 50 mL. Rotular o tubo como 'Tubo de resíduos' (Figura 2B).
- Lave uma população de c. elegans sobre uma placa de ágar.
- Lavar a placa com o buffer M9 e coloque o meio contendo worm da parte de cima da malha monofilamento 1 mL de cada vez (Figura 2). Certifique-se de operar-se no centro da malha. Lave todos os vermes da placa.
Nota: Normalmente, 3 mL de M9 para uma placa de 60 mm é suficiente. - Para minimizar o número de vermes perdido na pipetagem, use um pipeta Pasteur de vidro para mover os vermes fora da placa e no centro da malha (repetição conforme necessário).
- Lave o filtro com o buffer M9 do topo. Novamente, certifique-se de operar-se no centro da malha e lave todos os vermes nessa área. Lave quantas vezes for necessário para garantir que todas as bactérias e vermes menores passaram a malha.
- Lavar a placa com o buffer M9 e coloque o meio contendo worm da parte de cima da malha monofilamento 1 mL de cada vez (Figura 2). Certifique-se de operar-se no centro da malha. Lave todos os vermes da placa.
- Os animais de tamanho correspondente da peneira da colheita.
- Anexe um novo tubo cónico de 50 mL para a parte superior da peneira, com os vermes adultos da etapa 1.2.2.3 voltados para dentro do tubo da nova coleção (Figura 2D).
- Remover o primeiro tubo (resíduos) e rapidamente vire a peneira e tubo novo para impedir a migração da gota (Figura 2E).
Nota: Se esterilidade não é necessária, use uma limpeza de fiapos (por exemplo, Kimwipe) ao pavio fluido de baixo da malha antes de virar. - Enxágue a malha com M9 no novo tubo 50 mL do bordo novo (Figura 2F). Novamente, operar no centro da malha e a manter uma gota na parte de baixo da malha.
- Permitir que os vermes resolver ou spin-os suavemente para baixo (por exemplo, < x 16 g) por aproximadamente 1 min (Figura 2).
- Aspirar a solução-tampão da pelota de vermes, idealmente para > 0,5 mL, ou remover todo o líquido possível sem perturbar o sedimento.
- Pipetar os vermes usando um pipeta Pasteur em um prato NGM do vidro e deixe-os secar. Espaço múltiplas gotículas fora em um prato novo para secar mais rápido (Figura 2 H).
- Limpe o crivo.
- Enxágue a peneira delicadamente e completamente com água etanol e osmose reversa. Deixe-o secar.
- Armazená-lo em um recipiente limpo para uso futuro indefinido.
- Descartá-lo quando a malha desenvolve uma aparência de "sag".
- Pre-molhado da peneira.
2. validação de peneira Caenorhabditis , método de classificação
- Manutenção geral
- Para todos os experimentos, cultura vermes num padrão de nematódeo crescimento Media17 (1L de NGM consiste de 2,5 g de peptona, 17 g de ágar-ágar, 3 g de NaCl, 975 mL de água bidestilada, 1 mL de colesterol de 5 mg/mL, 1 mL de 1 M CaCl2 0,5 mL de estreptomicina 100 mg/mL, 25 mL de 1m KHPO4e 1 mL de 1 M de MgSO4) a 25 ° C.
- Administração de tratamento experimental
- Compare os três grupos: picareta, fluorodeoxyuridine (FUDR) e Caenorhabditis peneira.
- Para o grupo de tratamento FUDR, adicionar 100 mg/mL FUDR para a mídia NGM para uma concentração final de 100 μM para impedir qualquer produção de descendência e transferir os vermes todos os dias para um prato NGM fresco para evitar o esgotamento de comida.
- Para o grupo escolher, selecionar e transferir os vermes manualmente usando um loop de platina.
- Para o grupo de tratamento de peneira Caenorhabditis , siga a etapa 1.2 e pipetar os vermes em um prato NGM.
- Compare os três grupos: picareta, fluorodeoxyuridine (FUDR) e Caenorhabditis peneira.
