Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Caenorhabditis נפה:, מכשיר low-tech ו מתודולוגיה לצורך מיון אורגניזמים רב תאיים קטנים

Published: July 4, 2018 doi: 10.3791/58014
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 2, 5
1Department of Biology and Wildlife, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 4Departments of Biology and Chemistry, Earlham College, 5Department of Biological Sciences, College of Natural Science and Mathematics, California State University Long Beach
* These authors contributed equally

Summary

בפרוטוקול הנוכחי כולל מתודולוגיה מיון וניקוי של אוכלוסיות תואם גיל Caenorhabditis elegans. הוא משתמש פשוטה, זולה, והכלי בהזמנה אישית יעילה להשגת ניסיוני אוכלוסיה גדולה של נמטודות למחקר.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא אורגניזם מודל ומבוססת נעשה שימוש במגוון של מחקר ביו-רפואי בסיסי. בתוך קהילת המחקר נמטודות, יש צורך דרך במחיר נוח ויעיל לשמור על אוכלוסיות גדולות, מתאימים לגיל של C. elegans. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה מכנית מיון וניקוי C. elegans. המטרה שלנו היא לספק תהליך חסכוני, יעיל, מהיר ופשוט לקבל בעלי חיים הגדלים אחיד, שלבי החיים לשימוש שלהם בניסויים. כלי זה, מסננת Caenorhabditis , משתמש במערכת המכסה לפי הזמנה זה חוטים אל צינורות מעבדה חרוט נפוצות וממיין C. elegans בהתאם לגודל הגוף. אנחנו גם להוכיח כי המסננת Caenorhabditis ביעילות העברת חיות של תרבות אחת צלחת מתן אפשרות נוספת עבור מיון מהיר, סנכרון וניקוי מבלי להשפיע על סמנים של בריאות, כולל תנועתיות, מתח-inducible ג'ין כתבים. כלי נגיש, חדשני זה הוא אפשרות מהיר, יעיל, ומלחיץ לשמירה על אוכלוסיות C. elegans .

Introduction

התולעת נמטודות Caenorhabditis elegans, הוא אורגניזם מודל premier. בנוסף הטבע ישיר ומבוקר של הטיפוח-תרגול במעבדה, הגנום כולו שלהם הוא ברצף1 , גורל כל תא התפתחותית ידוע2. בשל תכונות אלה, C. elegans הוא אורגניזם מודל נפוץ מחקרים גנטיים. עם זאת, יחד עם תכונות מועילות אלה באים כמה אתגרים לחוקרים. בשל מזמנם דור מהירה, C. elegans אוכלוסיות יכול לרוץ במהירות האוכל ו/או מעורב אוכלוסיות עם דורות מרובים, בשלבים התפתחותיים להציג בו-זמנית. לפיכך, ניסויים שבוצעו במדיה צמיחה נמטודות מוצק (NGM) דורשים חוקרים להעביר פיזית חיות ללוחות טרי, לפני מכלה מקור המזון חיידקי ולפתח הזחלים חדש. זה יכול להיות מייגע כמו העברת תכופים של החיות נחוצה כדי למנוע האוכלוסיות ניסיוני החל להיות מעורב עם הצאצאים דורות. ובכל זאת, ניסויים דורשים שני מספרים גדולים של בעלי חיים ושל נקודות זמן ממושך (למשל, מיצוי DNA או RNA בבגרות). זה תרכובות האתגרים של שמירה על אוכלוסיה מסונכרן באופן מדויק והעברת מספרים גדולים של בעלי חיים.

שיטות של העברת C. elegans תרבותי על NGM איסוף או לרחוץ את החיות צלחת על צלחת; כימי בטיפול החיות (למשל, עם fluorodeoxyuridine מעכב שכפול ה-DNA או FUDR); או באמצעות cytometry זרימה כדי למיין חיות לוחיות רב טוב. איסוף כרוכה בשימוש כלי יד, עשה עם חוט דק פלטינה או עפעף, להעביר באופן ידני אדם או בעלי חיים מרובים3,4. בשיטה זו הוא מדויק אבל דורש מיומנות והן זמן והוא מגבלה על מחקרים שכללו מספר גדול של בעלי חיים. איסוף מאי גם, להיות פיזית מזיק ומלחיץ החיות במינים יחידים פוטנציאל לכמויות לא טבעי ולא עקבית של הפרעה וכוח. כביסה כרוך שטיפה לצלחת תרבות עם פתרון מאגר העברת הפתרון עם בעלי החיים דרך זכוכית פסטר פיפטה צלחת תרבות חדשה. שיטה זו מהירה ויעילה אך אינה מדויקת כמו דורות מרובים, בשלבים התפתחותיים של בעלי חיים מועברים בצובר. טיפולים כימיים, כגון FUDR, יכול להיות מומס בתקשורת culturing כדי למנוע את הייצור של הצאצאים באמצעות חסימת כל שכפול ה-DNA, וכך, פיתוח ייצור וביצה תא רבייה. בעוד יעיל, בשיטה זו יש להחיל לאחר ההבשלה התפתחותית עד כדי לא לשבש את תהליכי התפתחותי נורמלי, וזה אומר שעדיין יש דרישה להעביר את החיות לפני שלה מינהל3. שיטה זו גם השפעות מרובות הסלולר מסלולי איתות, וכתוצאה מכך מורגשת ההשפעה על החיות כשהם מזדקנים (למשל, סיומת תוחלת החיים או פרוטוסטאזיס שינו) בהתאם המתח של C. elegans בשימוש5, 6,7,8,9,10. שיטות cytometry זרימה אוטומטית למיין, להעביר בודדים C. elegans לוח רב טוב אחד עוד11. בעוד ששיטה זו הוא מאוד אפקטיבי ויעיל, ציוד cytometry זרימה הוא יקר and נגישים לחוקרים רבים. אלטרנטיבה העברת בעלי חיים היא להשתמש מוטציה בדגמי טמפרטורה רגיש, כגון fer-15 ו- פמ-1, אשר הופכים סטרילי עם התאמת הטמפרטורה12. בזמן השימוש חיות מועיל במצבים מסוימים, זנים מסוימים אלו גדלים לאט יותר פראי-סוג חיות והן מסתמכות על הגנום השונה, המגישה כנציגים המסכן לתולעים הזדקנות או בריאה. בנוסף, ההסתמכות על שינוי טמפרטורה לזירוז עקרות שתוצאת גם בהיעדר סביבה סטטי, שינויי טמפרטורה הוכחו ברצון להשפיע על ג'ין ביטויים13,14, 15. קבוצות מחקר בעבר פורסמו טכניקות המתאר את השימוש רשת שינוי כדי לסנן C. elegans לפי גודל16. עם זאת, היינו מסוגלים למצוא עבודה קודמות בדיקה עבור כל שינוי תוצאות בריאותיות הכוללת שעשויים להיות מזוהה עם השימוש של מסננים כאלה.

