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Developmental Biology

Caenorhabditis चलनी: छोटे कोशिकीय जीवों की छंटाई के लिए एक कम तकनीक साधन और कार्यप्रणाली

Published: July 4, 2018 doi: 10.3791/58014
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 2, 5
1Department of Biology and Wildlife, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 4Departments of Biology and Chemistry, Earlham College, 5Department of Biological Sciences, College of Natural Science and Mathematics, California State University Long Beach
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल छंटाई और उंर की सफाई Caenorhabditis एलिगेंस के मिलान आबादी के लिए एक पद्धति भी शामिल है । यह एक सरल, सस्ती और कुशल कस्टम उपकरण का उपयोग करता है अनुसंधान के लिए सूत्रकृमि की एक बड़ी प्रयोगात्मक जनसंख्या प्राप्त करने के लिए ।

Abstract

Caenorhabditis एलिगेंस (C. एलिगेंस) एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल बुनियादी और जैव चिकित्सा अनुसंधान की एक श्रेणी में इस्तेमाल किया जीव है । निमेटोड अनुसंधान समुदाय के भीतर, वहां एक किफायती और प्रभावी तरीका है, सी एलिगेंसके बड़े उंर मिलान आबादी बनाए रखने के लिए एक की जरूरत है । यहां, हम यांत्रिक छंटाई और सी एलिगेंससफाई के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करते हैं । हमारा उद्देश्य एक लागत प्रभावी, कुशल, तेज, और सरल करने के लिए एक समान आकार और प्रयोगों में उनके उपयोग के लिए जीवन चरणों के पशुओं को प्राप्त करने की प्रक्रिया प्रदान करना है । इस उपकरण, Caenorhabditis छलनी, एक कस्टम निर्मित ढक्कन प्रणाली का उपयोग करता है कि आम शंकु लैब ट्यूबों पर धागे और शरीर के आकार के आधार पर सी एलिगेंस तरह । हम यह भी है कि Caenorhabditis चलनी प्रभावी ढंग से एक संस्कृति थाली से एक और एक तेजी से छंटाई, तुल्यकालन के लिए अनुमति के लिए पशुओं के हस्तांतरण, और गतिशीलता और तनाव सहित स्वास्थ्य के मार्करों प्रभावित बिना सफाई-inducible जीन पत्रकारों । यह सुलभ और अभिनव उपकरण एक तेज, कुशल, और गैर सी एलिगेंस आबादी बनाए रखने के लिए विकल्प तनावपूर्ण है ।

Introduction

निमेटोड कीड़ा, Caenorhabditis एलिगेंस, एक प्रमुख मॉडल जीव है । प्रयोगशाला में उनकी खेती की सीधी और नियंत्रित प्रकृति के अलावा, उनके पूरे जीनोम का अनुक्रम1 है और प्रत्येक कोशिका के विकासात्मक भाग्य को2जाना जाता है. इन सुविधाओं के कारण, सी एलिगेंस आनुवंशिक अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मॉडल जीव है । हालांकि, इन लाभकारी विशेषताओं के साथ साथ शोधकर्ताओं के लिए कुछ चुनौतियां आती हैं । उनके तीव्र पीढ़ी के समय के कारण, C. एलिगेंस आबादी जल्दी से भोजन से बाहर चला सकते हैं और/या कई पीढ़ियों और विकासात्मक एक बार में मौजूद चरणों के साथ मिश्रित आबादी बन जाते हैं । इस प्रकार, ठोस निमेटोड विकास मीडिया (NGM) पर प्रदर्शन प्रयोगों के लिए शोधकर्ताओं को शारीरिक रूप से ताजा प्लेटों के लिए जीवाणु खाद्य स्रोत घट जाती है और नए लार्वा विकसित करने से पहले स्थानांतरित करने की आवश्यकता है । यह पशुओं के लगातार स्थानांतरित करने के रूप में थकाऊ हो सकता है वंश पीढ़ियों के साथ मिश्रित बनने से प्रयोगात्मक आबादी को रोकने के लिए आवश्यक है । फिर भी, कुछ प्रयोगों दोनों बड़ी संख्या में पशुओं की आवश्यकता होती है और विस्तारित समय अंक (जैसे, वयस्कता में डीएनए या आरएनए निष्कर्षण). इस यौगिकों सही एक सिंक्रनाइज़ जनसंख्या को बनाए रखने और पशुओं की बड़ी संख्या में स्थानांतरित की चुनौतियों ।

NGM पर एलिगेंस कल्चर्ड स्थानांतरित करने के वर्तमान तरीके उठा रहे हैं या प्लेट से जानवरों को प्लेट से धो रहे हैं; रासायनिक जानवरों के इलाज (जैसे, डीएनए प्रतिकृति अवरोध करनेवाला fluorodeoxyuridine या FUDR के साथ); या प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए बहु अच्छी तरह से प्लेटों में जानवरों की तरह । उठा एक हाथ उपकरण का उपयोग शामिल है, या तो एक पतली प्लैटिनम तार या एक बरौनी के साथ बनाया, को मैंयुअल रूप से व्यक्तिगत या कई पशुओं के हस्तांतरण3,4। इस विधि सही है, लेकिन दोनों कौशल और समय की आवश्यकता है और पशुओं की बड़ी संख्या को शामिल अध्ययन के लिए एक सीमा है । उठा भी शारीरिक रूप से हानिकारक और संभावित रूप से अशांति और बल के अप्राकृतिक और असंगत मात्रा के लिए व्यक्तियों को subjecting द्वारा पशुओं के लिए तनावपूर्ण हो सकता है । धुलाई एक बफर समाधान के साथ एक संस्कृति पकवान धोने शामिल है और एक नई संस्कृति प्लेट को कांच पाश्चर पिपेट के माध्यम से पशुओं के साथ समाधान स्थानांतरित । इस विधि तेजी से और कुशल है, लेकिन कई पीढ़ियों और पशुओं के विकास के चरणों के रूप में सटीक नहीं है थोक में स्थानांतरित कर रहे हैं । ऐसे FUDR के रूप में रासायनिक उपचार, संवर्धन मीडिया में भंग किया जा सकता है किसी भी डीएनए प्रतिकृति अवरुद्ध के माध्यम से वंश के उत्पादन को रोकने के लिए, और इस प्रकार, gamete उत्पादन और अंडा विकास । जबकि प्रभावी, इस विधि के रूप में विकासात्मक परिपक्वता के बाद लागू किया जाना चाहिए सामांय विकास प्रक्रियाओं को बाधित नहीं है, और इसका मतलब यह है कि वहां अभी भी एक आवश्यकता के लिए अपने प्रशासन3से पहले पशुओं के हस्तांतरण है । इस विधि भी कई सेलुलर संकेत रास्ते को प्रभावित करता है, जानवरों पर ध्यान देने योग्य प्रभाव में जिसके परिणामस्वरूप के रूप में वे उंर (जैसे, एक उंर विस्तार या एक बदल proteostasis) C. एलिगेंस के तनाव के आधार पर5इस्तेमाल किया, 6,7,8,9,10. प्रवाह cytometry तरीकों स्वचालित रूप से सॉर्ट और एक बहु-अच्छी थाली से एक और11के लिए व्यक्तिगत सी एलिगेंस हस्तांतरण । हालांकि इस विधि बहुत प्रभावी और कुशल है, प्रवाह cytometry उपकरण नकारात्मक स्तर तक महंगा है और कई शोधकर्ताओं के लिए दुर्गम है । स्थानांतरित करने के लिए एक विकल्प के उत्परिवर्ती मॉडल है कि तापमान संवेदनशील हैं, जैसे fer-15 और फेम-1, जो तापमान समायोजन12के साथ बाँझ हो जाते हैं का उपयोग करने के लिए है । जबकि उत्परिवर्ती जानवरों का उपयोग कुछ स्थितियों में उपयोगी है, इन विशिष्ट उपभेदों जंगली प्रकार के पशुओं की तुलना में धीमी हो जाना और वे एक बदल जीनोम पर भरोसा करते हैं, उंर बढ़ने या स्वस्थ कीड़े के लिए गरीब प्रतिनिधियों के रूप में सेवारत । इसके अलावा, एक तापमान पर निर्भरता के लिए एक स्थिर वातावरण के अभाव में बाँझ भी परिणाम प्रेरित करने के लिए बदलाव, और तापमान परिवर्तन किया गया है आसानी से जीन अभिव्यक्ति13,14को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, 15. अनुसंधान समूहों पहले आकार16से फ़िल्टर C. एलिगेंस करने के लिए एक जाल के उपयोग का वर्णन तकनीक प्रकाशित किया है । हालांकि, हम इस तरह के फिल्टर के उपयोग के साथ जुड़ा हो सकता है कि समग्र स्वास्थ्य परिणामों में किसी भी परिवर्तन के लिए पिछले काम परीक्षण खोजने में असमर्थ थे.