- Caenorhabditis Percentagem do rendimento da peneira
- Para quantificar como a peneira é eficaz na classificação de c. elegans, crescer idade-síncrono N2 animais para 1 dia de idade adulta, a 25 ° C (ou seja, 48 h após a postura de ovos) e depois transferi-los por pegá-los para novas placas NGM (totalizando N = 50 ou N = 100 animais por tre grupo de atment).
- Após 24h de recuperação, transferir a população para novas placas NGM com o crivo de Caenorhabditis seguindo acima do protocolo (consulte a etapa 1.2) e contar o número de animais transferidos com êxito.
- Calcule a percentagem do rendimento como a relação entre o número de animais transferidos em comparação com o número inicial no início da transferência multiplicado por 100 (%).
- Ensaios Healthspan
Nota: Pontuação healthspan parâmetros de classe de motilidade, a taxa de bomba da faringe e tanto o anterior e a posterior toque suave resposta nos dias 2, 4, 6 e 8 da maioridade para idade-sincronizado N2 animais mantidas a 25 ° C.- Motilidade de rastreamento
- Atribuir pontuações de motilidade, baseadas em um sistema baseado em classe (classes A, B e C) seguindo os métodos de Herndon et al . 18. comparar os efeitos dos três grupos experimentais usando um modelo de estatísticas logístico ordinal em software de análise estatística.
Nota: Os indivíduos de classe A mover-se espontaneamente em um padrão normal, sinusoidal. Indivíduos de classe B mover-se em movimentos marcadamente não-sinusoidal e podem exigir cutucando para encorajar a circulação. Indivíduos de classe C mover sua cabeça e/ou cauda em resposta ao estímulo, mas são incapazes de se mover através de agar.
- Atribuir pontuações de motilidade, baseadas em um sistema baseado em classe (classes A, B e C) seguindo os métodos de Herndon et al . 18. comparar os efeitos dos três grupos experimentais usando um modelo de estatísticas logístico ordinal em software de análise estatística.
- Taxa de bomba da faringe
- Conte o movimento moedor do bulbo de faríngea terminal do animal visualmente sob um estereomicroscópio com uma 600 X ampliação final por 1 min.
- Realizar uma análise estatística com uma One-Way ANOVA com α = 0,05 e pós-testes de Bonferroni com α = 0,05.
- Resposta de toque
- Gravar uma resposta de toque suave e comparar entre os três grupos. Realizar os ensaios com base em métodos descritos por Calixto et al . 19.
- Registro anterior e posterior toque resposta por suavemente acariciando um picador de cílios perpendicularmente através da cauda ou na cabeça (5x cada, alterna cabeça e cauda) dos animais.
- Marca qualquer movimento no sentido oposto do traço como 1 ponto em uma escala de 0 a 5 para o anterior e a posterior resposta.
- Realizar análise estatística com uma One-Way ANOVA com α = 0,05 e pós-testes de Bonferroni com α = 0,05.
- Motilidade de rastreamento
- Ensaio de fecundidade
- Para determinar o uso do impacto da peneira Caenorhabditis na reprodução, crescer idade-síncrono N2 animais ao dia 2 de idade adulta, a 25 ° C.
- 60h depois põem ovos, transferir os animais para novas placas NGM com um picador de platina ou a peneira Caenorhabditis e dar-lhes a 4 h para recuperar (seque as placas peneiradas para 20-30 min).
- Após a recuperação, individualmente placa os animais através de um cílio escolher placas de NGM, dar-lhes 24 h para colocar ovos e remover os animais. Permitir que a descendência em cada placa para desenvolver em condições normais, a 25 ° C para outro 24h.
Nota: Um picador de cílios é um cílio humano garantiu à extremidade de uma pipeta Pasteur com esmaltes e esterilizados com etanol. - Conte o número de indivíduos de geração F1 viáveis. Realizar uma análise estatística utilizando um T-teste com α = 0,05.
Nota: Prole viável é considerados os ovos que eclodem e iniciam o seu desenvolvimento através dos ciclos regulares larvas com êxito.