לפיכך, יש צורך בתוך קהילת המחקר C. elegans שיטה במחיר נוח, יעיל, מהיר, ו מדויק עבור העברת מספרים גדולים של בעלי חיים בין תרבות צלחות. פיתחנו כלי של שיפור, נגיש של ציוד (בשם המסננת Caenorhabditis ), פרוטוקול המשויך עבור שלה ייצור ותפעול העונים על הצרכים של קהילת המחקר C. elegans . במסמך זה, אנחנו חולקים את העיצוב של מסננת Caenorhabditis והשיטות לשימושו, נדגים את השימוש בו לא משפיע על בריאות נפוצות או כל אחד מסמני מתח כאשר לעומת איסוף ידני רגיל וטיפול עם הנפוצות, פוריות-הגבלת FUDR כימי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Caenorhabditis מסננת בנייה ושימוש

  1. פרוטוקול בנייה
    1. רוכשים 2 מכסים משפופרות חרוט 50 מ ל (איור 1 א').
    2. להסיר את האזור מרכז בתוך השפה הפנימית של הכיסוי (כאשר צפו התחתון, איור 1B) באמצעות מבער בונזן, מכשיר בדיקה מתכת חמה או במלחם או דרך המקדחה.
      הערה: שימוש בחום כדי לחתוך את מכסה פלסטיק עדיפה על להב כי יש פחות סיכון של פציעה.
    3. לנקות לשייף את הקצוות לחתוך, להתעלות על פני השטח עם קובץ מעוקל או של רוטרי טחינת כלי (למשל, Dremel). ראה איור 1C.
    4. חותכים את מעגל monofilament רשת השינוי עד לקוטר המתאים (איור 1D). בשביל זה, לאתר את מכסה על גבי גיליון monofilament רשת ניילון וחותכים בתוך קו שצויר.
    5. חותכים חריצים/חתכים המשטח העליון של הכיסוי כדי לשפר את הידבקות של הכיסוי שני דבק מוחל על הפלסטיק (איור 1E).
    6. לנקות את המכסים עם אתנול ולתת להן להתייבש.
    7. דבק cyanoacrylate חלות על המשטח העליון של שני העפעפיים, שמירה על הקצה החיצוני.
      הערה: דבק קטן עובר דרך ארוכה.
    8. שכב monofilament רשת השינוי, על פי טבלה 1, על המכסה מודבק אחד (איור 1F). המקום השני המכסה הפוך על גבי רשת השינוי; מכסים שני חייב להיות מקסימום שלהם יחד. לחץ בחוזקה יחד (איור 1 ג'י). ודא רשת השינוי מתוח.
      הערה: כאמצעי בטיחות, שימוש פינצטה כדי למקם את רשת השינוי העפעפיים.
    9. לאחר השכבה הראשונית של הדבק התייבש, להחיל טבעת של דבק מגע דבק מסביב הפער החיצוני בין עפעפיו. להיות נדיב כמו זה מוסיף שלמות ומונעת כל פילינג בנפרד או דולף.
    10. תווית את המסנן עם רשת שינוי גודל הנקבוביות monofilament רשת השינוי.
      הערה: כאן, אנו משתמשים בשני גדלים נקבובית רשת — 20 מיקרומטר ו 50 מיקרומטר.
  2. השתמש בפרוטוקול
    1. טרום רטוב המסננת.
      1. Pipette של תמיסת מלח, כגון M9 [5 g של NaCl, 6 גרם של נה2HPO4, דור 3 של ח'2PO4, 1 L של הנדסה גנטית H2O ו- 1 מ"ל של MgSO4 (1 מ')]17, דרך מרכז המסננת עד טפסים droplet , וידחוס ולאחר נוטפת את המרכז של מסנן התחתון (איור 2 א). באופן אופציונלי, החל נטולת מגבון (כגוןKimwipe) לתחתית לצורה או להפיץ droplet לחות על רשת השינוי.
      2. מניחים המסננת מעל צינור חרוטי 50 מ. לתייג את הצינור כמו 'צינור פסולת' (איור 2B).
    2. רחץ אוכלוסיה של C. elegans את צלחת אגר.
      1. לשטוף את הצלחת עם המאגר M9 ומניחים המדיום המכיל תולעת על למעלה של monofilament רשת השינוי 1 מ"ל במועד (איור 2C). הקפד לפעול במרכז של רשת השינוי. לשטוף את כל התולעים מהצלחת.
        הערה: בדרך כלל, 3 מ"ל של M9 לצלחת 60 מ מ מספיקה.
      2. כדי למזער את מספר תולעים שקוע pipetting, להשתמש כוס פסטר פיפטה כדי להזיז את התולעים רלוונטי ו על המרכז רשת (החזרה לפי הצורך).
      3. יש לשטוף את המסנן עם המאגר M9 מלמעלה. שוב, ודא פועלים במרכז של רשת השינוי ולשטוף את כל התולעים באזור זה. רחץ פעמים רבות ככל שנדרש על מנת להבטיח כי כל חיידקים, תולעים קטנות עבר דרך רשת השינוי.
    3. הקציר החיות מתאימים לגודל של המסננת.
      1. לצרף צינור חרוטי 50 מ ל העליון של המסננת, עם תולעים בוגרות מהשלב 1.2.2.3 מול הפנימי של הצינור אוסף חדש (איור דו-ממדי).
      2. הסר את הצינור הראשון (צינור פסולת) והיפוך במהירות מעל מסננת את צינור חדש כדי למנוע העברת ה-droplet (2E איור).
        הערה: אם עקרות אינה נחוצה, להשתמש נטולת מגבון (כגוןKimwipe) wick נוזל התחתון של רשת השינוי לפני היפוך.
      3. יש לשטוף את רשת השינוי עם M9 לתוך הצינור 50 מ ל חדש מן החדש על הסיפון (2F איור). שוב, פועלים במרכז רשת ולתחזק droplet על החלק התחתון של הרשת.
      4. לאפשר את התולעים להתפשר או לסובב אותם בעדינות למטה (למשל, < 16 x g) עבור 1 דקות (2G איור).
      5. וארוקן את בופר מ בגדר של תולעים, אידיאלי למטה > 0.5 מ"ל, או להסיר כל הנוזל ככל האפשר מבלי להפריע בגדר.
      6. Pipette התולעים באמצעות כוס פסטר פיפטה על גבי צלחת NGM ולתת להן להתייבש. מרחב טיפות מרובות בחוץ על צלחת חדשה אז הם להתייבש מהר יותר (איור 2 H).
    4. ניקוי המסננת.
      1. לשטוף המסננת ביסודיות ובעדינות עם אתנול וביו -אוסמוזה הפוכה מים. . תן לזה להתייבש.
      2. אחסן אותו במיכל נקי לשימוש בעתיד לא מוגדר.
      3. תבטל את זה, כאשר רשת השינוי מתפתח מראה 'סאג'.

