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Developmental Biology

Caenorhabditis Tamis : Un Instrument rudimentaire et une méthodologie pour le tri des petits organismes multicellulaires

Published: July 4, 2018 doi: 10.3791/58014
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 2, 5
1Department of Biology and Wildlife, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 4Departments of Biology and Chemistry, Earlham College, 5Department of Biological Sciences, College of Natural Science and Mathematics, California State University Long Beach
* These authors contributed equally

Summary

Le protocole actuel comprend une méthodologie pour le tri et le nettoyage des populations appariés selon l’âge de elegans de Caenorhabditis. Il utilise un simple, peu coûteux et un outil sur mesure efficace pour obtenir une grande population expérimentale de nématodes pour la recherche.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un organisme de modèle bien établi utilisé dans un éventail de recherche fondamentale et recherche biomédicale. Au sein de la communauté des chercheurs nématodes, on a besoin d’un moyen abordable et efficace maintenir les populations de c. elegansgrandes, appariés selon l’âge. Nous présentons ici une méthodologie pour mécaniquement tri et nettoyage c. elegans. Notre objectif est de fournir un processus rentable, efficace, rapide et simple pour obtenir des animaux de tailles uniformes et étapes de la vie pour leur utilisation dans des expériences. Cet outil, le tamis de Caenorhabditis , utilise un système de couvercle sur mesure qui fils sur commune tubes à essai conique et trie c. elegans , basé sur la taille du corps. Nous démontrons également que le tamis de Caenorhabditis transfère effectivement animaux de plaque d’une culture à une autre permettant un tri rapide, synchronisation et nettoyage sans impact sur les marqueurs de la santé, y compris de la motilité et stress-inductible journalistes de gène. Cet outil accessible et novatrice est une option rapide, efficace et non stressant pour maintenir les populations de c. elegans .

Introduction

Le ver nématode Caenorhabditis elegans, est un organisme modèle premier ministre. Outre le caractère simple et contrôlé de leur culture en laboratoire, leur génome est séquencé1 et le sort du développement de chaque cellule est connu2. En raison de ces caractéristiques, le c. elegans est un organisme modèle largement utilisé pour des études génétiques. Toutefois, avec ces caractéristiques bénéfiques viennent des défis pour les chercheurs. En raison de leur durée d’une génération rapide, des populations de c. elegans peuvent rapidement manquer de nourriture et/ou mélangées avec plusieurs générations, les populations et les stades présentent à la fois. Ainsi, les expériences réalisées sur des milieux solides nématode (NGM) nécessitent chercheurs de déplacer physiquement les animaux aux plaques de frais avant que la source de nourriture bactérienne est épuisée et développent de nouvelles larves. Cela peut être fastidieux car un transfert fréquent des animaux est nécessaire pour éviter les populations expérimentales de devenir mélangé à des générations de descendants. Pourtant, certaines expériences nécessitent tous deux un grand nombre d’animaux et de points de temps prolongée (p. ex., extraction de l’ADN ou l’ARN à l’âge adulte). Cela composés les défis de maintenant une population synchronisée avec précision et de transférer un grand nombre d’animaux.

Les méthodes actuelles de transfert c. elegans cultivés sur NGM cueillette ou laver les animaux de la plaque à la table ; traitement chimique des animaux (p. ex., avec la réplication de l’ADN inhibiteur fluorodésoxyuridine ou FUDR) ; ou à l’aide de cytométrie de flux pour trier les animaux en plaques multipuits. La cueillette implique l’utilisation d’un outil à main, réalisé avec un mince fil de platine ou un cil, de transférer manuellement particulier ou plusieurs animaux3,4. Cette méthode est précise mais exige des compétences et temps et une limitation pour les études portant sur un grand nombre d’animaux. Cueillette de mai également être physiquement préjudiciables et stressante pour les animaux en soumettant potentiellement particuliers aux montants peu naturelle et incohérentes de perturbation et de force. Lavage implique une boîte de Pétri avec une solution tampon de rinçage et transfert de la solution avec les animaux par le biais de pipette Pasteur en verre pour une nouvelle plaque de culture. Cette méthode est rapide et efficace, mais n’est pas exacte, comme plusieurs générations et des stades de développement des animaux sont transférés en vrac. Les traitements chimiques, tels que FUDR, peuvent être dissous dans les médias culture afin d’éviter la production de descendants à travers bloquant toute réplication de l’ADN et donc, le développement de la production et oeuf de gamète. Bien qu’efficace, cette méthode doit être appliquée après la maturation du développement quant à ne pas perturber les processus normales de développement, et cela signifie qu’il y a toujours une obligation de transférer les animaux avant son administration3. Cette méthode influe aussi sur les multiples cellulaires voies de signalisation, entraînant des effets notables sur les animaux en vieillissant (par exemple, une extension de la durée de vie ou une altération protéostasie) selon les souches c. elegans utilisé5, 6,7,8,9,10. Cytométrie en flux méthodes automatiquement trier et transférer des elegans de Caenorhabditis d’une plaque multipuite à un autre11. Bien que cette méthode est très efficace et efficient, équipements de cytométrie en flux est prohibitivement cher et inaccessible à beaucoup de chercheurs. Une alternative au transfert des animaux est d’utiliser des modèles de mutants qui sont sensible, tels que fer-15 et MEF-1, qui deviennent stériles avec réglage de température12la température. En utilisant des animaux mutants est utile dans certaines situations, ces souches spécifiques croissent plus lentement que les animaux sauvage et ils comptent sur un génome altéré, servant en tant que représentants de pauvres pour les vers de vieillissement ou en bonne santé. En outre, le recours à un changement de température pour provoquer la stérilité se traduit également par l’absence d’un environnement statique, et des changements de température montrent facilement influencer gène expressions13,14, 15. groupes de recherche ont été publiés techniques décrivant l’utilisation d’un maillage de filtre c. elegans taille16. Cependant, nous n’avons pu trouver des travaux précédents tests pour tout changement dans l’état de santé global qui peut être associée à l’utilisation de ces filtres.

