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Developmental Biology

Caenorhabditis Sieb: Ein Low-Tech-Instrument und Methodik für die Sortierung von kleiner vielzelliger Organismen

Published: July 4, 2018 doi: 10.3791/58014
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 2, 5
1Department of Biology and Wildlife, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 4Departments of Biology and Chemistry, Earlham College, 5Department of Biological Sciences, College of Natural Science and Mathematics, California State University Long Beach
* These authors contributed equally

Summary

Das aktuelle Protokoll beinhaltet eine Methodik für die Sortierung und Reinigung Alter abgestimmt Populationen von Caenorhabditis Elegans. Es verwendet eine einfache, kostengünstige, und effiziente maßgeschneiderte Werkzeug um eine große experimentelle Population von Nematoden für Forschung zu erhalten.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist eine etablierte Modellorganismus verwendet in einer Reihe von grundlegenden und biomedizinischen Forschung. Innerhalb der Nematoden Forschungsgemeinschaft ist eine Notwendigkeit für eine kostengünstige und effektive Möglichkeit, großer, Alter abgestimmt Populationen von C. Eleganszu. Hier präsentieren wir eine Methodik für die mechanisch sortieren und Reinigen von C. Elegans. Unser Ziel ist es, eine kostengünstige, effiziente, schnelle und einfache Verfahren um Tiere einheitliche Größen und Stufen für den Einsatz in Experimenten zu erhalten. Dieses Tool, das Sieb Caenorhabditis verwendet eine Custom-Built Deckel-System, die Gewinde auf gemeinsame konische Labor Röhren und C. Elegans anhand der Körpergröße sortiert. Wir zeigen auch, dass das Sieb Caenorhabditis Tiere effektiv aus einer Kultur Platte überträgt, zu einem anderen ermöglicht eine schnelle Sortierung, synchronisieren und Reinigung ohne Beeinträchtigung der Marker für Gesundheit, einschließlich der Motilität und Stress-induzierbaren gen-Reporter. Dieses allgemein zugänglicher und innovativer Tool ist eine schnelle, effiziente und nicht stressig-Option für die Aufrechterhaltung der Populationen von C. Elegans .

Introduction

Die Nematoden Wurm Caenorhabditis Elegans, ist eine führende Modellorganismus. Neben der einfachen und kontrollierten Natur ihrer Züchtung im Labor ihre gesamte Genom sequenziert1 und Entwicklungsstörungen Schicksal jeder Zelle ist bekannt2. Aufgrund dieser Eigenschaften ist C. Elegans weit verbreiteten Modellorganismus für genetische Studien. Zusammen mit diesen vorteilhaften Eigenschaften kommen jedoch einige Herausforderungen für Forscher. Aufgrund ihrer schnellen Generationszeit C. Elegans Populationen können schnell laufen aus der Nahrung und/oder Populationen mit mehreren Generationen vermischt werden und Entwicklungsstadien auf einmal präsentieren. Folglich erfordern Experimente auf solide Nematoden Wachstumsmedien (NGM) Forscher körperlich bewegen Tiere zu frischen Teller, bevor die bakterielle Nahrungsquelle erschöpft und neue Larven entwickeln. Dies kann mühsam sein, da eine häufige Übertragung der Tiere erforderlich ist, um zu verhindern, dass die experimentellen Populationen von mit Nachkommen Generationen vermischt. Jedoch erfordern einige Experimente sowohl große Anzahl von Tieren und längere Zeitpunkte (z.B. DNA oder RNA-Extraktion im Erwachsenenalter). Dies verstärkt die Entwicklung genau zu erhalten eine synchronisierte Bevölkerung und große Zahl von Tieren übertragen.

Aktuelle Methoden der Übertragung von C. Elegans kultiviert auf NGM Kommissionierung oder Waschen der Tiere von Platte zu Platte; chemische Behandlung der Tiere (z. B.mit der DNA-Replikation-Inhibitor Fluorodeoxyuridine oder FUDR); oder mittels Durchflusszytometrie, um die Tiere im Multi-well-Platten zu sortieren. Kommissionierung beinhaltet die Verwendung von ein Handwerkzeug, gemacht mit einer dünnen Platindraht oder eine Wimper manuell einzelne oder mehrere Tiere3,4übertragen. Diese Methode ist korrekt, aber erfordert Geschick und Zeit und ist eine Einschränkung für Studien, die große Zahl von Tieren. Mai auch sein körperlich schädlichen und stressig für die Tiere durch potenziell Personen unnatürlich und inkonsistente Mengen von Störung und Kraft zu unterwerfen. Waschen umfasst Spülen einer Kulturschale mit einer Pufferlösung und die Lösung mit den Tieren über Glas Pasteurpipette auf eine neue Kultur-Platte zu übertragen. Diese Methode ist schnell und effizient aber ist nicht genau, wie mehrere Generationen und Entwicklungsstadien der Tiere in der Masse übertragen werden. Chemische Behandlungen, wie z. B. FUDR, können in die Kultivierung Medien, um zu verhindern, dass die Produktion von Nachkommen durch Sperrung DNA-Replikation, und somit die Gameten Produktion und Ei-Entwicklung aufgelöst werden. Während wirksam, nach Entwicklungsstörungen Reifung, nicht die normalen Entwicklungsprozesse stören diese Methode angewendet werden, und dies bedeutet, dass es noch eine Voraussetzung um die Tiere vor seine Verwaltung3zu übertragen. Diese Methode beeinflusst auch mehrere zelluläre Signalwege, die spürbare Auswirkungen auf die Tiere wenn sie älter werden (z.B., eine Lebensdauerverlängerung oder eine veränderte proteostase) abhängig von der Sorte von C. Elegans verwendet5, 6,7,8,9,10. Flow Cytometry Methoden automatisch sortieren und individuelle C. Elegans aus einem Multi-well-Platte auf eine andere11übertragen. Während diese Methode sehr effektiv und effizient ist, ist Flow Cytometry Ausrüstung unerschwinglich teuer und für viele Forscher nicht zugänglich. Eine Alternative zur Übertragung von Tieren soll mutierten Modelle verwenden, die sind temperaturempfindlich, z. B. Fer-15 und Fem-1, die steril mit Temperatur Einstellung12geworden. Verwendung von mutierten Tieren in einigen Situationen nützlich ist, diese spezifische Stämme wachsen langsamer als Wildtyp Tiere und sie verlassen sich auf eine veränderte Genom, als schlechte Vertreter für alternde oder gesunde Würmer. Darüber hinaus das Vertrauen auf eine temperaturverschiebung induzieren Sterilität führt auch das Fehlen von einer statischen Umgebung, und Temperaturschwankungen leicht nachweislich Einfluss auf Gen Ausdrücke13,14, 15. Forschungsgruppen haben zuvor veröffentlichten Techniken beschreiben die Verwendung eines Netzes zum Filtern von C. Elegans nach Größe16. Jedoch konnten wir finden Vorarbeiten Tests für alle Änderungen an den allgemeinen Gesundheit Resultaten, die den Einsatz von solchen Filtern zugeordnet werden können.