2. אימות של Caenorhabditis ניפוי שיטת המיון

  1. תחזוקה כללית
    1. עבור כל הניסויים, תרבות תולעים תולעים נימיות צמיחה מדיה סטנדרטי17 (L 1 של NGM מורכב מ 2.5 גר' peptone, 17 גרם אגר, דור 3 של NaCl, 975 מ ל מים מזוקק פעמיים, 1 מ"ל של כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל, 1 מ"ל של CaCl 1 מ'2 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, 25 מ של 1 מ' KHPO4ו- 0.5 מ של סטרפטומיצין 100 מ"ג/מ"ל) ב 25 º C.
  2. מינהל טיפול ניסיוני
    1. להשוות את הטיפול שלוש הקבוצות: פיק, fluorodeoxyuridine (FUDR) ו Caenorhabditis מסננת.
      1. עבור קבוצת טיפול FUDR, להוסיף 100 מ"ג/מ"ל FUDR המדיה NGM ריכוז סופי של 100 μM כדי למנוע כל הפקה רומא, וכן להעביר את התולעים בכל יום צלחת NGM טריים כדי למנוע דלדול מזון.
      2. עבור הקבוצה לבחור, לבחור ולהעביר את התולעים באופן ידני באמצעות לולאה פלטינה.
      3. עבור קבוצת הטיפול Caenorhabditis מסננת, בצע צעד 1.2, pipette את התולעים על גבי צלחת NGM.
  3. Caenorhabditis מסננת אחוז התשואה
    1. כדי לכמת את המסננת עד כמה יעיל זה-מיון C. elegans, לגדל חיות N2 גיל-סינכרונית ליום 1 של הבגרות 25 ° c (קרי, 48 שעות לאחר הנחת הביצה) ולאחר מכן להעביר אותם על-ידי בחירת אותם ללוחות NGM טריים (בהיקף של N = 50 או N = 100 בעלי חיים לכל טרה קבוצת atment).
    2. אחרי 24 שעות של התאוששות, העברת האוכלוסייה ללוחות NGM חדש עם המסננת Caenorhabditis בעקבות האמור לעיל פרוטוקול (ראה שלב 1.2), לספור את מספר בעלי החיים הועברו בהצלחה.
    3. לחשב את התשואה באחוזים כיחס של מספר בעלי חיים מועברים בהשוואה שהמספר הראשון בתחילת ההעברה מוכפלים ב- 100 (%).
  4. מבחני Healthspan
    הערה: ציון הפרמטרים healthspan של הכיתה תנועתיות, קצב משאבת לועי, ו הקדמי והן התגובה המגע העדין האחורי בימים 2, 4, 6 ו- 8 של בגרות לבעלי גיל-מסונכרנות N2 ומתוחזק על 25 מעלות צלזיוס.
    1. תנועתיות מעקב
      1. להקצות תנועתיות שהתבססו על מערכת מבוסס-מחלקה (כיתות A, B ו- C) בעקבות שיטות חרנדון. et al. 18. להשוות את ההשפעות של שלוש קבוצות ניסיוני באמצעות מודל סטטיסטיקה לוגיסטיים הסודר בתוכנת ניתוח סטטיסטי.
        הערה: מדרגה ראשונה לאנשים להעביר באופן ספונטני בתבנית רגילה, sinusoidal. Class B לנוע בתנועות במידה ניכרת הלא-sinusoidal ויחידים עשויים לדרוש לדרבן ולעודד את התנועה. Class C יחידים להזיז הראש שלהם ו/או זנב בתגובה לדרבן, אך אינם מסוגלים לנוע על פני אגר.
    2. קצב משאבת לועי
      1. לספור מטחנת תנועת הנורה החיה לועי מסוף חזותית תחת stereomicroscope על 600 X הגדלה הסופי עבור 1 דקות.
      2. לערוך ניתוח סטטיסטי עם אנובה בכיוון אחד עם α = 0.05 ובדיקות Bonferroni פוסט עם α = 0.05.
    3. לגעת התגובה
      1. להקליט לתגובה המגע העדין ולהשוות בין קבוצות הטיפול שלוש. לבצע את מבחני המבוסס על שיטות מתוארת על ידי Calixto. et al. 19.
      2. הרשומה הקדמי ואת ישבנה לגעת התגובה על ידי ללטף בעדינות מכוש עפעף בניצב הזנב או בראש (5 x, מתחלפים בראש וזנב) של בעלי החיים.
      3. ציון כל תנועה בכיוון ההפוך של הקו באורך של 1 נקודה בסולם של 0 עד 5 עבור הקדמי והן התגובה האחורי.
      4. עריכת ניתוח סטטיסטי עם אנובה בכיוון אחד עם α = 0.05 ובדיקות Bonferroni פוסט עם α = 0.05.
  5. פוריות assay
    1. כדי לקבוע את השימוש של המסננת Caenorhabditis ההשפעה על רבייה, לגדל חיות N2 גיל-סינכרונית ליום 2 של הבגרות ב 25 º C.