Il faut, par conséquent, au sein de la communauté de recherche de c. elegans pour une méthode abordable, efficace, rapide et précise pour le transfert d’un grand nombre d’animaux entre les plaques de culture. Nous avons développé une pièce améliorée et accessible des équipements (nommé le tamis de Caenorhabditis ) et un protocole associé pour sa réalisation et de fonctionnement répondant aux besoins de la communauté de recherche de c. elegans . Ici, nous partageons la conception du Caenorhabditis tamis et méthodes pour son utilisation, et nous démontrer que son utilisation n’influe pas sur la santé commune ou des marqueurs de stress par rapport à la cueillette manuelle standard et un traitement avec l’usage courant, FUDR chimique privatives de fertilité.

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Protocol

1. Caenorhabditis tamis Construction et utilisation

  1. Protocole de construction
    1. Acquérir 2 couvercles de tubes coniques 50 mL (Figure 1 a).
    2. Supprimer la zone du centre à l’intérieur de la lèvre interne de la paupière (lorsqu’on regarde le fond, la Figure 1 b) à l’aide d’un bec Bunsen et une sonde de métal chaud ou un fer à souder ou en gradins de foret.
      Remarque : En utilisant la chaleur pour couper le couvercle en plastique est préférable à une lame parce qu’il y a moins de risques de blessures.
    3. Nettoyer et poncer les arêtes et recouvrir la surface avec un fichier de courbe ou une rotative (p. ex., Dremel) outil de meulage. Voir la Figure 1.
    4. Couper le cercle de la maille de monofilament au diamètre approprié (Figure 1). Pour cela, tracer un couvercle sur une feuille de maille en nylon monofilament et couper à l’intérieur de la ligne tracée.
    5. Pratiquez des rainures/fentes sur le dessus des couvercles pour améliorer l’adhérence des deux paupières lorsque la colle est appliquée à la matière plastique (Figure 1E).
    6. Nettoyer les couvercles avec de l’éthanol et les laisser sécher.
    7. Appliquer la colle cyanoacrylate sur la surface supérieure de deux couvercles, gardant au bord extérieur.
      Remarque : un peu de colle va un long chemin.
    8. Posez le filet monofilament, conformément au tableau 1, un couvercle collé (Figure 1F). Placez le deuxième couvercle inversé sur le dessus de la maille ; les deux couvercles doivent avoir leurs sommets ensemble. Appuyez fermement ensemble (Figure 1). Assurez-vous que le filet est tendu.
      Remarque : par mesure de sécurité, utilisation pince à épiler pour placer les mailles sur les couvercles.
    9. Une fois la première couche de colle est sèche, appliquer un anneau de colle cyanoacrylate autour de l’écart extérieur entre les couvercles. Soyez généreux car cela ajoute intégrité et empêche tout peeling Appart ou qui fuient.
    10. Étiqueter le filtre avec le maillage de pore de la maille de monofilament.
      NOTE : Ici, nous utilisons deux maillages pore — 20 µm et 50 µm.
  2. Protocole d’utilisation
    1. Pré mouillage le tamis.
      1. Pipeter une solution saline, comme M9 [5 g de NaCl, 6 g de Na2HPO4, 3 g de KH2PO4, 1 L d’ultrapure H2O et 1 mL de MgSO4 (1 M)]17, à travers le centre de la passoire jusqu'à ce qu’une forme de gouttelette , se condense et s’égoutte hors du centre de la partie inférieure du filtre (Figure 2 a). Éventuellement, appliquez un chiffon non pelucheux (par exemple, Kimwipe) vers le bas pour forme ou répandre une goutte de l’humidité sur le maillage.
      2. Placez le tamis sur un tube conique de 50 mL. Etiqueter le tube comme « Tube de déchets » (Figure 2 b).
    2. Laver une population de c. elegans hors un plat d’agar.
      1. Laver la plaque avec le tampon de M9 et placer le milieu contenant du ver sur le dessus de la maille de monofilament 1 mL à la fois (Figure 2). Veillez à opérer dans le centre de la maille. Laver tous les vers de la plaque.
        Remarque : En général, 3 mL de M9 pour une plaque de 60 mm est suffisant.
      2. Pour minimiser le nombre de vers perdu en pipettant également, utiliser une pipette Pasteur en verre pour déplacer les vers la plaque et sur le centre de la maille (à répéter au besoin).
      3. Rincer le filtre avec le tampon de M9 du haut. Encore une fois, assurez-vous d’exploiter dans le centre de la maille et rincer tous les vers dans ce domaine. Laver autant de fois que nécessaire pour s’assurer que toutes les bactéries et les vers plus petits ont passé à travers les mailles.
    3. Récolter les animaux de même taille de la passoire.
      1. Fixer un nouveau tube conique de 50 mL sur le dessus de la passoire, avec les vers adultes de l’étape 1.2.2.3 vers l’intérieur du nouveau tube de prélèvement (Figure 2D).
      2. Supprimer le premier tube (tube de déchets) et de retourner rapidement sur le tamis et le nouveau tube pour empêcher la migration de la goutte (Figure 2E).
        Remarque : Si la stérilité n’est pas nécessaire, utilisez un chiffon non pelucheux (par exemple, Kimwipe) au fluide de la mèche du bas de la maille avant le retournement.
      3. Rincer la maille avec M9 dans le nouveau tube de 50 mL de la nouvelle tranche (Figure 2F). Encore une fois, opèrent dans le centre de maillage et de maintenir une goutte sur le dessous de la maille.
      4. Permettre les vers à régler ou à les tourner délicatement vers le bas (par exemple, < x 16 g) pendant environ 1 min (Figure 2).
      5. Aspirer la solution tampon de la pastille de worms, idéalement à > 0,5 mL, ou éliminer autant de liquide que possible sans déranger le culot.
      6. Déposer les vers à l’aide d’une pipette Pasteur en verre sur un plat de NGM et laissez-les sécher. Espace dehors plusieurs gouttes sur une nouvelle plaque donc ils sèchent plus vite (Figure 2 H).
    4. Nettoyer le tamis.
      1. Rincer le tamis doucement et soigneusement avec de l’eau par osmose inverse et de l’éthanol. Laissez-le sécher.
      2. Conservez-la dans un récipient propre pour une utilisation ultérieure indéfinie.
      3. Jetez-les quand la maille développe un aspect de « sag ».