वहां है, इस प्रकार, एक किफायती, कुशल, तेजी से और संस्कृति प्लेटों के बीच पशुओं की बड़ी संख्या में स्थानांतरित करने के लिए सही विधि के लिए सी एलिगेंस अनुसंधान समुदाय के भीतर की जरूरत है । हम एक सुधार, उपकरणों का सुलभ टुकड़ा विकसित किया है ( Caenorhabditis छलनी नाम) और इसके निर्माण और आपरेशन कि सी एलिगेंस अनुसंधान समुदाय की जरूरतों को पूरा करने के लिए एक संबद्ध प्रोटोकॉल । इस के साथ साथ, हम Caenorhabditis छलनी और इसके उपयोग के लिए तरीकों के डिजाइन का हिस्सा है, और हम प्रदर्शित करता है कि इसके उपयोग आम स्वास्थ्य या किसी भी तनाव मार्करों जब मानक मैनुअल उठा और आमतौर पर इस्तेमाल के साथ एक इलाज की तुलना में प्रभाव नहीं पड़ता, प्रजनन-रासायनिक FUDR सीमित ।

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Protocol

1. Caenorhabditis चलनी निर्माण और उपयोग

  1. निर्माण प्रोटोकॉल
    1. ५० एमएल शंकु ट्यूबों (चित्रा 1a) से 2 ढक्कन मोल ।
    2. ढक्कन के भीतरी होंठ के अंदर केंद्र क्षेत्र निकालें (जब नीचे से रीजोलुशन, आंकड़ा 1b) एक Bunsen बर्नर और एक गर्म धातु की जांच या एक टांका लोहे या निकलीं ड्रिल बिट का उपयोग कर ।
      नोट: प्लास्टिक के ढक्कन में कटौती करने के लिए गर्मी का उपयोग करना एक ब्लेड के लिए बेहतर है क्योंकि वहां चोट का खतरा कम है ।
    3. साफ और रेत कट किनारों और ऊपर एक घुमावदार फ़ाइल या एक रोटरी पीस उपकरण (जैसे, Dremel) के साथ सतह । चित्रा 1Cदेखें ।
    4. उपयुक्त व्यास (चित्रा 1 डी) के लिए monofilament मेष के चक्र में कटौती । इस के लिए, एक monofilament नायलॉन जाल शीट पर एक ढक्कन का पता लगाने और बस खींचा रेखा के अंदर कटौती ।
    5. जब गोंद प्लास्टिक (चित्रा 1E) के लिए लागू किया जाता है, तो दो पलकों के आसंजन को बढ़ाने के लिए ढक्कनों की ऊपरी सतह में कटौती खांचे/
    6. इथेनॉल के साथ ढक्कन साफ और उंहें सूखी ।
    7. दोनों पलकों की ऊपरी सतह पर cyanoacrylate गोंद लागू करें, बाहरी किनारे पर रखते हुए ।
      नोट: थोड़ा गोंद एक लंबा रास्ता जाता है ।
    8. monofilament जाल रखना, 1 तालिकाके अनुसार, एक पर चिपके ढक्कन (चित्रा 1F) । दूसरा ढक्कन जाल के शीर्ष पर औंधा प्लेस; दोनों ढक्कन एक साथ अपने सबसे ऊपर होना चाहिए । दृढ़ता से एक साथ प्रेस (चित्रा 1G) । सुनिश्चित करें कि मेष तना हुआ है ।
      नोट: एक सुरक्षा उपाय के रूप में, ढक्कन पर जाल रखने के लिए चिमटी का उपयोग करें ।
    9. एक बार गोंद की प्रारंभिक परत सूख गया है, पलकों के बीच बाहरी अंतराल के आसपास cyanoacrylate गोंद की एक अंगूठी लागू होते हैं । उदार बनो के रूप में इस अखंडता कहते है और किसी भी छीलने के अलावा या लीक से बचाता है ।
    10. लेबल monofilament मेष के जाल ताकना आकार के साथ फिल्टर ।
      नोट: यहां, हम दो जाल ताकना आकार का उपयोग करें-20 µm और ५० µm ।
  2. प्रोटोकॉल का उपयोग करें
    1. पहले छलनी गीला ।
      1. पिपेट एक खारा समाधान, जैसे M9 [5 जी ऑफ NaCl, 6 जी ऑफ एनए2HPO4, 3 जी के KH2पीओ4, 1 एल के ultrapure एच2ओ, और MgSO4 (1 एम) के 1 एमएल]17, एक छोटी बूंद रूपों तक छलनी के केंद्र के माध्यम से , गाढ़ा, और फिल्टर नीचे (चित्रा 2a) के केंद्र से ड्रिप । वैकल्पिक रूप से, एक एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त पोंछ लागू (जैसे, Kimwipe) नीचे करने के लिए आकार या जाल पर एक नमी छोटी बूंद फैल गया ।
      2. छलनी को एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब पर रखें । ' बेकार ट्यूब ' (चित्रा बीसी) के रूप में ट्यूब लेबल ।
    2. एक आगर प्लेट बंद सी एलिगेंस की आबादी धो लो ।
      1. M9 बफर के साथ प्लेट को धोकर एक बार में monofilament मेष 1 मिलीलीटर की topside पर कृमि युक्त मध्यम रखें (चित्रा 2c) । मेष के केंद्र में संचालित करने के लिए सुनिश्चित करें । प्लेट से सारे कीड़े धो लें ।
        नोट: आमतौर पर, एक ६० mm प्लेट के लिए M9 के 3 मिलीलीटर पर्याप्त है ।
      2. pipetting में खो कीड़े की संख्या को कम करने के लिए, एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए थाली से कीड़े कदम और मेष केंद्र पर (दोहराने की जरूरत के रूप में) ।
      3. ऊपर से M9 बफर के साथ फिल्टर कुल्ला । फिर, जाल के केंद्र में संचालित है और उस क्षेत्र में सभी कीड़े कुल्ला सुनिश्चित करें । सभी बैक्टीरिया और छोटे कीड़े जाल के माध्यम से पारित कर दिया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक के रूप में कई बार धोने ।
    3. छलनी से आकार-मिलाए जानवरों को फसल.
      1. नए संग्रह ट्यूब (चित्रा 2d) के अंदर का सामना करना पड़ कदम 1.2.2.3 से वयस्क कीड़े के साथ, छलनी के शीर्ष करने के लिए एक नया ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब देते हैं ।
      2. पहली ट्यूब (अपशिष्ट ट्यूब) निकालें और जल्दी से छलनी और नई ट्यूब पर फ्लिप करने के लिए पलायन (चित्रा 2E) से छोटी बूंद रखने के लिए ।
        नोट: यदि बांझपन की आवश्यकता नहीं है, एक एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त पोंछें (जैसे, Kimwipe) का उपयोग करने से पहले जाल के नीचे से फ़्लिप तरल पदार्थ के लिए flipping ।
      3. नई topside (चित्रा 2F) से नए ५० मिलीलीटर ट्यूब में M9 के साथ जाल कुल्ला । फिर, जाल केंद्र में काम करते हैं और जाल के नीचे पर एक छोटी बूंद को बनाए रखने.
      4. कीड़े बसने के लिए अनुमति दें या धीरे से उन्हें नीचे स्पिन (उदाहरणके लिए, < 16 x g) लगभग 1 मिनट (चित्रा 2g) के लिए.
      5. महाप्राण कीड़े की गोली से बफर समाधान, आदर्श रूप में > 0.5 मिलीलीटर करने के लिए नीचे, या गोली परेशान बिना संभव के रूप में ज्यादा तरल पदार्थ के रूप में हटा दें ।
      6. पिपेट एक NGM प्लेट पर एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग कर कीड़े और उन्हें शुष्क कर देते हैं । अंतरिक्ष कई बूंदें एक नई थाली पर बाहर तो वे तेजी से शुष्क (चित्रा 2H) ।
    4. छलनी को साफ कर ।
      1. धीरे से छलनी कुल्ला और इथेनॉल और रिवर्स-असमस पानी के साथ अच्छी तरह से । इसे सूखने दें ।
      2. यह अनिश्चित भविष्य के उपयोग के लिए एक साफ कंटेनर में स्टोर ।
      3. यह त्यागें जब मेष एक "प्रसूता" उपस्थिति विकसित करता है ।