    2. h 60 לאחר ביצה שכב, להעביר חיות לוחיות הרישוי NGM עם מעדר פלטינה או מסננת Caenorhabditis ולתת להם 4 שעות להתאושש (לייבש את הצלחות sieved למשך 20-30 דקות).
    3. לאחר התאוששות, בנפרד צלחת החיות באמצעות עפעף לבחור NGM צלחות, לתת להם 24 שעות להטיל ביצים, ולהסיר את החיות. לאפשר הוא צאצא שהלוח לפתח בתנאים רגילים 25 ° c עבור עוד 24 שעות ביממה.
      הערה: מכוש עפעף היא עפעף האנושי מאובטחות לסוף פיפטה פסטר עם לק ולא מעוקר עם אתנול.
    4. לספור את מספר יחידים בדור F1 קיימא. לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן T של α = 0.05.
      הערה: הצאצאים קיימא נחשבים ביצים בהצלחה לבקוע, מתחילים את הפיתוח שלהם דרך מחזורי הזחל קבוע.
  6. מבחני התגובה מתח כתב פלורסנט
    1. לבצע שלושה מבחני כתב פלורסנט נפוץ כדי לזהות סמנים פוטנציאלי של מתח: התקה הדף היומי-16::GFP לתוך הגרעינים של תאים ב- זן [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; ביטוי hsp-16.2 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; ביטוי השתילות-3 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.
    2. עבור כל assay, תרבות בעלי חיים גיל-סינכרונית מקבוצות הטיפול שלוש ב- 20 ° C ולבחון אותם בכל יום 3 של בגרות: להשתמש בפקד שלילי (על בסיס יומי, העברת קבוצת בעלי חיים באופן ידני עם מעדר פלטינה), פקד חיובי (על בסיס יומי העברת קבוצת בעלי חיים באופן ידני עם מעדר פלטינה פלוס של הלחץ הוקמה), ואת המסננת Caenorhabditis (להעביר את החיות דרך המסננת, לאפשר להם לשחזר למשך 30 דקות על NGM לפני הדמיה).
    3. ב וזמינותו הדף היומי-16::GFP, חום לחשמל החיות בקרה חיובית של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני הדמיה20. עבור hsp-16.2 וזמינותו, חום לזעזע את החיות בקרה חיובית במשך 90 דקות, 20 h לפני הדמיה21. עבור וזמינותו השתילות-3, מטפלים החיות בקרה חיובית עם 100 מ מ paraquat במשך 4 שעות לפני הדמיה22.
    4. לקצור את התולעים מיד עם דוקרן עפעף והר אותם coverslip עם μL 1 של 36% poloxamer 407 חומרים פעילי שטח פתרון על מנת לשתק את התולעים.
    5. כריך תולעים נטען עם coverslip אחרת. הר על coverslips שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית רגילה, התמונה התולעים באמצעות של 8 X הגדלה במיקרוסקופ פלורסנט הפוכה (עבור רמת ההגדלה הכוללת של 80 X) וחשיפה מתמדת עם מסנן FITC.
    6. כדי לזהות את כל ההבדלים בין הקבוצות שלוש וזמינותו הדף היומי-16::GFP, לסווג את החיות בהתבסס על המיקום של הכתב הדף היומי-16::GFP (גרעינית אם הכתב translocated את הגרעינים, cytosolic אם הכתב נמצא ציטוזול, ואם ביניים הכתבת ממוקם הגרעינים והן ציטוזול).
    7. להשוות את התוצאות תוך שימוש מודל סטטיסטי סידורי הלוגיסטיקה בתוכנת ניתוח סטטיסטי. Hsp-16.2 ומבחני את הביטוי השתילות-3, להשתמש חד-כיווני אנובה עם α = 0.05 ובדיקות של Tukey פוסט הוק עם α = 0.05 כדי להשוות את קרינה פלואורסצנטית הכולל של אזור הראש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המסננת Caenorhabditis מורכב 2 מזרקי וואקום, אבטחת אזור של ניילון ארוגים monofilament רשת שינוי קטן יותר מקוטר גוף העידן ההתפתחותי הרצוי, השתמשו כדי לחלץ אוכלוסיות בשידור חי של אורגניזמים בטכניקה פשוטה כביסה. זה מייחסת צינורות תקן חרוטיים ומשתמש המסך רשת שינוי כדי למיין באופן מכני חיות לפי קוטר גוף, עוזב את החיות הרצוי בצינור מוכן עוד יותר תחזוקה, ניסויים (למשל, העברה או הקציר גנטי). מדריך עדין כביסה עם המסננת Caenorhabditis מהיר, כ 5 דקות לכל צלחת 60 – 100 מ מ, האורגניזמים בקלות התאוששו מן הרשת.