2. validation du tamis de Caenorhabditis méthode de tri

  1. Entretien général
    1. Pour toutes les expériences, la culture vers sur une norme de milieux de culture de nématode17 (1 L de NGM se compose de 2,5 g de peptone, 17 g d’agar-agar, 3 g de NaCl, 975 mL d’eau bidistillée, 1 mL de cholestérol 5 mg/mL, 1 mL de 1 M CaCl2 1 mL de 1 M MgSO4et 25 mL de 1 M KHPO40,5 mL de streptomycine 100 mg/mL) à 25 ° C.
  2. Administration du traitement expérimental
    1. Comparez les trois groupes de traitement : pioche, fluorodésoxyuridine (FUDR) et Caenorhabditis tamis.
      1. Pour le groupe de traitement FUDR, ajouter 100 mg/mL FUDR aux médias NGM à une concentration finale de 100 μM pour empêcher toute production de descendance et transférer les vers tous les autres jours sur une plaque NGM frais pour éviter l’épuisement de la nourriture.
      2. Pour le groupe de choix, sélectionner et transférer les vers manuellement à l’aide d’une boucle de la platine.
      3. Pour le groupe de traitement de tamis de Caenorhabditis , suivez l’étape 1.2 et pipeter les vers sur un plat de NGM.
  3. Caenorhabditis Tamisez le pourcentage de rendement
    1. Afin de quantifier le degré d’efficacité le tamis est au tri des elegans de Caenorhabditis, grandir âge-synchrone N2 animaux au jour 1 de l’âge adulte à 25 ° C (soit48 h après la ponte) et puis de les transférer par ramasser aux plaques de NGM frais (pour un total de N = 50 ou N = 100 animaux par tre Groupe de traitement).
    2. Après 24 h de récupération, transférer la population de nouvelles plaques NGM avec le tamis de Caenorhabditis précède le protocole (Voir l’étape 1.2) et compter le nombre d’animaux transféré.
    3. Calculer le pourcentage de rendement comme le rapport entre le nombre d’animaux transférés par rapport au nombre de départ au début du transfert multiplié par 100 (%).
  4. Tests de Healthspan
    NOTE : Score healthspan paramètres de la classe de motilité, du taux de la pompe du pharynx et la partie antérieure et la réponse de douceur postérieur les jours 2, 4, 6 et 8 de l’âge adulte pour synchronisé âge N2 animaux maintenus à 25 ° C.
    1. Suivi de la motilité
      1. Affecter des scores de motilité basées sur un système basé sur des classes (classes A, B et C) suivre les méthodes de Herndon et al. 18. comparer les effets des trois groupes expérimentaux à l’aide d’un modèle statistique logistique ordinal dans le logiciel d’analyse statistique.
        NOTE : Individus de classe A se déplacent spontanément dans un modèle normal, sinusoïdal. Catégorie B personnes se déplacent en mouvements nettement non sinusoïdales et nécessitent insistance pour encourager le mouvement. Catégorie C personnes passer leur tête ou la queue en réponse à l’insistance mais ne peuvent pas se déplacer librement dans la gélose.
    2. Taux de pompe du pharynx
      1. Compter le mouvement moulin du bulbe pharyngien terminal de l’animal visuellement sous un stéréomicroscope à un 600 X grossissement final pendant 1 min.
      2. Effectuer une analyse statistique avec une ANOVA à α = 0,05 et post-tests de Bonferroni avec α = 0,05.
    3. Réponse de Touch
      1. Enregistrer une réponse de douceur et de comparer entre les trois groupes de traitement. Effectuer les tests basés sur les méthodes décrites par Calixto et al. 19.
      2. Enregistrement de la partie antérieure et postérieure touchent réponse par doucement caresser un prélèvement de cil perpendiculairement sur la queue ou la tête (5 x de chaque, alternant tête et queue) des animaux.
      3. Marquer tout mouvement dans la direction opposée du trait que 1 point sur une échelle de 0 à 5 pour la partie antérieure et la réponse postérieure.
      4. Effectuer une analyse statistique avec une ANOVA à α = 0,05 et post-tests de Bonferroni avec α = 0,05.