2. Caenorhabditis चलनी छंटाई विधि का सत्यापन

  1. सामांय रखरखाव
    1. सभी प्रयोगों के लिए, एक मानक निमेटोड विकास मीडिया पर संस्कृति कीड़े17 (NGM के 1 एल peptone के २.५ ग्राम के होते हैं, आगर के 17 ग्राम, NaCl के 3 जी, डबल आसुत जल के ९७५ मिलीलीटर, 5 मिलीग्राम की 1 मिलीलीटर/एमएल कोलेस्ट्रॉल, 1 मीटर CaCl2 की 1 मिलीलीटर , 1 मीटर MgSO4, 1 एम KHPO4के 25 मिलीलीटर, और 25 डिग्री सेल्सियस पर १०० मिलीग्राम/एमएल streptomycin) के ०.५ मिलीलीटर
  2. प्रायोगिक उपचार प्रशासन
    1. तीन उपचार समूहों की तुलना करें: उठाओ, fluorodeoxyuridine (FUDR), और Caenorhabditis छलनी ।
      1. FUDR उपचार समूह के लिए, जोड़ें १०० मिलीग्राम/एमएल FUDR १०० माइक्रोन की एक अंतिम एकाग्रता के लिए NGM मीडिया के लिए किसी भी संतान उत्पादन को रोकने के लिए, और कीड़े हर दूसरे दिन एक ताजा NGM प्लेट के लिए भोजन की कमी से बचने के लिए स्थानांतरण ।
      2. चुनें समूह के लिए, का चयन करें और कीड़े मैंयुअल रूप से एक प्लैटिनम पाश का उपयोग कर हस्तांतरण ।
      3. Caenorhabditis चलनी उपचार समूह के लिए, १.२ कदम का पालन करें और एक NGM प्लेट पर कीड़े पिपेट ।
  3. Caenorhabditis चलनी प्रतिशत उपज
    1. कैसे प्रभावी चलनी सी छंटाई पर है । एलिगेंस, उम्र बढ़ने के लिए N2 जानवरों में वयस्कता के 1 दिन के लिए 25 डिग्री सेल्सियस (यानी, ४८ ज अंडे बिछाने के बाद) और फिर उन्हें ताजा NGM प्लेटों को उठा कर हस्तांतरण (कुल n = ५० या n = १०० पशुओं के प्रति tre atment समूह) ।
    2. वसूली के 24 एच के बाद, Caenorhabditis चलनी के साथ नए NGM प्लेटों के लिए जनसंख्या हस्तांतरण ऊपर प्रोटोकॉल निंनलिखित (१.२ कदम देखें) और सफलतापूर्वक पशुओं के तबादले की संख्या गिनती ।
    3. १०० (%) द्वारा गुणा स्थानांतरण की शुरुआत में प्रारंभिक संख्या की तुलना में स्थानांतरित पशुओं की संख्या के अनुपात के रूप में प्रतिशत उपज की गणना ।
  4. Healthspan परख
    नोट: स्कोर गतिशीलता वर्ग के मापदंडों healthspan, ग्रसनी पंप दर, और दोनों पूर्वकाल और पीछे कोमल स्पर्श प्रतिक्रिया दिन पर 2, 4, 6, और वयस्क के 8 उंर के लिए सिंक्रनाइज़ N2 पशुओं 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा ।
    1. गतिशीलता ट्रैकिंग
      1. Herndon एट अल के तरीकों के बाद एक वर्ग आधारित प्रणाली (वर्ग ए, बी, और सी) के आधार पर गतिशीलता स्कोर निरुपित । 18. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एक क्रमवार रसद सांख्यिकी मॉडल का उपयोग कर तीन प्रयोगात्मक समूहों के प्रभाव की तुलना करें ।
        नोट: वर्ग एक व्यक्ति एक सामांय, sinusoidal पैटर्न में सहज चाल । वर्ग बी व्यक्तियों को स्पष्ट रूप से गैर sinusoidal आंदोलनों में कदम और आंदोलन को प्रोत्साहित करने के लिए उकसाने की आवश्यकता हो सकती है । वर्ग C व्यक्तियों उकसाने के जवाब में उनके सिर और/या पूंछ ले जाते हैं, लेकिन आगर भर में स्थानांतरित करने में असमर्थ हैं ।
    2. ग्रसनी पंप दर
      1. 1 मिनट के लिए एक 600X अंतिम आवर्धन पर एक stereomicroscope के तहत नेत्रहीन पशु टर्मिनल ग्रसनी बल्ब की चक्की आंदोलन गिनती ।
      2. α के साथ एक तरह ANOVA के साथ एक सांख्यिकीय विश्लेषण आचरण = ०.०५ और Bonferroni के बाद α = ०.०५ के साथ परीक्षण ।
    3. प्रतिक्रिया स्पर्श करें
      1. एक कोमल स्पर्श प्रतिक्रिया रिकॉर्ड और तीन उपचार समूहों के बीच तुलना करें । Calixto एट अल द्वारा बताए गए तरीकों के आधार पर परख कर प्रदर्शन करें । 19. शी.
      2. धीरे एक बरौनी पथपाकर पूंछ या सिर भर में सीधा लेने के द्वारा पूर्वकाल और पीछे स्पर्श प्रतिक्रिया रिकॉर्ड (5x प्रत्येक, बारी सिर और पूंछ) जानवरों की ।
      3. दोनों पूर्वकाल और पीछे प्रतिक्रिया के लिए 0 से 5 के पैमाने पर 1 बिंदु के रूप में स्ट्रोक के विपरीत दिशा में किसी भी आंदोलन स्कोर ।
      4. आचरण सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ एक तरह से ANOVA के साथ α = ०.०५ और Bonferroni के बाद परीक्षण के साथ α = ०.०५.
  5. Fecundity परख