אחוז תשואה של חיות בעקבות Caenorhabditis מסננת להשתמש
כדי לקבוע את אחוז התשואה של המסננת Caenorhabditis , התקנים נבדקו 20 μm וגם רשתות שינוי גודל הנקבוביות μm 50 בבעלי חיים למבוגרים. א אומר תשואה של > העברת בעלי חיים מוצלח 90% הושג הן רשת גדלים נבדק (טבלה 1).

Monofilament רשת עם גודל שונה הפערים עשוי לשמש כדי להפריד בין בעלי חיים שונים שלבים. רשת עם פערים μm 20 מתאים לרחצה משם פיתוח העוברים קטן יותר הזחל הרביעי, תמך האחרון שדרגות (L4; בקוטר של גוף ממוצע של 32 μm) ואת כל בבעלי החיים בשלבים מאוחרים יותר, ואילו רשת עם פערים μm 50 יאפשר כל חיים אחרים בסאובדור, חוץ מאלה מבוגרים (בקוטר גוף ממוצע של 70 μm) כדי להיות שטף (טבלה 2).

Caenorhabditis מסננת שימוש לא משפיע על מדדי healthspan
תנועתיות: C . elegans התנועה sinusoidal רגיל (כלומר, תנועתיות) מסרב עם גיל18 והיא מהווה סמן של הבריאות הכללית. כדי לקבוע אם המסננת Caenorhabditis השפיעו על תנועתיות, תנועתיות הציונים היו יחסית לאיסוף, FUDR, ואת המסננת Caenorhabditis קבוצות הטיפול בימים 2, 4, 6 ו- 8 של בגרות. כל החיות על פני כל קבוצה (n = 10/קבוצה) הציג דפוסי תנועה נורמלית וספונטני (Class A) בגילאים מרובות במהלך הבגרות (ימים 2, 4, 6 ו- 8 של בגרות; p > 0.05 להשוואות מרובות על כל הימים, איור 3).

קצב משאבת לועי: היכולת של השרירים בלוע של C. elegans לשאוב מזדקנים, סמן נוסף של healthspan23. כדי לקבוע אם המסננת Caenorhabditis השפיעו על החיות קצב משאבת לועי, פיק, FUDR ו Caenorhabditis הושוו קבוצות הטיפול מסננת בימים 2, 4, 6 ו- 8 של בגרות (n = 8 עד 10 לכל קבוצה). היה הבדל משמעותי בין החיות שעברו האיסוף ושיטות FUDR על ימים 6 (p < 0.001) ו- 8 (p < 0.001). בנוסף, היה הבדל משמעותי בין הקבוצות FUDR מסננת על ימים 6 (p < 0.001), יום 8 של בגרות (p < 0.001). עם זאת, היה הבדל משמעותי סטטיסטית בין הקבוצות מסננת Caenorhabditis האיסוף עבור כל יום (p > 0.05, איור 4), המציינת את המסננת לא משפיע על אמצעי זה של healthspan.

המגע העדין התגובה: בתגובה גירוי מכני הוא סמן פיזיולוגיים להערכת הזדקנות או כללי בריאות24,25; לכן, ההשפעה של שיטות שונות העברת הקדמי והן התגובות המגע העדין האחורי נבדקו. היה הבדל משמעותי סטטיסטית בין פיק, FUDR Caenorhabditis ניפוי קבוצות הטיפול (n = 8/קבוצה), או anteriorly או posteriorly, עבור כל יום של בדיקות (p > 0.4 להשוואות כל; איור 5A , 5B).

פוריות: להקים או לא מסננת Caenorhabditis השפיעו על הסכום צאצאי קיימא המיוצרים על ידי C. elegans, אופספרינג בודדים מיוצר תקופה של 24 שעות במהלך יום 3 של בגרות היה ונספרו בהשוואה (n = 20 ל 22 לכל קבוצה). השימוש של המסננת Caenorhabditis לא להשפיע באופן משמעותי את המספר צאצאי המיוצר לעומת קבוצת הטיפול פיק (p = 0.61, איור 6).