  5. Dosage de la fécondité
    1. Pour déterminer l’utilisation de l’impact de la passoire Caenorhabditis sur la reproduction, croissance âge-synchrone N2 animaux jour 2 de l’adulte à 25 ° C.
    2. 60 h après oeuf allongé, transférer les animaux aux nouvelles plaques NGM avec une pioche de platine ou le tamis de Caenorhabditis et donnez-leur 4 h pour récupérer (sécher les plaques tamisées pendant 20 à 30 min).
    3. Après récupération, individuellement plaque les animaux via un cil pick aux plaques de NGM, donnez-leur 24h pour pondre des œufs et enlever les animaux. Permettre la descendance sur chaque plaque de développer dans des conditions normales pour une autre 24h à 25 ° C.
      Remarque : Un prélèvement de cil est un cil humain fixés à l’extrémité de la pipette Pasteur avec vernis à ongles et stérilisé avec de l’éthanol.
    4. Compter le nombre d’individus de génération F1 viables. Effectuer une analyse statistique en utilisant un test T avec α = 0,05.
      Remarque : Une descendance Viable est considérés comme les œufs qui éclosent et commencent leur développement à travers les cycles réguliers de larves avec succès.
  6. Essais de réponse stress journaliste fluorescent
    1. Effectuer trois essais journaliste fluorescents couramment utilisés pour détecter des marqueurs potentiels du stress : une translocation de DAF-16::GFP dans les noyaux des cellules dans une souche [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP ; rol-6)]20; une expression de hsp-16,2 [TJ375-gpIs1 (PIH-16.2p::GFP)]21; et une expression de sod-3 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.
    2. Pour chaque série de tests, de la culture âge-synchrone animaux en provenance des trois groupes de traitement à 20 ° C et les examiner au 3e jour de vie adulte : utiliser un contrôle négatif (sur une base quotidienne, transférer un groupe d’animaux manuellement avec une pioche de platine), un contrôle positif (sur une base quotidienne transfert d’un groupe d’animaux manuellement avec une pioche de platine, plus un facteur de stress établi) et le tamis de Caenorhabditis (passer les animaux à travers le tamis et laissez-les se rétablir pendant 30 min sur NGM juste avant l’imagerie).
    3. Dans le test DAF-16::GFP, chaleur choquer les animaux témoins positifs à 37 ° C pendant 30 min avant l’imagerie20. Pour le dosage de hsp-16,2, chaleur choquer les animaux témoins positifs pendant 90 min, 20 h avant d’imagerie21. Pour le dosage de la sod-3, traiter les animaux de contrôle positif avec le paraquat 100 mM pendant 4 h avant l’imagerie22.
    4. Récolter les vers immédiatement avec un prélèvement de CIL et montez-les sur un lamelle couvre-objet avec 1 μl d’une solution de surfactant 407 poloxamer 36 % pour immobiliser les vers.
    5. "Sandwich" les vers monté avec une autre lamelle. Montez les deux lamelles couvre-objet à une image et une lame de microscope de verre standard les vers en utilisant un grossissement 8 X sur un microscope inversé à fluorescent (pour un grossissement total de 80 X) et une exposition constante avec un filtre FITC.
    6. Pour détecter des différences entre les trois groupes dans le test DAF-16::GFP, classer les animaux selon l’emplacement du reporter DAF-16::GFP (nucléaire si le journaliste transloqué aux noyaux, cytosoliques si le journaliste situé dans le cytosol et le cas intermédiaire le journaliste, situé dans les noyaux et le cytosol).
    7. Comparer les résultats en utilisant un modèle statistique de logistique ordinal dans le logiciel d’analyse statistique. Pour le PIH-16.2 et les dosages de sod-3 expression, utilisez une ANOVA à α = 0,05 et tests de post hoc de Tukey avec α = 0,05 pour comparer la fluorescence totale de la région céphalique.