So gibt es eine Notwendigkeit in C. Elegans Forschungskreisen eine kostengünstige, effiziente, schnelle und präzise Methode zur Übertragung von großen Anzahl von Tieren zwischen Kultur Platten. Wir haben eine verbesserte, zugängliche Stück Ausrüstung (benannt Caenorhabditis Sieb) und eine zugehörige Protokoll für seine Herstellung und Betrieb, die den Bedürfnissen der Forschungsgemeinschaft C. Elegans entwickelt. Hierin, teilen wir das Design der Caenorhabditis Sieb und Methoden für den Einsatz, und wir zeigen, dass ihre Verwendung nicht die allgemeine Gesundheit oder alle Stress-Marker im Vergleich zu standard manuellen Kommissionierung und eine Behandlung mit den gängigen auswirkt, Einschränkung der Fruchtbarkeit chemische FUDR.

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Protocol

1. Caenorhabditis Sieb Konstruktion und Verwendung

  1. Konstruktionsprotokoll
    1. 2 Deckel aus 50 mL konische Röhrchen (Abbildung 1A) zu erwerben.
    2. Entfernen Sie den mittleren Bereich innerhalb der inneren Lippe der Lider (betrachtet von unten, Abb. 1 b) mit dem Bunsenbrenner und Roheisen Sonde oder einen Lötkolben oder trat Bohrer.
      Hinweis: Mit Wärme, um die Kunststoff-Deckel zu schneiden ist eine Klinge vorzuziehen, da gibt es weniger Verletzungsgefahr.
    3. Reinigen Sie und Schleifen Sie die Schnittkanten und oben Sie die Oberfläche mit einer gebogene Feile oder einem Rotary Schleifwerkzeug (z.B.Dremel). Siehe Abbildung 1.
    4. Schneiden Sie den Kreis der das Monofilament Netz auf den entsprechenden Durchmesser (Abbildung 1). Hierzu verfolgen Sie einen Deckel auf einem Monofilament Netz Nylonblatt und schneiden Sie nur innerhalb der Linie gezeichnet.
    5. Schneiden Sie Nuten/Schrägstriche in die obere Fläche der Deckel zur Verbesserung der Adhäsion von zwei Deckeln, wenn Klebstoff auf den Kunststoff (Abbildung 1E) angewendet wird.
    6. Die Deckel mit Ethanol zu reinigen und trocknen lassen.
    7. Cyanacrylat Kleber auf der Oberseite der beiden Deckeln, halten bis zum äußeren Rand.
      Hinweis: ein wenig Leim geht ein langer Weg.
    8. Legen Sie das Monofilament Netz gemäß Tabelle 1, auf einem geklebten Deckel (Abb. 1F). Setzen Sie den zweiten Deckel oben auf das Netz invertiert; Beide Deckel müssen ihre Spitzen zusammen. Drücken Sie fest zusammen (Abb. 1). Stellen Sie sicher, dass das Netz straff gespannt ist.
      Hinweis: als Sicherheitsmaßnahme, Verwendung Pinzette um das Netz auf den Deckeln zu platzieren.
    9. Sobald die erste Schicht der Leim getrocknet ist, wenden Sie einen Ring aus Cyanacrylat-Klebstoff um die äußeren Lücke zwischen den Deckeln. Seien Sie großzügig, da dies Integrität fügt und jede Peeling auseinander oder undicht verhindert.
    10. Beschriften Sie den Filter mit einer Pore Maschenweite des Netzes Monofile.
      Hinweis: Hier verwenden wir zwei Maschengrößen Pore – 20 µm und 50 µm.
  2. Verwenden Sie Protokoll
    1. Vornässen der Sieb.
      1. Pipette eine Kochsalzlösung, z. B. M9 [5 g NaCl, Na2HPO46 g, 3 g KH2PO4, 1 L von hochreinen H2O und 1 mL MgSO4 (1 M)]17, durch die Mitte des Siebes bis sich ein Tröpfchen bildet , kondensiert und tropft ab der Mitte des unteren Filter (Abbildung 2A). Optional, gelten ein fusselfreies Tuch (z.B.windex) auf den Boden zu gestalten oder einen Tropfen Feuchtigkeit auf das Netz zu verbreiten.
      2. Legen Sie das Sieb über eine 50 mL konische Rohr. Beschriften Sie das Rohr als "Abfall-Tube" (Abb. 2 b).
    2. Waschen Sie eine Bevölkerung von C. Elegans aus einer nährbodenplatte.
      1. Waschen der Platte mit der M9-Puffer und der Wurm-haltigen Medium auf der Oberseite der Monofilament Netz 1 mL zu einem Zeitpunkt (Abbildung 2). Achten Sie darauf, in der Mitte des Netzes zu betreiben. Waschen Sie alle Würmer von der Platte.
        Hinweis: In der Regel 3 mL M9 für eine 60 mm-Platte ist ausreichend.
      2. Um die Anzahl der Würmer in pipettieren verloren zu minimieren, verwenden Sie ein Glas Pasteurpipette, um die Würmer aus der Platte und in das Netz-Zentrum (Wiederholung nach Bedarf) zu bewegen.
      3. Spülen Sie den Filter mit dem M9-Puffer von oben. Wieder, stellen Sie sicher, in der Mitte des Netzes zu betreiben und spülen alle Würmer in diesem Bereich. Waschen Sie sich so oft wie notwendig, um sicherzustellen, dass das Netz die Bakterien und kleinere Würmer durchlaufen haben.
    3. Ernten Sie die Größe angepasst Tiere vom Sieb.
      1. Legen Sie eine neue 50 mL konische Rohr an die Spitze des Siebes mit der erwachsenen Würmer aus Schritt 1.2.2.3 mit Blick auf das Innere der neuen Kollektion-Röhre (Abb. 2D).
      2. Entfernen Sie das erste Rohr (Abwasser Rohr) und Blättern Sie schnell über das Sieb und die neue Röhre, die Tröpfchen von Migration zu halten (Abbildung 2E).
        Hinweis: Wenn Sterilität nicht erforderlich ist, verwenden Sie ein fusselfreies Tuch (z.B.windex) Docht Fluid von Unterseite des Netzes vor spiegeln.
      3. Spülen Sie das Netz mit M9 in der neuen 50 mL Tube aus der neuen Oberseite (Abb. 2F). Wieder in das Netz-Zentrum Betrieb und Wartung ein Tröpfchen auf der Unterseite des Netzes.
      4. Ermöglichen die Würmer zu begleichen oder sanft nach unten zu drehen (z.B.< 16 X g) für ca. 1 min (Abbildung 2).
      5. Aspirieren die Pufferlösung aus dem Pellet von Würmern, im Idealfall bis zu > 0,5 mL, oder entfernen Sie soviel Flüssigkeit wie möglich ohne zu stören das Pellet.
      6. Die Würmer mit einem Glas Pasteurpipette auf einem Teller NGM Pipette und trocknen lassen. Raum mehrere Tröpfchen heraus auf eine neue Platte, damit sie schneller (Abb. 2 H Trocknen).
    4. Reinigen Sie Sieb.
      1. Das Sieb sanft und gründlich mit Ethanol und Umkehrosmose-Wasser abspülen. Lassen Sie ihn trocknen.
      2. In einen sauberen Behälter für unbestimmte zukünftige Verwendung speichern.
      3. Entsorgen Sie es, wenn das Netz ein "Sag" Erscheinungsbild entwickelt.