    1. प्रजनन पर Caenorhabditis छलनी के प्रभाव का उपयोग निर्धारित करने के लिए, उम्र बढ़ने के लिए-तुल्यकालिक N2 जानवरों के 2 दिन वयस्कता के 25 डिग्री सेल्सियस पर ।
    2. ६० ज के बाद अंडा देना, या तो एक प्लेटिनम लेने या Caenorhabditis छलनी के साथ नए NGM प्लेटों के लिए पशुओं हस्तांतरण और उंहें 4 को ठीक करने के लिए एच (20 के लिए छलनी प्लेटों-30 मिनट सूखी) दे ।
    3. वसूली के बाद, व्यक्तिगत थाली एक बरौनी के माध्यम से जानवरों प्लेट NGM करने के लिए उठाओ, उन्हें 24 ज अंडे देना, और जानवरों को हटाने के लिए । प्रत्येक थाली पर संतान की अनुमति के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सामांय परिस्थितियों में विकसित करने के लिए एक और 24 एच ।
      नोट: एक बरौनी उठाओ एक मानव एक पाश्चर पिपेट के अंत के लिए सुरक्षित बरौनी के साथ नेल पॉलिश और इथेनॉल के साथ निष्फल है ।
    4. व्यवहार्य F1 पीढ़ी के व्यक्तियों की संख्या की गणना । α = ०.०५ के साथ एक टी-परीक्षण का उपयोग करते हुए सांख्यिकीय विश्लेषण करें ।
      नोट: व्यवहार्य वंश अंडे कि सफलतापूर्वक हैच और नियमित रूप से लार्वा चक्र के माध्यम से अपने विकास शुरू माना जाता है ।
  6. फ्लोरोसेंट रिपोर्टर तनाव प्रतिक्रिया परख
    1. प्रदर्शन तीन आमतौर पर इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट रिपोर्टर परख तनाव के संभावित मार्कर का पता लगाने के लिए: एक डीएएफ-16:: GFP translocation में कोशिकाओं के नाभिक में एक तनाव [TJ356-zIs356 (pDAF-16::D af-16-GFP; rol-6)]20; an hsp-१६.२ अभिव्यक्ति [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2 p:: GFP)]21; और एक वतन-3 अभिव्यक्ति [CF1553-muIs84 ([pAD76] वतन-3p:: GFP + rol-6 [su1006])]22.
    2. प्रत्येक परख, संस्कृति आयु के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर तीन उपचार समूहों से तुल्यकालिक जानवरों और उंहें वयस्कता के 3 दिन पर जांच: एक नकारात्मक नियंत्रण (एक दैनिक आधार पर, एक प्लेटिनम लेने के साथ मैंयुअल रूप से पशुओं के एक समूह हस्तांतरण), एक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करें (एक दैनिक आधार पर , एक प्लेटिनम लेने के साथ एक स्थापित तनाव के साथ मैंयुअल रूप से पशुओं के एक समूह हस्तांतरण), और Caenorhabditis चलनी (चलनी के माध्यम से जानवरों के पास और उंहें बस इमेजिंग से पहले NGM पर 30 मिनट के लिए ठीक करने की अनुमति) ।
    3. डीएएफ-16 में:: GFP परख, हीट20इमेजिंग से पहले 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर सकारात्मक नियंत्रण जानवरों सदमे । hsp के लिए-१६.२ परख, गर्मी सदमे से ९० मिनट के लिए सकारात्मक नियंत्रण जानवरों, 20 इमेजिंग से पहले एच21। वतन के लिए-3 परख,22इमेजिंग से पहले 4 ज के लिए १०० mM paraquat के साथ सकारात्मक नियंत्रण जानवरों का इलाज ।
    4. फसल कीड़े तुरंत एक बरौनी उठाओ और उंहें ३६% poloxamer ४०७ surfactant समाधान के 1 μL के साथ एक coverslip को माउंट कीड़े मैटीरियल के साथ ।
    5. एक और coverslip के साथ घुड़सवार कीड़े सैंडविच । एक मानक गिलास माइक्रोस्कोपी स्लाइड और छवि के लिए दो coverslips माउंट कीड़े एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर एक x इज़ाफ़ा का उपयोग कर (80X के एक समग्र इज़ाफ़ा के लिए) और एक FITC फिल्टर के साथ एक निरंतर प्रदर्शन ।
    6. डीएएफ में तीन समूहों के बीच किसी भी मतभेद का पता लगाने के लिए-16:: GFP परख, डीएएफ के स्थान के आधार पर पशुओं को वर्गीकृत-16:: GFP रिपोर्टर (परमाणु यदि रिपोर्टर translocated नाभिक, cytosolic अगर cytosol में स्थित रिपोर्टर, और मध्यवर्ती अगर दोनों नाभिक और cytosol) में स्थित रिपोर्टर ।
    7. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एक क्रमवार रसद सांख्यिकीय मॉडल का उपयोग कर परिणामों की तुलना करें । hsp-१६.२ और वतन के लिए-3 अभिव्यक्ति परख, एक तरह से ANOVA α = ०.०५ और Tukey के साथ α = ०.०५ के साथ पोस्ट हॉक परीक्षण का उपयोग करने के लिए प्रमुख क्षेत्र के कुल प्रतिदीप्ति की तुलना करें ।