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Representative Results

Le tamis de Caenorhabditis se compose de 2 cache-vis, sécuriser une zone de maille de monofilament de nylon tissé inférieur au diamètre du corps de l’âge du développement souhaité, utilisé pour extraire des populations vivantes d’organismes à l’aide d’une technique simple lavage. Il s’adapte sur les tubes coniques standards et utilise l’écran grillagé pour trier mécaniquement les animaux par diamètre de corps, en laissant les animaux souhaitées dans le tube prêt à davantage de maintenance et d’expérimentation (p. ex., transfert ou récolte génétique). Un manuel doux lavage avec le tamis de Caenorhabditis est rapide, environ 5 min par plaque de 60 à 100 mm et les organismes sont facilement récupéré de la maille.

Pourcentage de rendement des animaux suite Caenorhabditis Utiliser des tamis
Pour établir le pourcentage de rendement de la passoire de Caenorhabditis , dispositifs ont été testés avec 20 μm et 50 mailles de pores μm sur des animaux adultes. A dire le rendement d’une > transfert animal réussi 90 % a été enregistrée par les deux maillages testés (tableau 1).

Monofilament de maillage avec la taille différente les lacunes peuvent être utilisées pour séparer les animaux des différents stades de vie. Maillage avec 20 μm lacunes est appropriée pour le lavage loin développement d’embryons et les larves plus petites que le quatrième stade larvaire, conservant ce dernier (L4 ; avec un diamètre de corps moyen de 32 μm) et tous les animaux dans les derniers stades de la vie, tandis que la maille avec 50 μm lacunes permettra à tous les autres formes de vie met en scène en dehors de l’adulte (d’un diamètre de corps moyen de 70 μm) pour être emportés (tableau 2).

Caenorhabditis Utilisation de tamis n’impacte pas métrique healthspan
Motilité : Chez c. elegans , le mouvement sinusoïdal normal (c'est-à-dire, la motilité) diminue avec l’âge de18 ans et est un marqueur de l’état de santé général. Pour déterminer si le tamis de Caenorhabditis influencé la motilité, scores de motilité ont été comparés pour un enlèvement, FUDR et tamis de Caenorhabditis groupes de traitement jours 2, 4, 6 et 8 de l’âge adulte. Tous les animaux dans chaque groupe (n = 10/groupe) présentaient des déplacements normaux et spontanée (catégorie A) à plusieurs âges tout au long de l’âge adulte (jours 2, 4, 6 et 8 de l’âge adulte ; p > 0,05 pour les comparaisons multiples tous les jours, Figure 3).

Taux de pompe pharyngée : La capacité des muscles pharyngés c. elegans à la pompe diminue avec l’âge et est un biomarqueur de healthspan23. Pour déterminer si le tamis de Caenorhabditis influencé l’animal taux pompe pharyngée, pioche, FUDR et Caenorhabditis tamis traitement groupes ont été comparés les jours 2, 4, 6 et 8 de l’âge adulte (n = 8 à 10 par groupe). Il y avait une différence significative entre les animaux qui ont subi le prélèvement et les méthodes FUDR sur 6 jours (p < 0,001) et 8 (p < 0,001). Aussi, il y avait une différence significative entre les tamis et les groupes FUDR sur 6 jours (p < 0,001) et le 8e jour de l’âge adulte (p < 0,001). Cependant, il n’y avait aucune différence statistiquement significative entre le prélèvement et les groupes de tamis de Caenorhabditis pour n’importe quel jour (p > 0,05, Figure 4), ce qui indique que le tamis n’influe pas sur cette mesure de healthspan.

Douceur réponse : Réponse aux stimulus mécanique est un marqueur physiologique pour évaluer le vieillissement ou générales Santé24,25; ainsi, l’impact des méthodes de transfert différentes sur la partie antérieure et postérieure douceur réponses ont été testés. Il n’y avait aucune différence statistiquement significative entre le prélèvement et FUDR Caenorhabditis tamisez les groupes de traitement (n = 8/groupe), soit vers l’avant ou vers l’arrière, pour une journée d’essais (p > 0,4 pour toutes les comparaisons ; Figure 5 a et 5 b).

La fécondité : Pour établir si oui ou non le tamis de Caenorhabditis influencé la quantité de progéniture viable c. elegans, la progéniture individuelle produite dans un délai de 24h au cours de la journée 3 de l’âge adulte a été compté et comparé (n = 20 à 22 par groupe). L’utilisation de la passoire Caenorhabditis ne n’a pas influé sensiblement le nombre de progéniture, par rapport à un groupe de traitement de choix (p = 0,61, Figure 6).