מבחני כתב מולקולרית
הדף היומי-16 רוברטסונית גרעינית: ב- C. elegans, ההפעלה של הגורם שעתוק הדף היומי-16 קשורה ללחץ מוגבר ההתנגדות26. לוקליזציה הגרעין של הדף היומי-16 נבדק בזן נמטודות הטרנסגניים TJ356, אשר מבטא את הדף היומי-16 דבוקה חלבון פלואורסצנטי ירוק (הדף היומי-16::GFP)20. בתנאים הצמיחה רגילה, הדף היומי-16::GFP הוא מקומי בעיקר בתחום ציטוזול, אך תחת לחצים שונים (למשל, עומס חום), זה הוא במהירות translocated לתוך גרעין20. כדי לבדוק את ההשפעה של מיון עם המסננת Caenorhabditis על הדף היומי-16 רוברטסונית, הגרסא המקומית של הדף היומי-16::GFP הושוו ב תואם גיל יום-5 מבוגרים בקבוצת ביקורת חיובית (עומס חום), וקבוצת ביקורת שלילית (העברה ידנית דרך פיק), ו קבוצות טיפול מסננת Caenorhabditis (n = 10/קבוצה). העברת עם המסננת Caenorhabditis לא השפיעה רוברטסונית הגרעין של הדף היומי-16::GFP, והראה הפנוטיפ דומה לבעלי שליטה שלילי (p > 0.05, איור 7).

hsp-16.2 כתב: חלבונים הלם חום קטן כמו HSP-16.2 הם סמנים ביולוגיים של תגובה ללחץ, הם מאוד הביעו במהלך חשיפה הלם חום או סטרס חמצוני סוכנים21,27. המתח TJ375 יש גן כתב GFP התמזגו עם מקדם מכירות hsp-16.2 שאינו פעיל תחת תנאים נורמליים21. עם זאת, לאחר חשיפה הלם חום, HSP-16.2 חלבון ביטוי מושרה ולהציג החיות רמות גבוהות של הביטוי GFP21. כדי לבדוק את מעורבותם של המסננת Caenorhabditis על מענה HSP-16.2-מתווכת סטרס, צפיפות קרינה פלואורסצנטית באזור הלוע (n = 10 חיות/קבוצה) של בעלי חיים מתאימים לגיל נמשל במבוגרים יום-5 בין קבוצת ביקורת חיובית (חום מתח), שלילי לשלוט קבוצה (איסוף), וקבוצת טיפול Caenorhabditis מסננת. העברת עם המסננת Caenorhabditis לא באופן משמעותי זירוז הביטוי של HSP-16.2::GFP (hsp-16.2::gfp) בהשוואה הפקד שלילי (p > 0.05, איור 8).

אדמת עשב-3 כתב: ב- C. elegans, הגן נוגד חמצון כי הקודים סופראוקסיד דיסמוטאז 3 (SOD-3) הוא מוסדר למעלה בזמן סטרס חמצוני28. המתח C. elegans CF1553 מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-שכותרתו מקדם השתילות-3, אשר הביטוי הנגרמת על ידי גורמי חמצון, כגון paraquat5. כדי לבדוק את מעורבותם של מסננת Caenorhabditis המיון על תגובת חמצון ב- C. elegans, צפיפות קרינה פלואורסצנטית באזור ראש תואם גיל יום-5 מבוגרים נערכה השוואה בין אוכלוסיה בקרה חיובית (100 μM paraquat טיפול), אוכלוסיה שליטה שלילי (איסוף ידני), ואת Caenorhabditis האוכלוסייה הועברה מסננת. העברת עם המסננת Caenorhabditis לא באופן משמעותי זירוז הביטוי של עשב-3::gfp בהשוואה הפקד שלילי (p > 0.05, איור 9).