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Representative Results

Caenorhabditis छलनी 2 पेंच टोपियां के होते हैं, बुना नायलॉन monofilament जाल के एक क्षेत्र की रक्षा वांछित विकास आयु के शरीर व्यास से छोटे, एक सरल कपड़े धोने की तकनीक का उपयोग जीवों की जीना आबादी निकालने के लिए इस्तेमाल किया । यह मानक शंकु ट्यूबों के लिए देता है और जाल स्क्रीन का उपयोग करता है यांत्रिक रूप से शरीर व्यास द्वारा जानवरों की तरह, आगे रखरखाव और प्रयोग के लिए तैयार ट्यूब में वांछित पशुओं छोड़ने (जैसे, हस्तांतरण या आनुवंशिक फसल) । Caenorhabditis चलनी के साथ एक सौंय मैनुअल धोने जल्दी है, लगभग प्रति 5 मिनट 60-100 मिमी प्लेट, और जीवों को आसानी से जाल से बरामद कर रहे हैं ।

निंनलिखित पशुओं की प्रतिशत उपज Caenorhabditis चलनी उपयोग
Caenorhabditis चलनी के प्रतिशत उपज स्थापित करने के लिए, उपकरणों दोनों 20 माइक्रोन और ५० माइक्रोन ताकना-वयस्क जानवरों पर आकार जाल के साथ परीक्षण किया गया । एक का मतलब उपज > 90% सफल पशु हस्तांतरण दोनों मेष आकार का परीक्षण (तालिका 1) के लिए प्राप्त किया गया था ।

विभिन्न आकार अंतराल के साथ Monofilament मेष अलग जीवन चरणों के जानवरों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 20 माइक्रोन अंतराल के साथ मेष दूर के लिए उपयुक्त है भ्रूण और लार्वा चौथे लार्वा मंच से छोटे चरणों के विकास, बाद (L4; ३२ माइक्रोन के एक औसत शरीर व्यास के साथ) और बाद में जीवन चरणों में किसी भी जानवरों को बनाए रखने, जबकि ५० माइक्रोन अंतराल के साथ मेष सभी की अनुमति होगी अन्य जीवन वयस्कों से अलग चरणों (७० माइक्रोन की एक औसत शरीर व्यास के साथ) दूर धोया जा करने के लिए (तालिका 2).

Caenorhabditis चलनी का उपयोग healthspan मैट्रिक्स को प्रभावित नहीं करता
गतिशीलता: C. एलिगेंस में सामांय sinusoidal आंदोलन (यानी, गतिशीलता)18 साल की उंर के साथ गिरावट आती है और समग्र स्वास्थ्य का एक मार्कर है । अगर Caenorhabditis चलनी गतिशीलता प्रभावित निर्धारित करने के लिए, गतिशीलता स्कोर लेने के लिए तुलना में थे, FUDR, और Caenorhabditis छन्नी उपचार समूहों 2, 4, 6, और वयस्कता के 8 दिनों पर । हर समूह (n = 10/समूह) भर में सभी जानवरों सामांय और सहज आंदोलन पैटर्न (वर्ग ए) वयस्कता भर में कई युगों (दिन 2, 4, 6, और वयस्कता के 8 में प्रदर्शित; पी > ०.०५ सभी दिनों पर एकाधिक तुलना के लिए, चित्रा 3) ।

ग्रसनी पंप दर: एलिगेंस ' ग्रसनी मांसपेशियों की क्षमता को पंप करने के लिए उंर के साथ गिरावट आती है और23healthspan की एक और निशानी है । निर्धारित करने के लिए यदि Caenorhabditis चलनी ' जानवरों ग्रसनी पंप दर, उठाओ, FUDR, और Caenorhabditis चलनी उपचार समूहों को प्रभावित दिनों 2, 4, 6, और वयस्कता के 8 (n = 8 से 10 प्रति समूह) की तुलना में थे । 6 दिनों (p < 0.001) और 8 (p < 0.001) पर खरीदना और FUDR तरीकों से गुजरने वाले जानवरों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर था । साथ ही, 6 दिनों (p < 0.001) और वयस्कता के दिन 8 (p < 0.001) पर चलनी और FUDR समूहों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर था । हालांकि, लेने और किसी भी दिन के लिए Caenorhabditis चलनी समूहों के बीच कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर था (पी > 0.05, चित्रा 4), यह दर्शाता है कि छलनी healthspan के इस उपाय पर प्रभाव नहीं पड़ता ।

कोमल स्पर्श प्रतिक्रिया: यांत्रिक उत्तेजना के लिए एक शारीरिक प्रतिक्रिया उंर बढ़ने या सामांय स्वास्थ्य24,25का आकलन करने के लिए मार्कर है; इस प्रकार, दोनों पूर्वकाल और पीछे कोमल स्पर्श प्रतिक्रियाओं पर विभिंन हस्तांतरण तरीकों के प्रभाव का परीक्षण किया गया । वहां लेने, FUDR, और Caenorhabditis छन्नी उपचार समूहों (n = 8/समूह) के बीच कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर था, या तो पूर्वकाल या पीछे, परीक्षण के किसी भी दिन के लिए (पी > 0.4 सभी तुलना के लिए; चित्र 5 ए और 5B) ।

Fecundity: स्थापित करने के लिए या नहीं, Caenorhabditis छलनी सी एलिगेंसद्वारा उत्पादित व्यवहार्य संतान की राशि को प्रभावित किया है, व्यक्तिगत वंश एक 24 एच अवधि में वयस्कता के 3 दिन के दौरान उत्पादित गिनती और तुलना (n = 20 से 22 के प्रति समूह) । Caenorhabditis छलनी का उपयोग काफी जब एक उठाओ उपचार समूह (पी = ०.६१, चित्रा 6) की तुलना में उत्पादित संतति की संख्या को प्रभावित नहीं किया ।

आण्विक रिपोर्टर परख
डीएएफ-16 परमाणु translocation: C. एलिगेंसमें, प्रतिलेखन कारक डीएएफ-16 की सक्रियण वृद्धि तनाव प्रतिरोध26के साथ जुड़ा हुआ है । डीएएफ के परमाणु स्थानीयकरण-16 एक ट्रांसजेनिक निमेटोड तनाव TJ356, जो डीएएफ-16 एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े व्यक्त में जांच की गई (डीएएफ-16:: GFP)20। सामान्य वृद्धि की स्थिति के अंतर्गत, डीएएफ-16:: GFP मुख्य रूप से cytosol में स्थानीयकृत है, लेकिन विभिन्न तनावों (जैसे, गर्मी तनाव) के तहत, यह तेजी से नाभिक20में translocated है । डीएएफ पर Caenorhabditis छलनी के साथ छंटाई के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए-16 translocation, डीएएफ-16:: GFP स्थानीयकरण-एक सकारात्मक नियंत्रण समूह (गर्मी तनाव) में 5 वयस्कों, एक नकारात्मक नियंत्रण समूह (लेने के माध्यम से मैनुअल स्थानांतरण) आयु में तुलना की गई, और एक Caenorhabditis छन्नी उपचार समूह (n = 10/ Caenorhabditis चलनी के साथ हस्तांतरण डीएएफ के परमाणु translocation को प्रभावित नहीं किया-16:: GFP, और नकारात्मक नियंत्रण पशुओं के लिए एक समान phenotype दिखाया (पी > 0.05, चित्रा 7) ।

hsp-१६.२ रिपोर्टर: hsp-१६.२ की तरह छोटे गर्मी सदमे प्रोटीन एक तनाव की प्रतिक्रिया के लिए है, और वे अत्यधिक गर्मी सदमे या ऑक्सीडेटिव तनाव एजेंटों21,27के लिए एक जोखिम के दौरान व्यक्त कर रहे हैं । TJ375 तनाव एक GFP रिपोर्टर एक hsp-१६.२ प्रमोटर के साथ जुड़े जीन है कि सामांय21शर्तों के तहत सक्रिय नहीं है । हालांकि, एक गर्मी सदमे के लिए एक जोखिम के बाद, HSP-१६.२ प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित है, और जानवरों GFP अभिव्यक्ति21के उच्च स्तर प्रदर्शित करते हैं । एक HSP-१६.२-मध्यस्थता तनाव की प्रतिक्रिया पर Caenorhabditis छलनी के शामिल होने का परीक्षण करने के लिए, ग्रसनी क्षेत्र में प्रतिदीप्ति घनत्व (n = 10 जानवरों की आयु-मिलान जानवरों के समूह) दिन में तुलना की गई थी-एक सकारात्मक नियंत्रण समूह के बीच 5 वयस्कों (गर्मी तनाव), एक नकारात्मक नियंत्रण समूह (उठा), और एक Caenorhabditis चलनी उपचार समूह । Caenorhabditis चलनी के साथ स्थानांतरण काफी HSP की अभिव्यक्ति प्रेरित नहीं किया-16.2:: GFP (HSP-16.2:: GFP) जब नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में (p > 0.05, चित्रा 8) ।

वतन-3 रिपोर्टर: C. एलिगेंसमें, एंटी ऑक्सीडेंट जीन है कि सुपरऑक्साइड dismutase 3 (वतन-3) के लिए कोड को ऑक्सीडेटिव तनाव28के दौरान विनियमित है । C. एलिगेंस तनाव CF1553 ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त-वतन-3 प्रमोटर, जिनकी अभिव्यक्ति ऑक्सीडेटिव तनाव, जैसे paraquat5के रूप में प्रेरित है लेबल । Caenorhabditis की भागीदारी का परीक्षण करने के लिए C. एलिगेंसमें एंटीऑक्सीडेंट प्रतिक्रिया पर छंटाई छलनी, उंर के प्रमुख क्षेत्र में प्रतिदीप्ति घनत्व-मिलान दिवस-5 वयस्कों एक सकारात्मक नियंत्रण जनसंख्या के बीच की तुलना में था (१०० माइक्रोन paraquat उपचार), एक नकारात्मक नियंत्रण जनसंख्या (मैनुअल उठा), और एक Caenorhabditis चलनी-हस्तांतरित जनसंख्या । Caenorhabditis चलनी के साथ स्थानांतरण काफी वतन की अभिव्यक्ति प्रेरित नहीं किया-3:: gfp जब नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में (पी > 0.05, चित्रा 9) ।

Figure 1
चित्रा 1: Caenorhabditis चलनी निर्माण । इस उपकरण के ' do ' स्वयं के निर्माण की प्रगति दिखाया गया है । इन पैनलों शो (A) २ ५० एमएल शंकु ट्यूब कैप्स (ख) जिसका केंद्र हटा दिया गया है, (ग) काट किनारों चिकनी, और (डी एफ) जो monofilament मेष के साथ फिट सी के वांछित जीवन चरण के लिए इसी एलिगेंस (विवरण के लिए प्रोटोकॉल देखें) । (छ) पूरा छन्नी भी दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Caenorhabditis चलनी उपयोग के कदम दर कदम छवि प्रतिनिधित्व । (क) छलनी M9 की एक बूंद के साथ पूर्व गीला है, और (ख) एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के शीर्ष पर फिट । (ग) कीड़े के साथ M9 समाधान की 1 मिलीलीटर चलनी के topside पर pipetted है, (घ) एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब छलनी के ऊपर ट्यूब के अंदर का सामना करना पड़ कीड़े के साथ रखा गया है, और (ई) एक नए संलग्न ऊपरी ट्यूब के साथ छलनी जल्दी से फ़्लिप है ओ ver. (G) छलनी नए ५० मिलीलीटर ट्यूब में वांछित जानवरों को ले जाने M9 के साथ कुल्ला किया है और कीड़े ट्यूब के नीचे करने के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दी जाती है । (ज) कीड़े pipetted और एक ताजा NGM प्लेट पर बूंदों के रूप में रखा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: Caenorhabditis चलनी उंर भर गतिशीलता प्रभाव नहीं था । यह आंकड़ा 2, 4, 6, और उठाओ, FUDR, और Caenorhabditis छन्नी उपचार समूहों के लिए वयस्कता के 8 दिनों में पशुओं के गतिशीलता वर्ग वितरण से पता चलता है । कक्षा एक पशु सामांय रूप से चले गए और सहज, कक्षा बी जानवरों असामांय रूप से चले गए और आवश्यक उकसाने हो सकता है, और कक्षा सी जानवरों को स्थानांतरित करने में असमर्थ थे । Caenorhabditis चलनी, पिक और FUDR समूहों (p > 0.05) के बीच कोई अंतर नहीं था । तीन (n = 10 उपचार प्लेट प्रति पशुओं) की प्रतिकृतियां आयोजित की गई और क्रमवार रसद मॉडल के साथ विश्लेषण किया गया । कक्षा बी पशु । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: Caenorhabditis चलनी उपयोग ग्रसनी उंर भर पंप प्रभाव नहीं था । यह आंकड़ा उठाओ, FUDR, और Caenorhabditis छन्नी उपचार समूहों के ग्रसनी पंप दरों से पता चलता है, 2, 4, 6, और वयस्कता के 8 दिनों की तुलना में । तारांकन निर्दिष्ट दिनों के लिए उठाओ, छलनी, और FUDR उपचार समूहों के बीच एक महत्व निरूपित (* * * p < 0.05) । वहां Caenorhabditis छलनी और उठाओ समूह (पी > ०.०५) के बीच कोई अंतर नहीं था । दो प्रतिकृति (N = 10 उपचार प्लेट प्रति पशुओं) और आयोजित किए गए एक तरह से ANOVA और एक Bonferroni के बाद परीक्षण के साथ विश्लेषण किया गया । सलाखों के अर्थ का मानक त्रुटि ± मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: Caenorhabditis छलनी का उपयोग नहीं किया उंर भर पूर्वकाल स्पर्श प्रतिक्रिया प्रभाव । इन पैनलों शो (क) पूर्वकाल और (ख) के पीछे स्पर्श की प्रतिक्रिया गिनती उठाओ, FUDR, और Caenorhabditis छन्नी उपचार समूहों 2, 4, 6, और वयस्कता के 8 दिनों की तुलना में । दो प्रतिकृतियां प्रत्येक उपचार समूह के लिए N = 10 के साथ आयोजित किया और एक तरह से ANOVA और एक Bonferroni पोस्ट परीक्षण के साथ तुलना में (पी = ०.४ और p = ०.९ पूर्वकाल और पीछे के लिए, क्रमशः) थे । सलाखों के अर्थ का मानक त्रुटि ± मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: Caenorhabditis छलनी वयस्कता के 3 दिन पर व्यवहार्य संतान की राशि पर प्रभाव नहीं पड़ा । यह आंकड़ा दिन के व्यवहार्य संतति-3 वयस्कों के एक 24 घंटे के अंडे बिछाने अवधि के बाद पता चलता है, माता पिता के पशुओं के लिए वयस्कता के 3 दिन फैले । सलाखों के अर्थ का मानक त्रुटि ± मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं । N = 20-22 से कम दो अलग जैविक उपचार समूह प्रति प्रतिकृति । उपचार समूह एक t-परीक्षण, (p > 0.05) के साथ तुलना की गई हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: Caenorhabditis छन्नी डीएएफ-16 के न्यूक्लियर translocation पर असर नहीं पड़ा:: GFP । इन पैनलों डीएएफ के प्रतिनिधि छवियों को दिखाने के-16 translocation (क) एक गर्मी सदमे समूह (सकारात्मक नियंत्रण), (ख) एक उठाओ समूह (नकारात्मक नियंत्रण), और (ग) एक Caenorhabditis चलनी उपचार समूह । (घ) सकारात्मक नियंत्रण समूह में जानवरों डीएएफ-16 परमाणु translocation के एक सक्रियण प्रदर्शित । Caenorhabditis छलनी एक परमाणु translocation प्रेरित नहीं किया और नकारात्मक नियंत्रण समूह में जानवरों के समान cytosolic फ्यूजन प्रोटीन प्रदर्शित । N = 10 से कम तीन अलग जैविक प्रतिकृति उपचार समूह प्रति पशुओं । उपचार समूहों की तुलना एक तरह से ANOVA और एक Tukey की पोस्ट हॉक टेस्ट से की गई । स्केल बार = १०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: Caenorhabditis चलनी hsp 16.2 की अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं किया:: gfp । HSP-१६.२ अभिव्यक्ति (मनमाने ढंग से प्रतिदीप्ति इकाइयों में) एक गर्मी सदमे समूह (सकारात्मक नियंत्रण), एक पिकअप समूह (नकारात्मक नियंत्रण), और एक Caenorhabditis छन्नी उपचार समूह की तुलना में कर रहे हैं । तारक hsp 16.2 की एक उच्च अभिव्यक्ति को निरूपित:: सकारात्मक नियंत्रण समूह है जो अंय उपचार समूहों से काफी अलग था के लिए gfp (* * * p < 0.05) । Caenorhabditis छलनी hsp 16.2:: gfp अभिव्यक्ति और प्रदर्शित प्रतिदीप्ति नकारात्मक नियंत्रण समूह (पी > 0.05) में पशुओं के समान तीव्रता को प्रभावित नहीं किया । तीन दोहराने N = 10 के साथ प्रत्येक उपचार समूह के लिए आयोजित किया गया और एक तरह से ANOVA और एक Tukey की पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ तुलना में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्रा 9: Caenorhabditis छन्नी वतन की अभिव्यक्ति पर असर नहीं पड़ा-3:: gfp । एक १०० माइक्रोन paraquat समूह (सकारात्मक नियंत्रण), एक पिकअप समूह (नकारात्मक नियंत्रण), और एक Caenorhabditis चलनी उपचार समूह के (मनमाने ढंग से प्रतिदीप्ति इकाइयों में) वतन-3 भाव दिखाया जाता है । तारका ने वतन की एक उच्च अभिव्यक्ति को निरूपित किया-3:: gfp सकारात्मक नियंत्रण समूह जो अंय समूहों से काफी अलग था के लिए (* * * p < 0.05) । Caenorhabditis चलनी वतन को प्रभावित नहीं किया-3:: gfp अभिव्यक्ति और प्रदर्शित प्रतिदीप्ति नकारात्मक नियंत्रण समूह (पी > 0.05) में जानवरों के समान तीव्रता । तीन दोहराने N = 10 के साथ प्रत्येक उपचार समूह के लिए आयोजित किया गया और एक तरह से ANOVA और एक Tukey की पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ तुलना में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

मेष आकार N = ५० N = १००
20 माइक्रोन ९५.३३%
५० माइक्रोन ९९.००% ९३.३३%

तालिका 1: मेष आकार की प्रतिशत उपज । यह तालिका एक 20 माइक्रोन के साथ परीक्षण किया डिवाइस के परिणाम से पता चलता है n = ५० वयस्कों के लिए 3 दोहराने और एक ५० माइक्रोन डिवाइस के साथ परीक्षण किया गया n = ५० वयस्कों के लिए 2 दोहराने के लिए और n के साथ = १०० के लिए 3 प्रतिकृति.

मेष आकार विकासात्मक मंच शरीर व्यास
20 माइक्रोन लार्वा स्टेज 4 ~ ३५ माइक्रोन
५० माइक्रोन दिन 1 वयस्क ~ ७० माइक्रोन

तालिका 2: शरीर व्यास मतलब है । इस तालिका में प्रत्येक मापा जीवन स्तर पर 15 जानवरों के लिए प्रत्येक कीड़ा भर में समान रूप से फैले 3 माप औसत द्वारा अधिग्रहीत मतलब शरीर व्यास को प्रदर्शित करता है.

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Discussion

इस के साथ साथ, हम छंटाई और सी एलिगेंसबनाए रखने के लिए एक उपकरण के रूप में सुलभ, प्रभावी Caenorhabditis छलनी के डिजाइन और उपयोग की शुरुआत की । इस उपकरण को मैंयुअल रूप से व्यक्तिगत पशुओं उठा, आबादी, रासायनिक उपचार (जैसे, FUDR), और अलग जानवरों के और अधिक महंगी तरीकों धोने के लिए कई फायदे हैं । सबसे पहले, Caenorhabditis चलनी कुशलतापूर्वक और जल्दी (कम से 20 मिनट) पशुओं की बड़ी मिश्रित आबादी से संतान की तरह (2 तालिका) । इसके अलावा, उपकरण का उपयोग जानवरों ' healthspan (चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6) पर कोई detectable विषाक्त प्रभाव है, अच्छी तरह से वर्णित आनुवंशिक तनाव पत्रकारों को प्रेरित नहीं करता है (चित्रा 7, चित्रा 8 , चित्रा 9), और विदेशी रासायनिक कि संस्कृति प्लेट या किसी भी आणविक परख के बाद लागू उपचार को प्रभावित कर सकता है की मात्रा कम कर देता है । इसका उपयोग में आसानी एक महत्वपूर्ण लाभ है; उनकी शिक्षा के किसी भी चरण में शोधकर्ता को इसका उपयोग करने के लिए प्रशिक्षित किया जा सकता है (चित्रा 1 और चित्रा 2; प्रोटोकॉल) ।

निर्माण और चलनी के उपयोग के लिए आवश्यक सामग्री (जैसे, पिपेट, buffers) मानक अनुसंधान प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध हैं; इस प्रकार, अगर टूटा हुआ, Caenorhabditis छलनी की जगह या मरंमत महंगा नहीं है । स्वयं Caenorhabditis छलनी की प्रकृति का निर्माण यह एक बहुमुखी उपकरण होने की अनुमति देता है: यह जाल आकार के साथ अलग सी एलिगेंस विकास चरणों और phenotypes के लिए उपयुक्त निर्माण किया जा सकता है । Caenorhabditis चलनी भी अंय निमेटोड प्रजातियों में आयोजित की परख में इस्तेमाल किया जा सकता है या जब छोटे जीवों को अलग, प्रदान की उपयुक्त मेष आकार निर्माण पर प्रयोग किया जाता है ।

लाभ के अलावा इस उपकरण C. एलिगेंस जनसंख्या रखरखाव के लिए प्रदान करता है, छलनी अन्य प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों में उनके उपयोग से पहले जानवरों को साफ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, microfluidics के विकास के साथ एलिगेंस अनुसंधान का संचालन करने के लिए चिप का उपयोग करें और सफाई का मुद्दा आता है । जानवरों से जुड़ी बैक्टीरिया की मात्रा पर निर्भर करते हुए विशेष एहतियात बरतने की जरूरत है ताकि microfluidic चिप को रोकना न पड़े, यह अनुपयोगी29प्रतिपादित करें. अक्सर जब सी एलिगेंस एक microfluidic चिप को हस्तांतरित कर रहे हैं, जीवाणु लॉन से अवशेषों उनके साथ लाया जाता है । यह अवशेषों और microfluidic चैनलों रोकना कर सकते हैं, चिप खराबी है, जो तो सफाई या प्रतिस्थापन की आवश्यकता है बना । इस प्रोटोकॉल में निर्माण डिवाइस microfluidics के लिए न केवल कटाई सिंक्रनाइज़ जानवरों के लिए एक विधि प्रदान करता है, लेकिन यह भी एक microfluidic डिवाइस में अपने सम्मिलन से पहले जानवरों की सफाई के लिए. मलबे और बैक्टीरियल अवशेषों को हटाने के द्वारा, जब पशुओं का संग्रह, microfluidic चैनल कम खराबी की संभावना है, इस प्रकार व्यक्तिगत चिप्स का परिचालन जीवन में वृद्धि और उनके साथ आयोजित किया जा रहा अनुसंधान के बाद का प्रवाह बढ़ रहा है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है । लेखकों की घोषणा है कि अनुसंधान किसी भी व्यावसायिक या वित्तीय संबंधों कि ब्याज की एक संभावित संघर्ष के रूप में लगाया जा सकता है के अभाव में आयोजित किया गया ।

Acknowledgments

लेखक अध्ययन डिजाइन करने के लिए उसे प्रारंभिक योगदान के लिए हीथ Currey शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए डॉ स्वरूप मित्रा । हम भी टिप्पणी, शोधन और इस पद्धति के प्रदर्शन के उत्पादन में सहायता के लिए डॉ माइकल बी हैरिस शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र है, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है द्वारा प्रदान की गई । इस प्रकाशन में सूचित अनुसंधान राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के जनरल मेडिकल साइंसेज के पुरस्कार संख्या UL1GM118991, TL4GM118992, या RL5GM118990 के तहत और एक संस्थागत विकास पुरस्कार से (विचार) द्वारा समर्थित किया गया था नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के राष्ट्रीय संस्थान के जनरल मेडिकल साइंसेज के अंतर्गत अनुदान संख्या 5P20GM103395-15. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं । UA एक ए. ए./ईओ नियोक्ता और शैक्षिक संस्थान है और किसी भी व्यक्ति के खिलाफ अवैध भेदभाव प्रतिबंधित: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Safety glasses Uline S-21076
Protective heat resistant glove Grainger Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube Falcon 14-432-22
Synthetic Nylon mesh Dynamic
Aqua-Supply Ltd		 NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue Scotch Super Glue Liquid SAD114
Pliers Vampliers VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file Lowe's Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR Sigma F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)  Sigma  S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127 Sigma P2443
Paraquat dichloride hydrate Sigma 36541
Inverted fluorescence microscope Olympus FSX100

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३७ Caenorhabditis एलिगेंस छंटाई स्थानांतरण तुल्यकालन तेजी से सुलभ
<em>Caenorhabditis</em> चलनी: छोटे कोशिकीय जीवों की छंटाई के लिए एक कम तकनीक साधन और कार्यप्रणाली
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Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., … More

Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms. J. Vis. Exp. (137), e58014, doi:10.3791/58014 (2018).

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