Tests moléculaires journaliste
Translocation nucléaire DAF-16 : Chez c. elegans, l’activation du facteur de transcription DAF-16 est associée à une augmentation du stress résistance26. La localisation nucléaire de DAF-16 a été étudiée chez une souche de nématode transgénique TJ356, qui exprime le DAF-16 fusionné à une protéine fluorescente verte (DAF-16::GFP)20. Dans des conditions de croissance normale, DAF-16::GFP est localisé principalement dans le cytosol, mais sous différents facteurs de stress (p. ex., stress thermique), il est rapidement transloqué dans le noyau de20. Pour tester l’impact du tri avec le tamis de Caenorhabditis sur DAF-16 translocation, DAF-16::GFP localisations ont été comparées au même âge jour 5 adultes dans un groupe témoin positif (stress thermique), un groupe de contrôle négatif (transfert manuelle par l’intermédiaire de choix), et un groupes de traitement de tamis de Caenorhabditis (n = 10/groupe). Le transfert avec le tamis de Caenorhabditis n’affectait pas la translocation nucléaire du DAF-16::GFP et a montré un phénotype similaire aux animaux témoin négatif (p > 0,05, Figure 7).

HSP-16,2 journaliste : protéines de choc thermique petit comme HSP-16,2 sont des biomarqueurs d’une réaction de stress, et ils sont fortement exprimés au cours d’une exposition à un choc thermique ou de stress oxydatif agents21,27. Le TJ375 possède un gène rapporteur GFP fusionné avec un promoteur de hsp-16,2 qui n’est pas actif dans le cadre des conditions normales,21. Cependant, après une exposition à un choc thermique, expression de la protéine HSP-16,2 est induite et les animaux affichent des niveaux élevés de GFP expression21. Pour tester l’implication de la passoire Caenorhabditis sur une réaction de stress HSP-16,2-négociée, la densité de fluorescence dans la région du pharynx (n = 10 animaux/groupe) d’animaux de même âge a été comparée chez les adultes de jour-5 entre un groupe témoin positif (chaleur le stress), un négatif contrôle groupe (cueillette) et un groupe de traitement de Caenorhabditis tamis. Le transfert avec le tamis de Caenorhabditis n’induisait pas significativement l’expression de HSP-16.2::GFP (PIH-16.2::gfp) par rapport au témoin négatif (p > 0,05, Figure 8).

SOD-3 journaliste : Chez c. elegans, le gène anti-oxidant qui code pour la superoxyde dismutase (SOD-3) de 3 est régulée au cours du stress oxydatif,28. La souche de c. elegans CF1553 exprime la protéine fluorescente verte (GFP)-étiqueté promoteur de SOD-3, dont l’expression est induite par le stress oxydatifs, comme le paraquat5. Pour tester l’implication de la passoir de Caenorhabditis tri sur la réponse antioxydante chez c. elegans, la densité de fluorescence dans la région céphalique d’appariés selon l’âge des adultes de jour-5 a été comparée entre une population témoin positif (paraquat 100 μM traitement), une population témoin négatif (cueillette manuelle) et un Caenorhabditis population transférée au tamis. Le transfert avec le tamis de Caenorhabditis n’induisait pas significativement l’expression de sod-3::gfp par rapport au témoin négatif (p > 0,05, Figure 9).