Figure 1
איור 1: Caenorhabditis מסננת הבנייה. ההתקדמות של ייצור 'עשה זאת בעצמך' של הכלי מוצג. אלה מראות (א) שני 50 מ ל צינור חרוטי (B) מרכזי אשר הוסרו, (ג) לגזור קצוות החליק, וכובעים (D - F) אשר הינם מצוידים עם monofilament רשת המתאימים לשלב החיים הרצויה של C. elegans (לקבלת פרטים, ראה פרוטוקול ). (G) גם מוצג המסננת שהושלמו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ייצוג תמונת שלב אחר שלב השימוש Caenorhabditis מסננת. (א) המסננת הוא טרום רטוב עם טיפת M9 פתרון, ובכושר (B) על גבי צינור חרוטי 50 מ ל. צינור עליון (C) 1 מ"ל של M9 פתרון עם תולעים הוא pipetted על למעלה של המסננת, (D) צינור חרוטי 50 מ ל מונחת על גבי המסננת עם התולעים מול הפנימי של צינור, ו- (E) המסננת עם שהוצמדה זה עתה הוא o במהירות הפוך ver. (G) המסננת שוטפים עם M9 נושא בעלי החיים הרצוי לתוך 50 מ ל חדש צינור התולעים מותר להתיישב על ידי הכבידה לתחתית הצינור. (H) התולעים pipetted והניח כמו טיפות על צלחת NGM טריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: מסננת Caenorhabditis לא משפיעים תנועתיות לאורך כל תוחלת החיים. איור זה מציג את התפלגות הכיתה תנועתיות של בעלי חיים ימים 2, 4, 6 ו- 8 של בגרות לאיסוף, FUDR, וקבוצות Caenorhabditis מסננת טיפול. Class A חיות עברה בדרך כלל, באופן ספונטני, class B חיות עבר באופן חריג, שייתכן נדרש לדרבן class C בעלי החיים, לא יכלו לנוע. לא היה הבדל בין Caenorhabditis מסננת, פיק וקבוצות FUDR (p > 0.05). משכפל שלוש (n = 10 בעלי חיים לכל צלחת הטיפול) שנערך וניתח במודל לוגיסטיקה סודר. class B חיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: השתמש Caenorhabditis מסננת לא משפיעים שאיבה לועי לאורך כל מחזור. איור זה מציג קצבי משאבת לועי לאסוף, FUDR, ואת קבוצות הטיפול Caenorhabditis מסננת, בהשוואה בימים 2, 4, 6 ו- 8 של בגרות. הכוכביות מציינות משמעות בין האיסוף, מסננת, FUDR קבוצות הטיפול הימים שצוין (* * * p < 0.05). לא היה הבדל בין המסננת Caenorhabditis לקבוצת פיק (0.05 >p ). משכפל שני (N = 10 בעלי חיים לכל צלחת הטיפול) שנערך וניתח עם חד-כיווני אנובה, פוסט-מבחן Bonferroni. העמודות מסמנות את זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: שימוש Caenorhabditis מסננת לא משפיעים המגע הקדמי התגובה לאורך כל תוחלת החיים. אלה מראות (A) הקדמי, קבוצות הטיפול (B) הרוזן התגובה קשר אחורי של פיק, FUDR Caenorhabditis מסננת בהשוואה בימים 2, 4, 6 ו- 8 של בגרות. משכפל שני נערכו עם N = 10 עבור כל קבוצת הטיפול, לעומת חד-כיווני אנובה ו פוסט-מבחן Bonferroni (p = 0.4 ו- p = 0.9 anterior ואת אחורי, בהתאמה). העמודות מסמנות את זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: מסננת Caenorhabditis לא להשפיע על הסכום צאצאי קיימא ביום השלישי של בגרות. איור זה מציג הוא צאצא. קיימא של היום-3 מבוגרים לאחר תקופה 24 שעות להטלת ביצים, הנמשכים יום 3 של בגרות לבעלי האב. העמודות מסמנות את זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע. N = 20-22 חיות מכל לפחות שתי נפרד ביולוגי משכפל לכל קבוצה לטיפול. הקבוצות טיפול מושווים עם t-מבחן (p > 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: מסננת Caenorhabditis לא השפיעה רוברטסונית הגרעין של הדף היומי-16::GFP. לוחות אלה מראים להחליפן בתמונות של רוברטסונית הדף היומי-16 של (A) הלם חום (הפקד חיובי), (B) בחר קבוצה (פקד שלילי), וקבוצת מסננת (C) Caenorhabditis טיפול. (ד) בעלי החיים בקבוצת הביקורת חיובית המוצגת הפעלה של טרנסלוקציה גרעיני הדף היומי-16. המסננת Caenorhabditis לא זירוז התקה גרעיני ומוצגים חלבון כימרי cytosolic הדומה בעלי החיים בקבוצת הביקורת השלילית. N = 10 חיות לכל טיפול קבוצה לפחות שלושה נפרדים ביולוגי משכפל. הקבוצות טיפול הושוו עם חד-כיווני אנובה ובדיקה של Tukey פוסט הוק . סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: מסננת Caenorhabditis לא השפיע על הביטוי של hsp16.2::gfp. הביטויים HSP-16.2 (ביחידות פלורסצנטיות שרירותי) של קבוצת הלם חום (הפקד חיובי), קבוצה הבחירה (הפקד שלילי) קבוצת הטיפול Caenorhabditis מסננת מושווים. הכוכביות מציינות ביטוי גבוהה של hsp16.2::gfp עבור קבוצת בקרה חיובית אשר היה שונה באופן מהותי מן קבוצות טיפול אחרות (* * * p < 0.05). המסננת Caenorhabditis לא השפיע על הביטוי hsp16.2::gfp ומוצג עוצמות קרינה פלואורסצנטית דומה לבעלי בקבוצת הביקורת השלילית (p > 0.05). משכפל שלושה נערכו עם N = 10 עבור כל קבוצת הטיפול, בהשוואה חד-כיווני אנובה ובדיקה של Tukey פוסט הוק . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9: מסננת Caenorhabditis לא השפיע על הביטוי של עשב-3::gfp. הביטויים השתילות-3 (ביחידות פלורסצנטיות שרירותי) של 100 μM paraquat קבוצה (פקד חיובי), קבוצה הבחירה (הפקד שלילי) קבוצת הטיפול מסננת Caenorhabditis מוצגים. הכוכביות מציינות ביטוי גבוהה של עשב-3::gfp עבור קבוצת בקרה חיובית אשר היה שונה באופן מהותי מן הקבוצות האחרות (* * * p < 0.05). המסננת Caenorhabditis לא השפיע על הביטוי השתילות-3::gfp ומוצג עוצמות קרינה פלואורסצנטית הדומה בעלי החיים בקבוצת הביקורת השלילית (p > 0.05). משכפל שלושה נערכו עם N = 10 עבור כל קבוצת הטיפול, בהשוואה חד-כיווני אנובה ובדיקה של Tukey פוסט הוק . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

גודל רשת N = 50 N = 100
20 μm 95.33%
50 μm 99.00% 93.33%

טבלה 1: אחוז התשואה בגדלים רשת. טבלה זו מציגה את התוצאות של התקן 20 μm נבדק עם N = 50 מבוגרים משכפל 3, מכשיר 50 μm נבדק עם N = 50 מבוגרים עבור משכפל 2, עם N = 100 עבור משכפל 3.

