Caenorhabditis Sil: Et Low-tech Instrument og metodikk for sortering liten Multicellular organismer
Summary
Gjeldende protokollen inneholder en metode for sortering og rengjøring av alder-matchet bestander av Caenorhabditis elegans. Den bruker en enkel, billig og effektiv skreddersydde verktøy for å få store eksperimentelle innbyggere nematoder for forskning.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en veletablert modell organisme brukes på tvers av en rekke grunnleggende og biomedisinsk forskning. I Rundormer forskning samfunnet er det behov for en rimelig og effektiv måte å opprettholde store, alder-matchet bestander C.elegans. Her presenterer vi en metodikk for mekanisk sortering og rengjøring C. elegans. Vårt mål er å gi en kostnadseffektiv, effektiv, rask og enkel prosess for å få dyr uniform størrelser og livsstadier bruke eksperimenter. Dette verktøyet, Caenorhabditis silen, bruker en spesialbygd lokket system som tråder på vanlige koniske lab rør og sorterer C. elegans basert på kroppsstørrelse. Vi viser også at Caenorhabditis silen effektivt overfører dyr fra en kultur plate til en annen slik at for rask sortering, synkronisering og rengjøring uten innvirkning indikatorer for helse, inkludert motilitet og stress-induserbart Gene journalister. Tilgjengelig og nyskapende verktøyet er en rask, effektiv og ikke-stressende alternativ for å opprettholde C. elegans populasjoner.
Introduction
Rundormer ormen Caenorhabditis elegans, er en fremste modell organisme. I tillegg til enkel og kontrollert innholdet i sin dyrking i laboratoriet, deres hele genom er sekvensert1 og utviklingsmessige skjebnen til hver celle er kjent2. Disse funksjonene er C. elegans en mye brukt modell organisme for genetiske studier. Men kommer sammen med disse gunstige egenskaper noen utfordringer for forskere. På grunn av deres raske generasjonstid, C. elegans befolkninger kan raskt gå tom for mat og/eller bli blandet populasjoner med flere generasjoner og utviklingsstadier presentere samtidig. Dermed krever eksperimenter utført på solid Rundormer vekst medier (NGM) forskere å fysisk flytte dyr til frisk plater før bakteriell matkilde reduserer og nye larvene. Dette kan være kjedelig som en hyppig overføring av dyrene er krevde å forhindre eksperimentelle befolkningen fra blir blandet med avkom generasjoner. Likevel, noen eksperimenter krever både stort antall dyr og utvidet tidspunkt (f.eks, DNA eller RNA utvinning i voksen alder). Dette forbindelser utfordringer nøyaktig vedlikeholde synkroniserte innbyggere og overføre store antall dyr.
Gjeldende metoder av overfører C. elegans kultivert på NGM plukke eller vaske dyrene fra platen til plate; kjemisk behandling av dyr (f.eksmed DNA replikering hemmer fluorodeoxyuridine eller FUDR); eller bruke flowcytometri til å sortere dyrene i flere bra plater. Plukking innebærer bruk av en hånd verktøy, laget med en tynn platina wire eller en øyenvippe, manuelt overføre enkelte eller flere dyr3,4. Denne metoden er korrekt men krever både dyktighet og tid og er en begrensning for studier som involverer mange dyr. Plukke kan også være fysisk skade og stressende til dyrene ved å utsette potensielt individer til unaturlig og inkonsekvent mengder forstyrrelser og kraft. Vask innebærer skylling en kultur parabol med en buffer løsning og overføre løsningen med dyr via glass Pasteur Pipetter til en ny kultur plate. Denne metoden er rask og effektiv, men er ikke nøyaktig som flere generasjoner og utviklingsstadier av dyr overføres i bulk. Kjemiske behandlinger, for eksempel FUDR, kan forsvinne i culturing media å forhindre produksjon av avkom gjennom blokkerer noen utryddelse, og dermed Kjønnscelle produksjon og egg utvikling. Mens effektive, denne metoden må brukes etter utviklingsmessige modning som ikke forstyrre vanlige utviklingsprosesser, og dette betyr at det er fortsatt et krav å overføre dyrene før sin administrasjon3. Denne metoden også påvirker flere mobilnettet signalnettverk trasé, som resulterer i merkbare effekter på dyrene som de alder (f.eks, en livslengden utvidelse eller en forandret proteostasis) avhengig av belastningen av C. elegans brukt5, 6,7,8,9,10. Flow cytometri metoder automatisk sortere og overføre personlige C. elegans fra en multi godt plate til en11. Selv om denne metoden er svært effektiv og effektiv, er flow cytometri utstyr uoverkommelig dyrt og utilgjengelig for mange forskere. Et alternativ til overføring av dyr er å bruke mutant modeller som er ømfintlig, som fer-15 og fem-1, som blir steril med temperatur justering12. Mens bruke mutant dyr er nyttig i enkelte situasjoner, disse spesifikke stammer vokser saktere enn vill-type dyr og de er avhengige av en endret Genova, som dårlig representanter for aldring eller sunn. I tillegg avhengigheten av en temperatur skift å indusere sterilitet resulterer også i fravær av et statisk miljø, og temperaturendringer lett har vist å påvirke genet uttrykk13,14, 15. forskningsgrupper har tidligere publisert teknikker som beskriver bruken av en mesh filtrere C. elegans etter størrelse16. Men kunne vi ikke finne tidligere arbeid tester for endringer i de totale helse utfallene som kan knyttes til bruk av slike filtre.
Det er derfor et behov i C. elegans forskning samfunnet for en rimelig, effektiv, rask og nøyaktig metode for å overføre store antall dyr mellom kultur plater. Vi har utviklet en forbedret, tilgjengelig stykke utstyr (kalt Caenorhabditis silen) og en tilhørende protokoll for produksjon og operasjon som oppfyller behovene til C. elegans forskningen fellesskapet. Her, vi dele utformingen av Caenorhabditis sil og metodene for bruk, og vi viser at bruken ikke påvirker felles helse eller noen stress markører i forhold til standard manuell plukking og behandling med det vanlige, fruktbarhet-begrense kjemiske FUDR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, introdusert vi av design og bruk av tilgjengelig, effektiv Caenorhabditis silen som et verktøy for sortering og vedlikeholde C. elegans. Dette verktøyet har flere fordeler å manuelt velge enkelte dyr, vaske befolkninger, kjemiske behandlinger (f.eksFUDR) og dyrere metoder segregerende dyr. Først Caenorhabditis sil effektivt og raskt (mindre enn 20 min) sorterer avkom fra blandet folkerike dyr (tabell 2). Også bruk av verktøyet har ingen synlig toksiske effek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Heather Currey for hennes første bidrag til studien design, og Dr. Swarup Mitra for hans kritiske gjennomgangen av manuskriptet. Vi vil også gjerne takke Dr. Michael B. Harris for kommentarer, forbedringer og hjelp i å produsere demonstrasjon av denne metoden. Stammene ble levert av Caenorhabditis genetikk sentrum, som er finansiert av kontor NIH forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute Of General Medical Sciences av National Institutes of Health under prisen tall UL1GM118991, TL4GM118992 eller RL5GM118990 og en institusjonell utvikling pris (idé) fra National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under gi nummer 5P20GM103395-15. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health. UA er en AA/EO arbeidsgiver og utdanningsinstitusjon og forbyr ulovlig diskriminering mot enkeltpersoner: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
References
- C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
- Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).
- Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
- Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
- Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
- Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
- Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
- Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
- Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).
- Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
- Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