Figure 1
Figure 1 : Construction de tamis Caenorhabditis . La progression de la fabrication de « bricolage » de l’outil s’affiche. Ces panneaux montrent (A) deux 50 mL tube à fond conique casquettes (B) dont les centres ont été supprimées, (C) couper les bords lissés et (D - F) qui sont équipés d’un filet monofilament correspondant au stade de la durée de vie désirée de C. elegans (pour plus de détails, voir le protocole ). (G) le tamis rempli est aussi indiqué. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Représentation de l’image étape par étape d’utilisation de tamis de Caenorhabditis . (A), le tamis est pré mouillé avec une goutte de solution de M9, et (B) fixer sur le dessus un tube conique de 50 mL. Tube supérieur (C), 1 mL de solution avec worms est reversée sur le dessus de la passoire, (D) un tube conique de 50 mL est placé au dessus de la passoire avec les vers l’intérieur du tube et (E), le tamis avec un nouveau joint de M9 est rapidement renversé o ver (G) le tamis est rincé avec M9 transportant les animaux souhaitées dans le nouveau 50 mL tube et les vers sont autorisés à s’installer par gravité vers le fond du tube. (H) les vers sont reversés et placés sous forme de gouttelettes sur une plaque NGM fraîche. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Tamis de Caenorhabditis n’avait aucune incidence motilité tout au long de la durée de vie. Cette figure illustre la répartition des classes motilité des animaux au jour 2, 4, 6 et 8 de l’âge adulte pour un enlèvement, FUDR et les groupes de traitement Caenorhabditis tamis. Animaux de catégorie A s’installe normalement et spontanément, classe B animaux déplacés anormalement et peut-être demander une certaine insistance et animaux de la classe C ont été incapables de se déplacer. Il n’y avait pas de différence entre Caenorhabditis tamis, piolet et groupes FUDR (p > 0,05). Trois répétitions (n = 10 animaux par plaque de traitement) ont été menées et analysées avec le modèle logistique Ordinal. animaux de la classe B. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Utilisation de tamis de Caenorhabditis n’avait aucune incidence pharyngée pompage tout au long de la durée de vie. Cette figure montre les taux de pompe pharyngiennes de pick, FUDR, et groupes de Caenorhabditis tamis de traitement, par rapport aux jours 2, 4, 6 et 8 de l’âge adulte. Les astérisques indiquent une signification entre le prélèvement, tamis et groupes de traitement FUDR pour les jours spécifiés (*** p < 0,05). Il n’y avait aucun différence entre le tamis de Caenorhabditis et le groupe de choix (p > 0,05). Deux répétitions (N = 10 animaux par plaque de traitement) ont été menées et analysées avec une ANOVA à et un post-test de Bonferroni. Les barres représentent la moyenne ± l’écart-type de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Utilisation de tamis de Caenorhabditis n’avait aucune incidence antérieure touch réponse tout au long de la durée de vie. Ces panneaux montrent (A) la partie antérieure et les groupes de traitement (B), le comte de réponse tactile postérieure de pioche, FUDR et Caenorhabditis tamis par rapport aux jours 2, 4, 6 et 8 de l’âge adulte. Deux répétitions ont été menées avec N = 10 pour chaque groupe de traitement et par rapport à une ANOVA à et un post-test de Bonferroni (p = 0,4 et p = 0,9 pour antérieur et postérieur, respectivement). Les barres représentent la moyenne ± l’écart-type de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Caenorhabditis tamis n’avait aucune incidence le montant de la progéniture viable le jour 3 de l’âge adulte. Ce chiffre montre une descendance viable d’adultes de jour-3 après une période de Ponte 24h, s’étendant sur jour 3 de l’âge adulte pour animaux parents. Les barres représentent la moyenne ± l’écart-type de la moyenne. N = 20-22 animaux depuis au moins deux réplicats biologiques séparés par groupe de traitement. Les groupes de traitement sont comparées avec un t-test, (p > 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Caenorhabditis tamis n’affecte pas la translocation nucléaire du DAF-16::GFP. Ces panneaux montrent des images représentatives de la translocation de DAF-16 du groupe (A), un choc thermique (contrôle positif), (B) un choix de groupe (contrôle négatif) et groupe de traitement (C) un Caenorhabditis tamis. (D) les animaux dans le groupe témoin positif affichent une activation de la translocation nucléaire DAF-16. Le tamis de Caenorhabditis n’induit pas une translocation nucléaire et affiche des protéines cytosoliques fusion similaire aux animaux dans le groupe témoin négatif. N = 10 animaux par groupe de traitement d’au moins trois réplicats biologiques distinctes. Les groupes de traitement ont été comparées à une ANOVA à et test post hoc d’une de Tukey. Echelle = 100 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Caenorhabditis tamis n’affecte pas l’expression de hsp16.2::gfp. Les expressions de HSP-16,2 (en unités arbitraires fluorescence) d’un groupe de choc thermique (contrôle positif), un groupe de choix (le témoin négatif) et un groupe de traitement Caenorhabditis tamis sont comparées. Les astérisques indiquent une forte expression de hsp16.2::gfp pour le groupe témoin positif qui différait sensiblement des autres les groupes de traitement (*** p < 0,05). Le tamis de Caenorhabditis n’affectait pas l’expression hsp16.2::gfp et affichent les intensités de fluorescence semblables à des animaux dans le groupe témoin négatif (p > 0,05). Trois répétitions ont été menées avec N = 10 pour chaque groupe de traitement et par rapport à une ANOVA à et test post hoc d’une de Tukey. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Caenorhabditis tamis n’affecte pas l’expression de sod-3::gfp. Les expressions de SOD-3 (en unités arbitraires fluorescence) d’un groupe de paraquat 100 μM (contrôle positif), un groupe de choix (le témoin négatif) et un groupe de traitement Caenorhabditis tamis sont indiquées. Les astérisques indiquent une forte expression de sod-3::gfp pour le groupe témoin positif qui ne différait des autres groupes (*** p < 0,05). Le tamis de Caenorhabditis n’affectait pas l’expression de sod-3::gfp et affichent les intensités de fluorescence similaires aux animaux dans le groupe témoin négatif (p > 0,05). Trois répétitions ont été menées avec N = 10 pour chaque groupe de traitement et par rapport à une ANOVA à et test post hoc d’une de Tukey. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Grosseur de maille N = 50 N = 100
20 μm 95,33 %
50 μm 99.00 % 93,33 %

Tableau 1 : pourcentage de rendement des maillages. Ce tableau présente les résultats d’un dispositif de 20 μm testé avec N = 50 adultes pour 3 répétitions et un dispositif de 50 μm testé avec N = 50 adultes pour 2 répétitions et avec N = 100 pour 3 répétitions.

Grosseur de maille Stade de développement Diamètre du corps
20 μm Stade larvaire 4 ~ 35 μm
50 μm Jour 1 adulte ~ 70 μm

Tableau 2 : diamètre moyen du corps. Ce tableau indique le diamètre moyen du corps acquis par une moyenne de 3 mesures également répartis sur chaque ver pour 15 animaux à chaque étape de vie mesurée.

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Discussion

Ici, nous avons introduit la conception et l’utilisation de la passoire de Caenorhabditis accessible, efficace comme un outil pour le tri et le maintien de c. elegans. Cet outil présente plusieurs avantages à choisir manuellement chaque animal, le lavage des populations, des traitements chimiques (p. ex., FUDR) et des méthodes plus coûteuses d’animaux en ségrégation. Tout d’abord, le Caenorhabditis tamis efficacement et rapidement (moins de 20 min) trie les descendances de grandes populations mixtes d’animaux (tableau 2). En outre, l’utilisation de l’outil n’a aucun effet toxique détectables sur healthspan de l’animal (Figure 3, Figure 4, Figure 5, Figure 6), n’induit pas de stress génétique bien décrits reporters (Figure 7, Figure 8 Figure 9) et réduit la quantité de substance étrangère susceptible d’influencer le traitement appliqué à des plaques de culture ou de n’importe quel test moléculaire par la suite. Sa facilité d’utilisation est un avantage significatif ; un chercheur à tout stade de leur formation peut être formé pour l’utiliser (Figure 1 et Figure 2; Protocol).

Le matériel nécessaire à la fabrication et l’utilisation du filtre (par exemple, pipettes, tampons) est facilement disponible dans les laboratoires de recherche standard ; ainsi, si cassé, le tamis de Caenorhabditis n’est pas cher pour remplacer ou réparer. La nature se construite de la passoire Caenorhabditis lui permet d’être un outil polyvalent : il peut être construit avec des grosseurs de maille appropriées pour différents c. elegans phénotypes et les stades de développement. Le tamis de Caenorhabditis peut également être utilisé lors d’essais effectués chez d’autres espèces de nématodes ou isoler des petits organismes, fournis la grosseur de maille se heurte-t-elle à la fabrication.

En plus des avantages, cet outil fournit pour l’entretien de la population de c. elegans , le tamis peut être utilisé pour nettoyer les animaux avant leur utilisation dans d’autres applications expérimentales. Par exemple, avec le développement de la microfluidique de mener c. elegans recherche vient la question de l’utilisation de la puce et le nettoyage. Selon la quantité de bactéries attachées aux animaux, des précautions spéciales doivent être prises de manière à ne pas obstruer la puce microfluidique, rendant inutilisable29. Souvent quand c. elegans sont transférés à une puce microfluidique, résidu de la pelouse bactérienne est apporté avec eux. Ce résidu peut et obstrue les canaux microfluidiques, faisant de la panne de puce, qui nécessite ensuite un nettoyage ou remplacement. La construction de l’appareil dans le présent protocole propose une méthode de récolte non seulement les animaux synchronisé pour la microfluidique, mais aussi pour nettoyer les animaux avant leur insertion dans un dispositif microfluidique. En enlevant les débris et les résidus bactériens, repris lors de la collecte des animaux, les canaux microfluidiques sont moins enclines à mal fonctionner, ce qui augmente la durée de vie des puces individuelles et le débit ultérieur de recherche menés avec eux.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer. Les auteurs déclarent que la recherche a été effectuée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprété comme un conflit d’intérêts potentiel.

Acknowledgments

Les auteurs aimeraient remercier Heather Currey pour sa première contribution à la conception de l’étude et m. Swarup Mitra pour son examen critique du manuscrit. Nous tenons également à remercier le Dr. Michael B. Harris de commentaires, de raffinements et d’assistance dans la production de la démonstration de cette méthodologie. Les souches ont été fournis par le centre de génétique de Caenorhabditis, qui est financé par le NIH Office de programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440). La recherche rapportée dans cette publication a été financée par le National Institute Of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health, sous attribution numéros UL1GM118991, TL4GM118992 ou RL5GM118990 et par une bourse de développement institutionnel (IDeA) de le National Institute of General Medical Sciences de la National Institutes of Health, sous concession numéro 5P20GM103395-15. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health. UA est une institution éducative et un employeur AA/EO et interdit toute discrimination illégale contre n’importe quel individu : www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Safety glasses Uline S-21076
Protective heat resistant glove Grainger Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube Falcon 14-432-22
Synthetic Nylon mesh Dynamic
Aqua-Supply Ltd		 NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue Scotch Super Glue Liquid SAD114
Pliers Vampliers VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file Lowe's Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR Sigma F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)  Sigma  S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127 Sigma P2443
Paraquat dichloride hydrate Sigma 36541
Inverted fluorescence microscope Olympus FSX100

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References

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Biologie du développement numéro 137 Caenorhabditis elegans tri transfert synchronisation rapide et accessible
<em>Caenorhabditis</em> Tamis : Un Instrument rudimentaire et une méthodologie pour le tri des petits organismes multicellulaires
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Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms. J. Vis. Exp. (137), e58014, doi:10.3791/58014 (2018).

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