2. Validierung der Caenorhabditis Sieb Sortiermethode

  1. Allgemeine Wartung
    1. Für alle Experimente Kultur worms auf eine standard Nematoden Wachstumsmedien17 (1 L der NGM besteht aus 2,5 g Pepton, 17 g Agar, 3 g NaCl, 975 mL bidestilliertem Wasser, 1 mL 5 mg/mL Cholesterin, 1 mL 1 M CaCl2 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL 1 M KHPO4und 0,5 mL von 100 mg/mL Streptomycin) bei 25 ° C.
  2. Experimentelle Behandlung Verwaltung
    1. Vergleichen Sie die drei Behandlungsgruppen: Pick, Fluorodeoxyuridine (FUDR) und Caenorhabditis Sieb.
      1. Für die Behandlungsgruppe FUDR die NGM-Medien, um eine Endkonzentration von 100 μM, Nachkommen-Produktion zu verhindern 100 mg/mL FUDR hinzu, und übertragen Sie die Würmer täglich auf einen frischen NGM Teller Essen Erschöpfung zu vermeiden.
      2. Markieren Sie für die Pick Gruppe und übernehmen Sie die Würmer manuell mit einer Platin-Schleife.
      3. Folgen Sie für die Behandlungsgruppe Caenorhabditis Sieb Schritt 1.2 und pipette die Würmer auf eine NGM-Teller.
  3. Caenorhabditis Sieb prozentuale Ausbeute
    1. Um zu quantifizieren, wie effektiv das Sieb ist zur Sortierung von C. Elegans, Alter-synchrone N2 Tiere an Tag 1 des Erwachsenenalters bei 25 ° C (d. h.48 h nach der Eiablage) wachsen und übertragen sie dann durch Abnehmen ihnen frische NGM-Platten (in Höhe von insgesamt N = 50 oder N = 100 Tiere pro Tre Atment Gruppe).
    2. Nach 24 Stunden der Erholung, transfer die Bevölkerung zum neuen NGM Platten mit Caenorhabditis Sieb nach oben-Protokoll (siehe Schritt 1.2) und die Anzahl der erfolgreich übertragenen Tiere.
    3. Berechnen Sie die prozentuale Ausbeute als das Verhältnis der Anzahl der Tiere im Vergleich zu der Startnummer zu Beginn der Übertragung multipliziert mit 100 (%) übertragen.
  4. Healthspan assays
    Hinweis: Gäste Healthspan Parameter der Motilität Klasse, der pharyngealen Pumprate und sowohl die vorderen und hinteren sanften Touch-Reaktion an Tagen 2, 4, 6 und 8 des Erwachsenenalters für Alter synchronisiert N2 Tiere gepflegt bei 25 ° C.
    1. Motilität tracking
      1. Motilität Partituren basiert auf einem Klasse-basierte System (Klassen A, B und C) weisen nach den Methoden von Herndon Et Al. 18. vergleichen Sie die Auswirkungen der drei experimentellen Gruppen anhand eines ordinale logistische Statistiken im statistischen Analyse-Software.
        Hinweis: Klasse A Personen bewegen sich spontan in einem normalen, sinusförmige Muster. Klasse B Personen bewegen sich in deutlich nicht-sinusförmige Bewegungen und möglicherweise drängen um Bewegung zu fördern. Klasse C Individuen bewegen Sie ihren Kopf und/oder Schweif als Reaktion auf Drängen aber nicht über den Agar bewegen.
    2. Pharyngealen Pumprate
      1. Zählen Sie die Mühle Bewegung des Tieres terminal pharyngealen Glühbirne visuell unter einem Stereomikroskop bei einem 600 X letzte Vergrößerung für 1 min.
      2. Eine statistische Analyse mit einem One-Way ANOVA mit α = 0,05 und Bonferroni Post-Tests mit α = 0,05.
    3. Touch-Reaktion
      1. Erfassen Sie eine sanfte Berührung Reaktion und vergleichen Sie zwischen den drei Behandlungsgruppen. Führen Sie die Tests basierend auf den Methoden von Calixto Et Al. beschrieben 19.
      2. Aufzeichnung der vorderen und hinteren touch-Reaktion durch sanft streichelte eine Wimper Pick senkrecht über der Rute oder der Kopf (5 X, abwechselnd Kopf und Schweif) der Tiere.
      3. Erhalten Sie jede Bewegung in die entgegengesetzte Richtung des Pinselstrichs als 1 Punkt auf einer Skala von 0 bis 5 für die vordere und die hintere Antwort.
      4. Statistische Analyse mit einem One-Way ANOVA mit α = 0,05 und Bonferroni Post-Tests mit α = 0,05.
  5. Fruchtbarkeit-assay
    1. Um die Verwendung von Caenorhabditis Sieb Auswirkungen auf die Fortpflanzung zu ermitteln, wachsen Sie Alter-synchrone N2 Tiere an Tag 2 des Erwachsenenalters bei 25 ° C.
    2. 60 h nach Ei zu legen, Tiere auf neue NGM-Platten mit Platin holen oder Caenorhabditis Sieb übertragen und Ihnen 4 h zu erholen (trocken gesiebten Platten für 20-30 min).
    3. Geben Sie nach seiner Genesung individuell Teller holen die Tiere über eine Wimper NGM Platten ihnen 24 h um Eier zu legen, und entfernen Sie die Tiere. Lassen Sie die Nachkommen auf jeder Platte, unter normalen Bedingungen bei 25 ° C für ein weiteres 24 h zu entwickeln.
      Hinweis: Eine Wimper-Pick ist eine menschliche Wimpern sicherte sich am Ende einer Pasteurpipette mit Nagellack und sterilisiert mit Ethanol.
    4. Die Anzahl der lebensfähigen F1 Generation Individuen. Eine statistische Analyse mit einem T-Test mit α = 0,05.
      Hinweis: Lebensfähige Nachkommen gelten als Eier, die erfolgreich auszubrüten und beginnen ihre Entwicklung durch die regelmäßigen Larven Zyklen.
  6. Fluoreszierende Reporter Stress-Reaktion-assays
    1. Führen Sie drei häufigsten verwendeten fluoreszierenden Reporter Assays um potentielle Marker von Stress zu erkennen: ein DAF-16::GFP Translokation in den Kernen der Zellen in einem Stamm [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; Rol-6)]20; Hsp-16,2 Ausdruck [TJ375-gpIs1 (Hsp-16.2p::GFP)]21; und ein Sod-3 Ausdruck [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.
    2. Kultur für jeden Test, Alter-synchrone Tiere aus den drei Behandlungsgruppen bei 20 ° C und am Tag 3 des Erwachsenseins zu untersuchen: Verwenden Sie eine Negativkontrolle (auf einer täglichen Basis übertragen eine Gruppe von Tieren manuell mit einem Platin Pick), eine Positivkontrolle (auf einer täglichen Basis eine Gruppe von Tieren manuell mit einem Platin Pick plus eine etablierte Stressor übertragen), und das Sieb Caenorhabditis (die Tiere durch das Sieb passieren und es ihnen ermöglichen, für 30 min auf NGM kurz vor Bildgebung zu erholen).
    3. In der DAF-16::GFP-Assay Hitze Schock die Positivkontrolle Tiere bei 37 ° C für 30 min vor der imaging-20. Für die Hsp-16,2-Assay Hitze Schock die Positivkontrolle Tiere für 90 min, 20 h vor dem imaging-21. Für die Sod-3 Test behandeln Sie die Positivkontrolle Tiere mit 100 mM Paraquat für 4 h vor imaging22.
    4. Ernte die Würmer sofort mit einer Wimper Pick aus und Klebe sie auf einem deckgläschen mit 1 μl einer 36 % Poloxamer 407 Tensid-Lösung, die Würmer zu immobilisieren.
    5. Die montierten Würmer mit einem anderen Deckglas Sandwich. Montieren Sie zwei Deckgläsern zu einem Standardglas Mikroskopie Folie und Bild der Würmer mit einer 8 X Vergrößerung auf einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop (für eine allgemeine Vergrößerung von 80 X) und eine ständige Exposition mit einem FITC-Filter.
    6. Um Unterschiede zwischen den drei Gruppen in der DAF-16::GFP-Assay zu erkennen, zu kategorisieren die Tiere anhand der Position der DAF-16::GFP-Reporter (Kern-, wenn die Reporter, Kerne, cytosolischen umgesiedelt, befindet sich die Reporter in Cytosol und Mittelstufe, wenn der Reporter befindet sich in Kernen und Zytosol).
    7. Vergleichen Sie die Ergebnisse unter Verwendung eines ordinalen Logistik statistischen Modells in statistische Analyse-Software. Für die Hsp-16.2 und die Sod-3 Ausdruck Assays, verwenden Sie eine einfache ANOVA mit α = 0,05 und Tukey post Hoc Tests mit α = 0,05 um die totale Fluoreszenz des Kopfes zu vergleichen.

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Representative Results

Die Caenorhabditis Sieb besteht aus 2 Schraubverschlüsse, Sicherung einer Fläche von gewebtem Nylon Monofilament Netz kleiner als der Körperdurchmesser von der gewünschten Entwicklungsalter, zum Extrahieren von live Populationen von Organismen mit einer einfachen waschen-Technik verwendet. Es legt auf standard konischen Rohren und nutzt das Sieb mechanisch Tiere Sortieren nach Körperdurchmesser, verlassen die gewünschten Tiere in der Röhre fertig für die weitere Wartung und Experimente (z.B., Überweisung oder genetische Ernte). Eine sanfte manuelle waschen mit Caenorhabditis Sieb ist schnell, ca. 5 min pro 60 – 100 mm Platte und die Organismen sind einfach aus dem Netz wiederhergestellt.

Prozentuale Ausbeute von Tieren nach Caenorhabditis Sieb zu verwenden
Um die prozentuale Ausbeute an Caenorhabditis Sieb zu etablieren, wurden die Geräte mit 20 µm und 50 µm Porengröße Netze auf Erwachsene Tiere getestet. A bedeutet der Ertrag einer > 90 % erfolgreiche Tier Übertragung wurde für beide Maschenöffnungen getestet (Tabelle 1) erreicht.

Monofilament Netz mit unterschiedlicher Größe, die Lücken verwendet werden, um Tiere von verschiedenen Lebensphasen zu trennen. Netz mit 20 μm Lücken eignet sich zum Waschen entfernt Entwicklung von Embryonen und kleiner als der vierten Larvenstadium, behalten diese Larvenstadien (L4; mit einem Körper eines durchschnittlichen Durchmesser von 32 μm) und keine Tiere in späteren Lebensphasen, während Mesh mit 50 μm Lücken es allen ermöglicht andere Leben inszeniert abgesehen von Erwachsenen (mit einem Körper eines durchschnittlichen Durchmesser von 70 μm) (Tabelle 2) weggespült werden.

Caenorhabditis Sieb-Einsatz hat keinen Einfluss auf Healthspan Metriken
Motilität: In C. Elegans die normale sinusförmige Bewegung (d.h. Motilität) mit dem Alter18 abnimmt und ist ein Marker für die allgemeine Gesundheit. Um festzustellen, wenn das Sieb Caenorhabditis Motilität beeinflusst, Motilität Werte wurden im Vergleich zur Abholung, FUDR und Caenorhabditis Sieb Behandlungsgruppen an Tagen 2, 4, 6 und 8 des Erwachsenenalters. Alle Tiere in jeder Gruppe (n = 10/Gruppe) normal und spontane Bewegungsmuster (Klasse A) bei mehreren Altersgruppen im gesamten Erwachsenenalter ausgestellt (Tagen 2, 4, 6 und 8 des Erwachsenseins; p > 0,05 für Mehrfachvergleiche an allen Tagen, Abbildung 3).

Pharyngealen Pumprate: Die Fähigkeit von C. Elegans pharyngealen Muskeln Pumpen mit dem Alter abnimmt und ist ein weiterer Biomarker Healthspan23. Um festzustellen, ob das Sieb Caenorhabditis pharyngealen Pumprate, Pick, FUDR und Caenorhabditis der Tiere beeinflusst Sieb Behandlungsgruppen an Tagen 2, 4, 6 und 8 des Erwachsenenalters verglichen wurden (n = 8 bis 10 pro Gruppe). An 6 Tagen gab es ein signifikanten Unterschied zwischen den Tieren, die die Ernte unterzogen und FUDR Methoden (p < 0,001) und 8 (p < 0,001). Auch gab es ein signifikanten Unterschied zwischen dem Sieb und FUDR Gruppen an 6 Tagen (p < 0,001) und 8. Tag des Erwachsenenalters (p < 0,001). Allerdings gab es keinen statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Pick- and - Caenorhabditis Sieb Gruppen für jeden Tag (p > 0,05, Abbildung 4), darauf hinweist, dass das Sieb nicht diese Maßnahme Healthspan auswirkt.

Sanfte Berührung Antwort: Reaktion auf mechanische Reiz ist ein physiologischer Marker zu beurteilen, Alterung oder allgemeine Gesundheit24,25; So wurden die Auswirkungen der verschiedenen Methoden auf die vordere und die hintere sanfte Berührung Antworten getestet. Gab es keinen statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Pick, FUDR und Caenorhabditis Sieb Behandlungsgruppen (n = 8/Gruppe), vorn oder nach hinten, für jeden Tag der Tests (p > 0,4 für alle Vergleiche; Abbildung 5A und 5 b).

Fruchtbarkeit: Herstellen unabhängig davon, ob die Caenorhabditis Sieb die Höhe des lebensfähige Nachkommen produziert von C. Elegans, die einzelnen Nachkommen produziert innerhalb von 24 h am Tag 3 des Erwachsenenalters beeinflusst wurde gezählt und verglichen (n = 20 bis 22 pro Gruppe). Die Verwendung von Caenorhabditis Sieb wirkte nicht deutlich aus der Anzahl der Nachkommen produziert im Vergleich zu einer Pick-Behandlungsgruppe (p = 0,61, Abbildung 6).

Molekulare Reporter assays
DAF-16 nukleare Translokation: In C. Elegansist die Aktivierung des Transkriptionsfaktors DAF-16 mit erhöhtem Stress Widerstand26verbunden. Die nukleare Lokalisierung von DAF-16 wurde in einem transgenen Nematoden Stamm TJ356, untersucht die DAF-16 verschmolzen zu einem grün fluoreszierendes Protein (DAF-16::GFP)-20zum Ausdruck bringt. Unter normalen Wachstumsbedingungen DAF-16::GFP ist in erster Linie in das Zytosol lokalisiert, aber unter verschiedenen Stressoren (z.B. Hitzestress), ist es schnell in die Kern-20umgesiedelt. Um die Auswirkungen der Sortierung mit Caenorhabditis Sieb auf DAF-16 Translokation zu testen, DAF-16::GFP Lokalisierungen wurden verglichen, in Alter abgestimmt Tag-5 Erwachsene in einer positiven Kontrollgruppe (Hitzestress), einer negativen Kontrollgruppe (manuelle Übertragung per Pick), und ein Caenorhabditis Sieb Behandlungsgruppen (n = 10 pro Gruppe). Der Transfer mit dem Caenorhabditis Sieb hatte keinen Einfluss auf die nukleare Translokation von DAF-16::GFP und zeigten einen ähnlichen Phänotyp der Negativkontrolle Tiere (p > 0,05, Abbildung 7).

HSP-16,2 Reporter: kleine HITZESCHOCKPROTEINE wie HSP-16,2 sind Biomarker für eine Stress-Reaktion, und sie werden hoch exprimiert, während eine Exposition gegenüber Hitzeschock oder oxidativen Stress Agenten21,27. Die TJ375-Sorte hat ein GLP-Reporter-gen verschmolzen mit einer Hsp-16,2-Promotor, der nicht unter normalen Bedingungen21aktiv ist. Jedoch nach einer Exposition gegenüber einem Hitzeschock, HSP-16,2-Protein-Expression induziert wird, und die Tiere zeigen hohe GFP Ausdruck21. Testen Sie die Beteiligung der Caenorhabditis Sieb auf ein HSP-16,2-vermittelte Stressreaktion, die Fluoreszenz-Dichte in der Region des Rachens (n = 10 Tiere/Gruppe) von Tieren Alter abgestimmt wurde in Tag-5 Erwachsene zwischen einer positiven Kontrollgruppe (Wärme verglichen Stress), eine Negative Kontrolle Gruppe (Kommissionierung) und Caenorhabditis Sieb Behandlungsgruppe. Der Transfer mit dem Caenorhabditis Sieb nicht deutlich induzieren die Expression von HSP-16.2::GFP (Hsp-16.2::gfp) im Vergleich zu der negativen Kontrolle (p > 0,05, Abbildung 8).

SOD-3 Reporter: In C. Elegansist das Anti-Oxidationsmittel-gen, das für Superoxid-Dismutase (SOD-3) 3 codes bis geregelt während oxidativen Stress28. C. Elegans Stamm CF1553 drückt grünes fluoreszierendes Protein (GFP)-mit der Bezeichnung SOD-3 Veranstalter, deren Expression durch oxidativen Stressfaktoren, wie Paraquat5induziert wird. Um die Beteiligung der Caenorhabditis Sieb Sortierung auf die antioxidativen Reaktion in C. Eleganszu testen, die Fluoreszenz-Dichte im Kopfbereich des Tag-5 Erwachsene Alter abgestimmt zwischen einer Positivkontrolle Bevölkerung (100 μM Paraquat im Vergleich -Behandlung), eine negative Kontrollgruppe (manuellen Kommissionierung), und ein Caenorhabditis Sieb übertragen-Bevölkerung. Der Transfer mit dem Caenorhabditis Sieb nicht deutlich induzieren die Expression von Sod-3::gfp im Vergleich zu der negativen Kontrolle (p > 0,05, Abbildung 9).

Figure 1
Abbildung 1: Caenorhabditis Sieb Bau. Das Fortschreiten der "Do it yourself" Herstellung des Werkzeugs wird angezeigt. Diese Tafeln zeigen (A) zwei 50 mL konische Rohr Kappen (B) deren Mittelpunkte entfernt wurden, (C) geschnittene Kanten geglättet, und (D - F), die mit Monofilament Netz entsprechend der gewünschten Lebensstadium von C. Elegans ausgestattet sind (Einzelheiten siehe Protokoll ). (G) zeigt die fertige Sieb auch. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Schrittweise Darstellung von Caenorhabditis Sieb nutzen. (A) das Sieb vorher nass mit einem Tropfen M9 Lösung, und (B) passen auf eine 50 mL konische Rohr. (C) 1 mL der M9 Lösung mit Würmern auf der Oberseite des Siebes, (D) pipettieren ist, die eine 50 mL konische Rohr auf das Sieb mit den Würmern mit Blick auf das Innere des Rohres und (E) das Sieb mit einem neu angeschlossenen platziert wird obere Rohr ist schnell umgedreht o Version (G) das Sieb wird mit M9 gespült tragen die gewünschten Tiere in die neue 50 mL Tube und die Würmer dürfen durch die Schwerkraft an der Unterseite des Rohres zu begleichen. (H) die Würmer sind pipettiert und als Tropfen auf einem frischen NGM Teller platziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Caenorhabditis Sieb keinen Einfluss auf Motilität in der gesamten Lebensspanne. Diese Abbildung zeigt die Motilität Klasse Verteilung der Tiere am Tag 2, 4, 6 und 8 des Erwachsenseins zur Abholung, FUDR, und Caenorhabditis Sieb Behandlungsgruppen. Klasse A Tiere zog normalerweise spontan, Klasse B Tiere ungewöhnlich bewegt und gegebenenfalls haben, drängen, und Klasse C Tiere waren unfähig sich zu bewegen. Es gab keinen Unterschied zwischen Caenorhabditis Sieb, Pick- and -FUDR Gruppen (p > 0.05). Drei Wiederholungen (n = 10 Tiere pro Behandlung Platte) durchgeführt und mit ordinalen logistisches Modell analysiert wurden. Klasse B Tiere. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Caenorhabditis Sieb-Einsatz keinen Einfluss auf pharyngealen Pumpen während der gesamten Lebensdauer. Diese Abbildung zeigt die pharyngealen Pumpe Preise von holen, FUDR, und Caenorhabditis Sieb Behandlungsgruppen, verglichen an Tagen 2, 4, 6 und 8 des Erwachsenenalters. Die Sternchen bezeichnen eine Bedeutung zwischen dem Pick, Sieb und FUDR Behandlungsgruppen für die Tage angegeben (*** p < 0,05). Es gab keinen Unterschied zwischen Caenorhabditis Sieb und der Pick-Gruppe (p > 0.05). Zwei Wiederholungen (N = 10 Tiere pro Behandlung Platte) durchgeführt und eine einfache ANOVA mit einer Bonferroni Posttest analysiert wurden. Die Balken repräsentieren den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Caenorhabditis Sieb Verwendung keine Auswirkungen anterior Touch-Reaktion in der gesamten Lebensspanne. Diese Tafeln zeigen (A) der vorderen und (B) der hinteren Touch Antwort Graf von Pick, FUDR und Caenorhabditis Sieb Behandlungsgruppen im Vergleich an Tagen 2, 4, 6 und 8 des Erwachsenenalters. Zwei Wiederholungen wurden durchgeführt mit N = 10 für jede Behandlungsgruppe und im Vergleich mit einem One-Way ANOVA und ein Bonferroni Post-Test (p = 0,4 und p = 0,9 für Front- und Seitenzahnbereich, beziehungsweise). Die Balken repräsentieren den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Caenorhabditis Sieb wirkte nicht aus der Menge an lebensfähigen Nachkommen am 3. Tag des Erwachsenenalters. Diese Abbildung zeigt die lebensfähigen Nachkommen von Tag 3 Erwachsene nach einer 24 h eierlegende, Tag 3 des Erwachsenenalters für Elterntiere überspannt. Die Balken repräsentieren den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. N = 20-22 Tiere aus mindestens zwei separaten biologischen Wiederholungen pro Behandlungsgruppe. Die Behandlungsgruppen sind im Vergleich mit einem t-test (p > 0.05). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Caenorhabditis Sieb hatte keinen Einfluss auf nukleare Translokation von DAF-16::GFP. Diese Tafeln zeigen repräsentative Bilder der DAF-16 Translokation der Gruppe (A) einen Hitzeschock (Positivkontrolle), (B) ein Pick-Gruppe (Negativkontrolle) und (C) ein Caenorhabditis Sieb Behandlungsgruppe. (D) die Tiere in die positive Kontrollgruppe angezeigt eine Aktivierung der DAF-16 nukleare Translokation. Caenorhabditis Sieb nicht dazu veranlassen, eine nukleare Translokation und cytosolischen Schmelzverfahren Protein ähnlich wie die Tiere in der negativen Kontrollgruppe angezeigt. N = 10 Tiere pro Behandlungsgruppe aus mindestens drei getrennte biologische repliziert. Die Behandlungsgruppen wurden eine einfache ANOVA mit einem Tukey post Hoc Test verglichen. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8: Caenorhabditis Sieb hatte keinen Einfluss auf die Expression von Hsp16.2::gfp. Die HSP-16,2 Ausdrücke (in willkürlicher Fluoreszenz Einheiten) ein Hitze-Schock-Gruppe (Positivkontrolle), einer Pick-Gruppe (Negativkontrolle) und Caenorhabditis Sieb Behandlungsgruppe werden verglichen. Die Sternchen bezeichnen eine hohe Expression von Hsp16.2::gfp für die positive Kontrollgruppe war signifikant verschieden von den anderen Behandlungsgruppen (*** p < 0,05). Caenorhabditis Sieb hatte keinen Einfluss auf den Hsp16.2::gfp Ausdruck und Fluoreszenz-Intensitäten ähnlich wie Tiere in der negativen Kontrollgruppe angezeigt (p > 0.05). Drei Wiederholungen wurden durchgeführt mit N = 10 für jede Behandlungsgruppe und eine einfache ANOVA mit einem Tukey post Hoc Test verglichen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 9
Abbildung 9: Caenorhabditis Sieb hatte keinen Einfluss auf die Expression von Sod-3::gfp. Die SOD-3 Ausdrücke (in willkürlicher Fluoreszenz-Einheiten) 100 μM Paraquat Gruppe (Positivkontrolle), einer Pick-Gruppe (Negativkontrolle) und Caenorhabditis Sieb Behandlungsgruppe werden angezeigt. Die Sternchen bezeichnen eine hohe Expression von Sod-3::gfp für die positive Kontrollgruppe signifikant verschieden von den anderen Fraktionen war (*** p < 0,05). Caenorhabditis Sieb hatte keinen Einfluss auf die Sod-3::gfp Ausdruck und Fluoreszenz-Intensität, die ähnlich wie die Tiere in der negativen Kontrollgruppe angezeigt (p > 0.05). Drei Wiederholungen wurden durchgeführt mit N = 10 für jede Behandlungsgruppe und eine einfache ANOVA mit einem Tukey post Hoc Test verglichen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Netzgröße N = 50 N = 100
20 μm 95.33 %
50 μm 99,00 % 93.33 %

Tabelle 1: prozentuale Ausbeute von Maschenweiten. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse eines 20 μm-Geräts getestet mit N = 50 Erwachsene für 3 Wiederholungen und einem 50 μm Gerät getestet mit N = 50 Erwachsene für 2 Wiederholungen und mit N = 100 für 3 Wiederholungen.

Netzgröße Entwicklungsstadium Körperdurchmesser
20 μm Larvenstadium 4 ~ 35 μm
50 μm Tag 1 Erwachsener ~ 70 μm

Tabelle 2: mittlere Körperdurchmesser. Diese Tabelle zeigt die mittlere Körperdurchmesser von durchschnittlich 3 Messungen gleichermaßen verteilt jeder Wurm für 15 Tiere in jeder Lebensphase der gemessenen erworben.

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Discussion

Hier haben wir die Gestaltung und Nutzung der zugänglichen, effektive Caenorhabditis Sieb als Werkzeug für die Sortierung und Pflege C. Elegans. Dieses Tool hat mehrere Vorteile, manuell auswählen einzelner Tiere, Wasch-Populationen, chemische Behandlungen (z.B.FUDR) und teurer Methoden der Trennung Tiere. Erstens die Caenorhabditis Sieb schnell und effizient (weniger als 20 min) sortiert Nachkommen aus großen gemischten Populationen von Tieren (Tabelle 2). Auch die Verwendung des Werkzeugs hat keine nachweisbaren toxischen Wirkungen auf die Tiere Healthspan (Bild 3, Bild 4, Bild 5, Abbildung 6), nicht dazu veranlassen, gut beschriebene genetische Belastung Reporter (Abbildung 7und Abbildung 8 Abbildung 9), und reduziert die Menge der ausländischen Chemikalie, die die angewandte Behandlung, um die Kultur-Platten oder jede Molekulare Assay danach beeinflussen könnten. Die Benutzerfreundlichkeit ist ein wesentlicher Vorteil; ein Forscher in jeder Phase ihrer Ausbildung kann trainiert werden, zu verwenden (Abbildung 1 und Abbildung 2; ( Protokoll).

Für die Herstellung und Verwendung des Siebes (z.B., Pipetten, Puffer) die benötigten Materialien sind leicht zugänglich in standard Forschungslabors; Deshalb wenn kaputt, Caenorhabditis Sieb nicht teuer zu ersetzen oder zu reparieren. Die selbst konstruierte Natur der Caenorhabditis Sieb ermöglicht es ein vielseitiges Werkzeug sein: Es kann gebaut werden, mit Mesh Größen passend für verschiedene C. Elegans Entwicklungsstadien und Phänotypen. Die Caenorhabditis Sieb kann auch verwendet werden, in Tests durchgeführt, in anderen Nematoden Arten oder wenn kleine Organismen, sofern die entsprechenden Maschenweite isolieren bei der Herstellung verwendet wird.

Zusätzlich zu den Vorteilen bietet dieses Tool für C. Elegans Bevölkerung Wartung das Sieb verwendet werden, um die Tiere vor ihrer Verwendung in anderen experimentellen Anwendungen reinigen. Beispielsweise mit der Entwicklung der Mikrofluidik durchzuführen C. Elegans kommt Forschung die Frage der Chip Gebrauch und Reinigung. Je nach der Menge der Bakterien an den Tieren angebracht müssen besondere Vorkehrungen getroffen werden, um nicht den Mikrofluidik-Chip, Rendern es unbrauchbar29verstopfen. Oft, wenn C. Elegans werden auf einem Mikrofluidik-Chip übertragen, ist Rückstände aus dem bakteriellen Rasen mitgebracht. Dieser Rückstand kann und die mikrofluidischen Kanäle, so dass die Chip-Fehlfunktion, wonach dann Reinigung oder den Austausch verstopfen. Das Gerät Konstrukt in diesem Protokoll bietet eine Methode für die Ernte nicht nur synchronisierte Tiere für Mikrofluidik, sondern auch für die Reinigung der Tiere vor ihrer Einfügung in ein mikrofluidischen Gerät. Durch Entfernen der Trümmer und bakterielle Rückstände, aufgenommen beim Sammeln von Tieren, sind die mikrofluidische Kanäle weniger anfällig für Fehlfunktionen, wodurch sich die Lebensdauer der einzelnen Chips und dem anschließenden Durchsatz von Untersuchungen mit ihnen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben. Die Autoren erklären, dass die Forschung in der Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen geführt wurde, die als ein potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnte.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Danke Heather Currey für ihren ersten Beitrag, das Studiendesign und Dr. Swarup Mitra für seine kritische Durchsicht des Manuskripts. Wir möchten auch danke Dr. Michael B. Harris für Kommentare, Verbesserungen und Unterstützung bei der Erstellung der Demonstration dieser Methodik. Die Stämme lieferte Caenorhabditis Genetik Zentrum, das von den NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Die Forschung in dieser Publikation berichtet wurde durch das National Institute Of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Preis zahlen UL1GM118991, TL4GM118992 oder RL5GM118990 und institutionelle Entwicklung Award (IDeA) unterstützt. das National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Grant Nummer 5P20GM103395-15. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health. UA ist AA/EO Arbeitgeber und Bildungseinrichtung und verbietet illegale Diskriminierung einer Person: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Safety glasses Uline S-21076
Protective heat resistant glove Grainger Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube Falcon 14-432-22
Synthetic Nylon mesh Dynamic
Aqua-Supply Ltd		 NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue Scotch Super Glue Liquid SAD114
Pliers Vampliers VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file Lowe's Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR Sigma F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)  Sigma  S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127 Sigma P2443
Paraquat dichloride hydrate Sigma 36541
Inverted fluorescence microscope Olympus FSX100

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References

  1. C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  2. Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
  3. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  4. Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
  5. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
  6. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
  7. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
  8. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
  9. Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
  10. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
  11. Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
  12. Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).
  13. Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
  14. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
  15. Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
  16. Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
  17. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  18. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  19. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  20. Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
  21. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  22. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  23. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
  24. Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
  25. Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
  26. Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).
  27. Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
  28. Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
  29. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).

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Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms. J. Vis. Exp. (137), e58014, doi:10.3791/58014 (2018).

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