- Ensaios de resposta de estresse repórter fluorescentes
- Realizar três ensaios de repórter fluorescentes comumente usado para detectar potenciais marcadores de estresse: uma translocação DAF-16::GFP para os núcleos das células em uma cepa [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; uma expressão de hsp-16.2 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; e uma expressão de sod-3 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.
- Para cada ensaio, cultura idade-síncrono animais dos grupos de tratamento de três a 20 ° C e examiná-los no dia 3 de idade adulta: usar um controle negativo (em uma base diária, de transferência de um grupo de animais manualmente com um picador de platina), um controle positivo (em uma base diária transferência de um grupo de animais manualmente com uma picareta platinum plus um estressor estabelecido) e o crivo de Caenorhabditis (passar os animais através da peneira e permitir-lhes a recuperar por 30 min em NGM antes de imagem).
- No ensaio de DAF-16::GFP, calor choque os animais controle positivo a 37 ° C por 30 min antes de20de imagem. Para o ensaio de hsp-16.2, calor choque os animais controle positivo para 90 min, 20 h antes de imagem21. Para o ensaio de sod-3, trate os animais de controle positivo com paraquat 100 mM por 4h antes de22de imagem.
- Colher os vermes imediatamente com um picador de cílios e montá-los para uma lamela com 1 μL de solução 36% Poloxâmero 407 surfactante para imobilizar os vermes.
- Sanduíche dos vermes montados com outra lamela. Monte as duas lamelas de uma lâmina de vidro padrão de microscopia e imagem os vermes usando uma ampliação X 8 em um microscópio fluorescente invertido (para uma ampliação total de 80 X) e uma exposição constante com um filtro FITC.
- Para detectar quaisquer diferenças entre os três grupos no ensaio de DAF-16::GFP, categorizar os animais com base na localização do repórter DAF-16::GFP (nuclear, se o repórter translocados para núcleos, citosólico se o repórter localizado no citosol e o intermediário se o repórter localizado em ambos os núcleos e citoplasma).
- Compare os resultados usando um modelo estatístico de logística ordinal em software de análise estatística. Para o hsp-16.2 e os ensaios de expressão sod-3, use uma One-Way ANOVA com α = 0,05 e testes post hoc de Tukey com α = 0,05 para comparar a fluorescência total da região da cabeça.
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Representative Results
A peneira de Caenorhabditis consiste de 2 tampas de rosca, protegendo uma área de malha de monofilamento de nylon tecido menor que o diâmetro do corpo da época do desenvolvimento desejado, usado para extrair ao vivo populações de organismos usando uma técnica simples lavagem. Ele atribui aos tubos cónicos padrão e usa a tela de engranzamento mecanicamente classificar animais pelo diâmetro do corpo, deixando os animais desejados no tubo pronto para mais manutenção e experimentação (por exemplo, transferência ou cultura genética). Um manual suave de lavagem com o crivo de Caenorhabditis é rápido, cerca de 5 min por placa de 60 a 100 mm e os organismos são facilmente recuperados de malha.
Percentagem de rendimento dos animais a seguir Caenorhabditis Use peneira
Para estabelecer a percentagem do rendimento da peneira Caenorhabditis , dispositivos foram testados com 20 μm e 50 μm malhas de tamanho de poro em animais adultos. A dizer o rendimento de um > 90% transferência de animal bem sucedido foi alcançada para ambos os tamanhos de malha testados (tabela 1).
Monofilamento malha com tamanho diferente, as lacunas podem ser usadas para separar animais dos estágios de vida diferentes. Malha com 20 μm de lacunas é apropriada para lavar afastado desenvolvimento de embriões e estágios larvas menores do que a quarta fase larval, retendo o último (L4; com um diâmetro de corpo médio de 32 μm) e animais nas fases posteriores de vida, enquanto malha com 50 μm lacunas permitirá que todos os outra vida dos estágios de lado de adultos (com um diâmetro de corpo médio de 70 μm) a ser lavada (tabela 2).
Caenorhabditis Uso de peneira não afeta healthspan métricas
Motilidade: Em c. elegans movimento senoidal normal (ou seja, motilidade) declina com a idade de18 anos e é um marcador de saúde geral. Para determinar se o crivo de Caenorhabditis influenciado motilidade, motilidade foram comparados para escolher, FUDR e peneira Caenorhabditis grupos de tratamento nos dias 2, 4, 6 e 8 da vida adulta. Todos os animais através de cada grupo (n = 10/grupo) exibiram padrões de movimento normal e espontânea (classe A), em várias idades em toda a vida adulta (dias 2, 4, 6 e 8 da vida adulta; p > 0,05 para comparações múltiplas em todos os dias, Figura 3).
Taxa de bomba faríngea: A capacidade dos músculos da faringe c. elegans' de bomba declina com a idade e é mais um biomarcador de healthspan23. Para determinar se o crivo de Caenorhabditis influenciado taxa de bomba faríngea, picareta, FUDR e Caenorhabditis dos animais foram comparados grupos de tratamento de peneira dias 2, 4, 6 e 8 da vida adulta (n = 8 a 10 por grupo). Houve diferença significativa entre os animais que foram submetidos a colheita e métodos FUDR nos dias 6 (p < 0,001) e 8 (p < 0,001). Além disso, houve uma diferença significativa entre os grupos FUDR e peneira nos dias 6 (p < 0,001) e dia 8 da idade adulta (p < 0,001). No entanto, não houve nenhuma diferença estatisticamente significativa entre a palheta e os grupos de peneira Caenorhabditis para qualquer dia (p > 0,05, Figura 4), indicando que a peneira não afeta esta medida de healthspan.
Toque gentil resposta: Resposta ao estímulo mecânico é um marcador fisiológico para avaliar o envelhecimento ou geral saúde24,25; assim, o impacto dos métodos de transferência diferente na câmara anterior e as posterior toque suave respostas foram testados. Não houve diferença estatisticamente significativa entre a palheta e FUDR Caenorhabditis peneira grupos de tratamento (n = 8/grupo), anterior ou posterior, para qualquer dia de testes (p > 0,4 para todas as comparações; Figura 5A e 5B).
Fecundidade: Para estabelecer ou não a peneira Caenorhabditis influenciado a quantidade de descendência viável produzida por c. elegans, a prole individual produzida em um período de 24 horas durante o dia 3 de idade adulta foi contado e comparado (n = 20 a 22 por grupo). O uso da peneira Caenorhabditis não teve impacto significativamente o número de descendentes produzidos quando comparados com um grupo de tratamento de escolha (p = 0,61, Figura 6).
Ensaios de repórter molecular
DAF-16 translocação nuclear: Em c. elegans, a ativação do fator de transcrição DAF-16 está associada com aumento da pressão resistência26. A localização nuclear do DAF-16 foi examinada em uma cepa de nematoides transgênica TJ356, que expressa o DAF-16 fundida a uma proteína verde fluorescente (DAF-16::GFP)20. Em condições normais de crescimento, DAF-16::GFP está localizada principalmente no citosol, mas sob vários estressores (por exemplo, stress de calor), é rapidamente translocado para o núcleo de20. Para testar o impacto da classificação com o crivo de Caenorhabditis na translocação de DAF-16, DAF-16::GFP localizações foram comparadas em idade-combinadas dia-5 adultos em um grupo de controle positivo (stress térmico), um grupo de controle negativo (transferência manual através de escolha), e um grupos de tratamento Caenorhabditis peneira (n = 10/grupo). A transferência com o crivo de Caenorhabditis não afetou a translocação nuclear do DAF-16::GFP e mostrou um fenótipo semelhante aos animais controle negativo (p > 0,05, Figura 7).
HSP-16.2 repórter: proteínas de choque térmico pequeno como HSP-16.2 são biomarcadores de uma resposta ao estresse, e eles são altamente expressos durante uma exposição a choque térmico ou estresse oxidativo agentes21,27. A tensão de TJ375 tem um gene de repórter GFP fundido com um promotor de hsp-16.2 que não está ativo sob condições normais,21. No entanto, após uma exposição a um choque térmico, expressão de proteínas HSP-16.2 é induzida, e os animais exibir altos níveis de expressão de GFP21. Para testar o envolvimento da peneira Caenorhabditis em uma resposta ao estresse HSP-16,2-mediada, a densidade de fluorescência na região da faringe (n = 10 animais/grupo) de animais de idade correspondente foi comparado em dia-5 adultos entre um grupo de controle positivo (calor estresse), um negativo controlar grupo (escolher) e um grupo de tratamento Caenorhabditis peneira. A transferência com o crivo de Caenorhabditis não induz significativamente a expressão de HSP-16.2::GFP (hsp-16.2::gfp) quando comparado com o controle negativo (p > 0,05, Figura 8).
SOD-3 repórter: Em c. elegans, o gene de anti-oxidante que códigos de superóxido dismutase (SOD-3) de 3 está acima-regulada durante estresse oxidativo28. A cepa de c. elegans CF1553 expressa a proteína verde fluorescente (GFP)-rotulado promotor de SOD-3, cuja expressão é induzida por estresse oxidativo, como o paraquat5. Para testar o envolvimento da peneira Caenorhabditis classificação da resposta antioxidante em c. elegans, a densidade de fluorescência na região da cabeça dos adultos idade-combinados do dia-5 foi comparada entre uma população de controlo positivo (paraquat 100 μM tratamento), uma população de controlo negativo (colheita manual) e um Caenorhabditis população peneira-transferido. A transferência com o crivo de Caenorhabditis não induz significativamente a expressão de sod-3::gfp quando comparado com o controle negativo (p > 0,05, Figura 9).
Figura 1: Construção de peneira Caenorhabditis . A progressão da fabricação da ferramenta 'faça você mesmo' é mostrada. Estes painéis mostram (A) dois 50 mL tubo cônico caps (B) cujos centros foram removidos, (C) cortadas bordas suavizadas e (D - F) que estão equipados com tela de monofilamento, correspondente à fase de vida desejado de C. elegans (Veja o protocolo para obter detalhes). (G) a peneira concluída também é mostrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representação de imagem passo a passo do uso de peneira Caenorhabditis . (A), a peneira é pre-molhado com uma gota de solução de M9, e (B) se encaixam em cima de um tubo cónico de 50 mL. Tubo superior (C), 1 mL de M9 solução com vermes é pipetada da parte de cima da peneira, (D) um tubo cónico de 50 mL é colocado em cima da peneira com os vermes voltados para dentro do tubo e (E) a peneira com um recém-anexado é rapidamente invertido o Ver. (G) a peneira é enxaguada com M9 transportava os animais desejados para os novo 50 mL tubo e os vermes podem resolver por gravidade para o fundo do tubo. (H) os vermes são pipetados e colocados como gotas num prato fresco de NGM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caenorhabditis peneira não teve impacto motilidade durante toda vida. Esta figura mostra a distribuição de classe de motilidade dos animais nos dias 2, 4, 6 e 8 da maturidade para escolha, FUDR e grupos de tratamento Caenorhabditis peneira. Classe A animais deslocados normalmente e espontaneamente, classe B animais mudou-se anormalmente e podem ter necessário cutucando e classe C animais eram incapazes de se mover. Não houve diferença entre grupos de FUDR, picareta e peneira Caenorhabditis (p > 0,05). Três repetições (n = 10 animais por placa de tratamento) foram conduzidos e analisado com o modelo logístico Ordinal. animais de classe B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Uso de Caenorhabditis peneira não teve impacto de bombeamento da faringe durante toda a vida. Esta figura mostra as taxas de bomba da faringe de escolher, FUDR, e grupos de tratamento Caenorhabditis peneira, comparado nos dias 2, 4, 6 e 8 da vida adulta. Os asteriscos denotam um significado entre a palheta, peneira e grupos de tratamento FUDR nos dias especificados (* * * p < 0,05). Não houve diferença entre a peneira Caenorhabditis e o grupo de escolha (p > 0,05). Duas repetições (N = 10 animais por placa de tratamento) foram conduzidos e analisados com uma ANOVA One-Way e um pós-teste de Bonferroni. As barras representam a média ± erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Uso de Caenorhabditis peneira não teve impacto toque anterior resposta durante toda vida. Estes painéis mostram (A) anterior e grupos de tratamento (B) a contagem de resposta posterior toque de picareta e FUDR Caenorhabditis peneira comparado nos dias 2, 4, 6 e 8 da vida adulta. Duas repetições foram realizadas com N = 10 para cada grupo de tratamento e comparado com uma ANOVA One-Way e um pós-teste de Bonferroni (p = 0,4 e p = 0,9 para anterior e posterior, respectivamente). As barras representam a média ± erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Caenorhabditis peneira não teve impacto a quantidade de descendência viável no dia 3 de idade adulta. Esta figura mostra a descendência viável de dia-3 adultos após um período de oviposição de 24 h, abrangendo o dia 3 de idade adulta para animais progenitores. As barras representam a média ± erro padrão da média. N = 20-22 animais pelo menos duas repetições biológicas separados por grupo de tratamento. Os grupos de tratamento são comparados com um t-teste, (p > 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Caenorhabditis peneira não afetou translocação nuclear do DAF-16::GFP. Estes painéis mostram imagens representativas de translocação de grupo (A), um choque de calor (controlo positivo), grupo (B) uma picareta (controlo negativo) e o grupo de tratamento (C) um Caenorhabditis peneira DAF-16. (D) os animais no grupo controle positivo exibido uma ativação de translocação nuclear DAF-16. A peneira de Caenorhabditis não induz a uma translocação nuclear e exibido a proteína de fusão citosólica semelhante aos animais no grupo controle negativo. N = 10 animais de cada grupo de tratamento pelo menos três réplicas biológicas separados. Os grupos de tratamento foram comparados com uma One-Way ANOVA e teste post hoc de Tukey, um. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Caenorhabditis peneira não afetou a expressão de hsp16.2::gfp. As expressões de HSP-16.2 (em unidades arbitrárias de fluorescência) de um grupo de choque do calor (controlo positivo), um grupo de escolha (o controle negativo) e um grupo de tratamento Caenorhabditis peneira são comparadas. Os asteriscos denotam uma alta expressão de hsp16.2::gfp para o grupo controle positivo, que foi significativamente diferente dos outros grupos de tratamento (* * * p < 0,05). A peneira de Caenorhabditis não afetou a expressão hsp16.2::gfp e exibido as intensidades de fluorescência semelhantes aos animais no grupo controle negativo (p > 0,05). Realizaram-se três repetições com N = 10 para cada grupo de tratamento e em comparação com uma One-Way ANOVA e teste post hoc de Tukey, um. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Caenorhabditis peneira não afetou a expressão de sod-3::gfp. As expressões de SOD-3 (em unidades arbitrárias de fluorescência) de um grupo de paraquat 100 μM (controlo positivo), um grupo de escolha (o controle negativo) e um grupo de tratamento de peneira Caenorhabditis são mostradas. Os asteriscos denotam uma alta expressão de sod-3::gfp para o grupo controle positivo, que foi significativamente diferente dos outros grupos (* * * p < 0,05). A peneira de Caenorhabditis não afetou a expressão de sod-3::gfp e exibido as intensidades de fluorescência semelhantes aos animais no grupo controle negativo (p > 0,05). Realizaram-se três repetições com N = 10 para cada grupo de tratamento e em comparação com uma One-Way ANOVA e teste post hoc de Tukey, um. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tamanho de engranzamento | N = 50 | N = 100 |
| 20 μm | % de 95 e 33 centavos | |
| 50 μm | 99,00% | 93.33% |
Tabela 1: percentagem do rendimento de malhagens. Esta tabela mostra os resultados de um dispositivo de 20 μm testado com N = 50 adultos para 3 repetições e um dispositivo de 50 μm testado com N = 50 adultos para 2 repetições e com N = 100 para 3 repetições.
| Tamanho de engranzamento | Estágio do desenvolvimento | Diâmetro do corpo |
| 20 μm | Estágio larval 4 | ~ 35 μm |
| 50 μm | Dia 1 adulto | ~ 70 μm |
Tabela 2: diâmetro médio corpo. Esta tabela exibe o diâmetro médio corpo adquirido por uma média de 3 medidas igualmente distribuídas por cada worm para 15 animais em cada fase de vida medido.
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Discussion
Aqui, apresentamos o projeto e uso da peneira Caenorhabditis acessível, eficaz como uma ferramenta para classificação e mantendo o c. elegans. Esta ferramenta tem várias vantagens para escolher manualmente a animais individuais, lavando as populações, tratamentos químicos (por exemplo, FUDR) e métodos mais caros dos animais segregam. Primeiro, o Caenorhabditis peneira eficientemente e rapidamente (menos de 20 min) classifica a descendência de grandes populações mistas de animais (tabela 2). Além disso, o uso da ferramenta não tem nenhum efeito tóxico detectável na healthspan dos animais (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6), não induz estresse genética bem-descrito repórteres (Figura 7, Figura 8 Figura 9) e reduz a quantidade de estrangeiro químico que poderia influenciar o tratamento aplicado para as placas de cultura ou qualquer ensaio molecular posteriormente. Sua facilidade de uso é uma vantagem significativa; um pesquisador em qualquer fase na sua educação pode ser treinado para usá-lo (Figura 1 e Figura 2; Protocolo).
Os materiais necessários para a fabricação e o uso da peneira (por exemplo, pipetas, amortecedores) estão prontamente disponíveis em laboratórios de pesquisa padrão; assim, se quebrado, o crivo de Caenorhabditis não é caro para substituir ou reparar. A construído pela própria natureza da peneira Caenorhabditis permite que ele seja uma ferramenta versátil: ele pode ser construído com malha tamanhos apropriados para diferentes c. elegans estádios de desenvolvimento e fenótipos. A peneira de Caenorhabditis pode também ser utilizada em ensaios conduzidos em outras espécies de nematoides ou quando isolar pequenos organismos, desde o tamanho de engranzamento apropriado é usado na fabricação.
Além dos benefícios desta ferramenta fornece para manutenção de população de c. elegans , a peneira pode ser usada para limpar animais antes da sua utilização em outras aplicações experimentais. Por exemplo, com o desenvolvimento de microfluídica para conduzir o c. elegans pesquisa vem a questão do uso de chip e limpeza. Dependendo da quantidade de bactérias anexado aos animais, precauções especiais devem ser tomadas para não entupir o chip microfluídicos, tornando-o inutilizável29. Muitas vezes, quando c. elegans são transferidos para um chip microfluídicos, resíduo de gramado bacteriano é trazido com eles. Este resíduo pode e obstruir os canais microfluídicos, tornando o mau funcionamento do chip, que então requer limpeza ou substituição. A construção do dispositivo neste protocolo oferece um método para a colheita não só animais sincronizados para microfluídica, mas também para a limpeza dos animais antes da sua inserção em um dispositivo microfluidic. Removendo os detritos e resíduo bacteriano, retomada quando a coleta de animais, os canais microfluídicos são menos propensos a avaria, aumentando assim a vida operacional de fichas individuais e a taxa de transferência subsequente de pesquisas sendo realizadas com eles.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar. Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que poderia ser interpretado como um potencial conflito de interesses.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer a Heather Currey por sua contribuição inicial para o projeto de estudo e Dr. Swarup Mitra para sua revisão crítica do manuscrito. Também gostaríamos de agradecer o Dr. Michael B. Harris por comentários, refinamentos e assistência em produzir a demonstração desta metodologia. As cepas foram fornecidas pelo centro de genética Caenorhabditis, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). A pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências, do institutos nacionais da saúde sob o prêmio números UL1GM118991, TL4GM118992 ou RL5GM118990 e por um prêmio de desenvolvimento institucional (ideia) do o Instituto Nacional de General Medical Ciências do institutos nacionais da saúde sob concessão número 5P20GM103395-15. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde. UA é um AA/EO empregador e a instituição educacional e proíbe a discriminação ilegal contra qualquer indivíduo: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
References
- C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
- Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).
- Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
- Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
- Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
- Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
- Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
- Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
- Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).
- Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
- Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