גודל רשת שלב התפתחותי קוטר גוף
20 μm הפרפרים והעשים 4 ~ 35 μm
50 μm יום 1 מבוגר ~ 70 μm

בטבלה 2: קוטר גוף רשע. טבלה זו מציגה את הקוטר הגוף אומר שרכשה בממוצע 3 מדידות באותה מידה המפוזרים על פני כל תולעת לבעלי 15 בכל שלב בחיים נמדד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במסמך זה, הצגנו את העיצוב ואת השימוש של המסננת Caenorhabditis נגיש, יעיל ככלי מיון ולשמירה על C. elegans. כלי זה יש מספר יתרונות לבחירת חיות בודדות, שטיפת אוכלוסיות, טיפולים כימיים (למשל, FUDR) ושיטות יקר יותר מחיות הפרדת באופן ידני. קודם כל, Caenorhabditis ניפוי ביעילות ובמהירות (פחות מ- 20 דקות) ממיין רומא של אוכלוסיות מעורבות גדולה של חיות (טבלה 2). כמו כן, השימוש בכלי יש אין השפעות רעילות לזיהוי על healthspan של החיות (איור 3, איור 4, איור 5, איור 6), לא לגרום לכתבים היטב תיאר מתח גנטי (איור 7, איור 8 איור 9), מפחית את כמות כימי זר יכול להשפיע על הטיפול יישומית הלוחות תרבות או כל assay מולקולרית לאחר מכן. קלות שימוש היא יתרון משמעותי; חוקר בכל שלב בחינוך שלהם יכולים להיות מאומנים להשתמש בו (איור 1 , איור 2; פרוטוקול).

החומרים הדרושים עבור ייצור ושימוש המסננת (למשל, פיפטות, מאגרים) נמצאים בהישג יד במעבדות מחקר רגיל; לפיכך, אם שבורים, מסננת Caenorhabditis אינו יקר כדי להחליף או לתקן. מהות עצמית שלא נבנה המסננת Caenorhabditis מאפשר לו להיות כלי רב-תכליתי: זה ניתן לבנות עם רשת בגדלים המתאימים שונים C. elegans שלבים התפתחותיים ו פנוטיפים. המסננת Caenorhabditis עשוי לשמש גם מבחני שנערך ב נמטודות מינים אחרים או כאשר בידוד אורגניזמים קטנים, סיפק את הגודל המתאים רשת משמש בעת ייצור.

בנוסף ליתרונות כלי זה מספק לתחזוקה האוכלוסייה C. elegans , המסננת עשוי לשמש לניקוי בעלי חיים לפני השימוש ביישומים אחרים ניסיוני. לדוגמה, עם התפתחות מיקרופלואידיקה לבצע C. elegans מחקר מגיע לנושא של שבב לשימוש וניקוי. תלוי בכמות החיידקים קשורה החיות, באמצעי זהירות מיוחדים צריכים להילקח כדי לא לסתום את השבב microfluidic, טיוח זה לא שמיש29. לעיתים קרובות כאשר C. elegans מועברים שבב microfluidic, שאריות מן הדשא חיידקי הביאו עמם. זה שאריות ניתן, לסתום את ערוצי microfluidic, שהופך את השבב תקלה, אשר לאחר מכן דורש ניקוי או החלפת. הבונה התקן של פרוטוקול זה מציע שיטה לא רק קציר חיות מסונכרן מיקרופלואידיקה, אלא גם לניקוי החיות לפני הכניסה שלהם לתוך מכשיר microfluidic. על-ידי הסרת פסולת ושיירי חיידקי, המנוצל בעת איסוף בעלי חיים, ערוצי microfluidic נוטים פחות לתקלה, ובכך מגדילים את החיים המבצעי של שבבי בודדים ולא את התפוקה עוקבות של המחקר המנוהל איתם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף. המחברים מצהירים כי המחקר בוצע בהיעדר יחסים מסחריים או פיננסי שיכול להחשב בתור ניגוד אינטרסים פוטנציאליים.

Acknowledgments

המחברים רוצה להודות הת'ר Currey על תרומתה הראשונית תכנון המחקר, ד ר מיטרה סווארופ עבור שלו סקירה ביקורתית של כתב היד. אנחנו רוצים גם תודה ד ר מיכאל ב. האריס הערות, ליטושים, סיוע בהפקת ההדגמה של מתודולוגיה זו. הזנים נמסרו על ידי המרכז גנטיקה Caenorhabditis הממומן ע י המשרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). המחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספרים UL1GM118991, TL4GM118992 או RL5GM118990 ועל ידי פרס פיתוח מוסדיים (מושג) מ הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת גרנט מספר 5P20GM103395-15. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים. UA הוא AA/EO המעסיק ו מוסד חינוכי, אוסר על הפליה נגד כל אדם: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Safety glasses Uline S-21076
Protective heat resistant glove Grainger Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube Falcon 14-432-22
Synthetic Nylon mesh Dynamic
Aqua-Supply Ltd		 NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue Scotch Super Glue Liquid SAD114
Pliers Vampliers VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file Lowe's Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR Sigma F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)  Sigma  S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127 Sigma P2443
Paraquat dichloride hydrate Sigma 36541
Inverted fluorescence microscope Olympus FSX100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  2. Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
  3. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  4. Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
  5. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
  6. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
  7. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
  8. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
  9. Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
  10. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
  11. Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
  12. Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).
  13. Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
  14. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
  15. Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
  16. Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
  17. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  18. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  19. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  20. Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
  21. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  22. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  23. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
  24. Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
  25. Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
  26. Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).
  27. Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
  28. Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
  29. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 137 Caenorhabditis elegans מיון הובלה סינכרון מהיר נגיש
<em>Caenorhabditis</em> נפה:, מכשיר low-tech ו מתודולוגיה לצורך מיון אורגניזמים רב תאיים קטנים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., … More

Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms. J. Vis. Exp. (137), e58014, doi:10.3791/58014 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter