Caenorhabditis Tamis : Un Instrument rudimentaire et une méthodologie pour le tri des petits organismes multicellulaires
Summary
Le protocole actuel comprend une méthodologie pour le tri et le nettoyage des populations appariés selon l’âge de elegans de Caenorhabditis. Il utilise un simple, peu coûteux et un outil sur mesure efficace pour obtenir une grande population expérimentale de nématodes pour la recherche.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un organisme de modèle bien établi utilisé dans un éventail de recherche fondamentale et recherche biomédicale. Au sein de la communauté des chercheurs nématodes, on a besoin d’un moyen abordable et efficace maintenir les populations de c. elegansgrandes, appariés selon l’âge. Nous présentons ici une méthodologie pour mécaniquement tri et nettoyage c. elegans. Notre objectif est de fournir un processus rentable, efficace, rapide et simple pour obtenir des animaux de tailles uniformes et étapes de la vie pour leur utilisation dans des expériences. Cet outil, le tamis de Caenorhabditis , utilise un système de couvercle sur mesure qui fils sur commune tubes à essai conique et trie c. elegans , basé sur la taille du corps. Nous démontrons également que le tamis de Caenorhabditis transfère effectivement animaux de plaque d’une culture à une autre permettant un tri rapide, synchronisation et nettoyage sans impact sur les marqueurs de la santé, y compris de la motilité et stress-inductible journalistes de gène. Cet outil accessible et novatrice est une option rapide, efficace et non stressant pour maintenir les populations de c. elegans .
Introduction
Le ver nématode Caenorhabditis elegans, est un organisme modèle premier ministre. Outre le caractère simple et contrôlé de leur culture en laboratoire, leur génome est séquencé1 et le sort du développement de chaque cellule est connu2. En raison de ces caractéristiques, le c. elegans est un organisme modèle largement utilisé pour des études génétiques. Toutefois, avec ces caractéristiques bénéfiques viennent des défis pour les chercheurs. En raison de leur durée d’une génération rapide, des populations de c. elegans peuvent rapidement manquer de nourriture et/ou mélangées avec plusieurs générations, les populations et les stades présentent à la fois. Ainsi, les expériences réalisées sur des milieux solides nématode (NGM) nécessitent chercheurs de déplacer physiquement les animaux aux plaques de frais avant que la source de nourriture bactérienne est épuisée et développent de nouvelles larves. Cela peut être fastidieux car un transfert fréquent des animaux est nécessaire pour éviter les populations expérimentales de devenir mélangé à des générations de descendants. Pourtant, certaines expériences nécessitent tous deux un grand nombre d’animaux et de points de temps prolongée (p. ex., extraction de l’ADN ou l’ARN à l’âge adulte). Cela composés les défis de maintenant une population synchronisée avec précision et de transférer un grand nombre d’animaux.
Les méthodes actuelles de transfert c. elegans cultivés sur NGM cueillette ou laver les animaux de la plaque à la table ; traitement chimique des animaux (p. ex., avec la réplication de l’ADN inhibiteur fluorodésoxyuridine ou FUDR) ; ou à l’aide de cytométrie de flux pour trier les animaux en plaques multipuits. La cueillette implique l’utilisation d’un outil à main, réalisé avec un mince fil de platine ou un cil, de transférer manuellement particulier ou plusieurs animaux3,4. Cette méthode est précise mais exige des compétences et temps et une limitation pour les études portant sur un grand nombre d’animaux. Cueillette de mai également être physiquement préjudiciables et stressante pour les animaux en soumettant potentiellement particuliers aux montants peu naturelle et incohérentes de perturbation et de force. Lavage implique une boîte de Pétri avec une solution tampon de rinçage et transfert de la solution avec les animaux par le biais de pipette Pasteur en verre pour une nouvelle plaque de culture. Cette méthode est rapide et efficace, mais n’est pas exacte, comme plusieurs générations et des stades de développement des animaux sont transférés en vrac. Les traitements chimiques, tels que FUDR, peuvent être dissous dans les médias culture afin d’éviter la production de descendants à travers bloquant toute réplication de l’ADN et donc, le développement de la production et oeuf de gamète. Bien qu’efficace, cette méthode doit être appliquée après la maturation du développement quant à ne pas perturber les processus normales de développement, et cela signifie qu’il y a toujours une obligation de transférer les animaux avant son administration3. Cette méthode influe aussi sur les multiples cellulaires voies de signalisation, entraînant des effets notables sur les animaux en vieillissant (par exemple, une extension de la durée de vie ou une altération protéostasie) selon les souches c. elegans utilisé5, 6,7,8,9,10. Cytométrie en flux méthodes automatiquement trier et transférer des elegans de Caenorhabditis d’une plaque multipuite à un autre11. Bien que cette méthode est très efficace et efficient, équipements de cytométrie en flux est prohibitivement cher et inaccessible à beaucoup de chercheurs. Une alternative au transfert des animaux est d’utiliser des modèles de mutants qui sont sensible, tels que fer-15 et MEF-1, qui deviennent stériles avec réglage de température12la température. En utilisant des animaux mutants est utile dans certaines situations, ces souches spécifiques croissent plus lentement que les animaux sauvage et ils comptent sur un génome altéré, servant en tant que représentants de pauvres pour les vers de vieillissement ou en bonne santé. En outre, le recours à un changement de température pour provoquer la stérilité se traduit également par l’absence d’un environnement statique, et des changements de température montrent facilement influencer gène expressions13,14, 15. groupes de recherche ont été publiés techniques décrivant l’utilisation d’un maillage de filtre c. elegans taille16. Cependant, nous n’avons pu trouver des travaux précédents tests pour tout changement dans l’état de santé global qui peut être associée à l’utilisation de ces filtres.
Il faut, par conséquent, au sein de la communauté de recherche de c. elegans pour une méthode abordable, efficace, rapide et précise pour le transfert d’un grand nombre d’animaux entre les plaques de culture. Nous avons développé une pièce améliorée et accessible des équipements (nommé le tamis de Caenorhabditis ) et un protocole associé pour sa réalisation et de fonctionnement répondant aux besoins de la communauté de recherche de c. elegans . Ici, nous partageons la conception du Caenorhabditis tamis et méthodes pour son utilisation, et nous démontrer que son utilisation n’influe pas sur la santé commune ou des marqueurs de stress par rapport à la cueillette manuelle standard et un traitement avec l’usage courant, FUDR chimique privatives de fertilité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons introduit la conception et l’utilisation de la passoire de Caenorhabditis accessible, efficace comme un outil pour le tri et le maintien de c. elegans. Cet outil présente plusieurs avantages à choisir manuellement chaque animal, le lavage des populations, des traitements chimiques (p. ex., FUDR) et des méthodes plus coûteuses d’animaux en ségrégation. Tout d’abord, le Caenorhabditis tamis efficacement et rapidement (moins de 20 min) trie les descendances de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier Heather Currey pour sa première contribution à la conception de l’étude et m. Swarup Mitra pour son examen critique du manuscrit. Nous tenons également à remercier le Dr. Michael B. Harris de commentaires, de raffinements et d’assistance dans la production de la démonstration de cette méthodologie. Les souches ont été fournis par le centre de génétique de Caenorhabditis, qui est financé par le NIH Office de programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440). La recherche rapportée dans cette publication a été financée par le National Institute Of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health, sous attribution numéros UL1GM118991, TL4GM118992 ou RL5GM118990 et par une bourse de développement institutionnel (IDeA) de le National Institute of General Medical Sciences de la National Institutes of Health, sous concession numéro 5P20GM103395-15. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health. UA est une institution éducative et un employeur AA/EO et interdit toute discrimination illégale contre n’importe quel individu : www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
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