Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Caenorhabditis Сито: Низкотехнологичные инструмент и методологии для сортировки мелких многоклеточных организмов

Published: July 4, 2018 doi: 10.3791/58014
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 2, 5
1Department of Biology and Wildlife, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 4Departments of Biology and Chemistry, Earlham College, 5Department of Biological Sciences, College of Natural Science and Mathematics, California State University Long Beach
* These authors contributed equally

Summary

Текущий протокол включает в себя методологию для сортировки и очистки соответствует возрасту населения Caenorhabditis elegans. Она использует простой, недорогой и эффективный инструмент по индивидуальному заказу для получения большой экспериментальной популяции нематод для научных исследований.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) является устоявшейся модельный организм, используется в различных основных и биомедицинских исследований. В пределах нематоды исследовательского сообщества существует необходимость для доступный и эффективный способ поддерживать большие, соответствует возрасту население C. elegans. Здесь мы представляем методологии для механически сортировки и очистки C. elegans. Наша цель-обеспечить экономически, эффективный, быстрый и простой процесс получения животных единообразных размеров и этапов жизни для их использования в экспериментах. Этот инструмент, Caenorhabditis сито, использует систему заказ крышкой, которая нити на общей трубы конической лаборатории и сортирует C. elegans на основе размера тела. Мы также продемонстрировать, что Caenorhabditis сито эффективно передает животных от одной культуры пластины другой позволяет для быстрой сортировки, синхронизация и очистки без влияния на маркеры здравоохранения, включая подвижность и стресс индуцибильный Джин репортеры. Это доступным и новаторский инструмент является быстрый, эффективный и не напряженный вариант для сохранения популяций C. elegans .

Introduction

Нематоды червей Caenorhabditis elegans, является премьер модельный организм. В дополнение к простой и управляемый характер их выращивания в лаборатории их весь геном последовательности1 и развития судьба каждой ячейки известен2. Благодаря этим свойствам C. elegans является широко используется модель организма для генетических исследований. Однако наряду с этими полезными характеристиками приходят некоторые проблемы для исследователей. Вследствие их быстрого поколения время C. elegans населения можно быстро запустить из пищи и/или стать смешанных популяций с нескольких поколений и этапы развития представит сразу. Таким образом эксперименты, проведенные на твердых нематоды роста СМИ (НГМ) требуют исследователи переехать физически животных свежие пластины до источника бактериального пищи истощает и новые личинки развиваются. Это может быть утомительно, как частые передачи животных требуется для предотвращения экспериментальной популяций от став смешивается с потомства поколений. Тем не менее некоторые эксперименты требуют как большое количество животных и длительное время точек (например, ДНК или РНК добыча в зрелом возрасте). Это усугубляет проблемы точно поддерживать синхронизированные населения и передачи большого количества животных.

Нынешние методы передачи C. elegans культивированный на NGM комплектации или мытья животных от плиты к плита; химически лечения животных (например, с fluorodeoxyuridine ингибитор репликации ДНК или FUDR); или с помощью проточной цитометрии для сортировки животных в нескольких хорошо пластины. Сбор включает в себя использование ручной инструмент, с тонкий провод платины или ресниц, внесенные вручную передачи отдельных или нескольких животных3,4. Этот метод является точной, но требует мастерства и времени и является ограничением для исследований с участием большого количества животных. Сбор мая также быть физически повреждения и напряженным для животных, потенциально подвергая лица неестественным и непоследовательных количество беспорядков и силы. Стиральная включает полоскания культуры блюдо с буферным раствором и передачи решения с животными через стеклянные пипетки Пастера новой культуры пластины. Этот метод является быстрым и эффективным, но не является точной, как несколько поколений и этапы развития животных передаются навалом. Химической обработки, такие как FUDR, может быть распущен в культивирования СМИ для предотвращения производства потомства через блокирование любых репликации ДНК и таким образом, развитие производства и яйцо гамет. В то же время эффективный, этот метод должен быть применен после развития созревания, чтобы не нарушить нормального развития процессов, и это означает, что все еще существует требование для передачи животных до его администрации3. Этот метод также влияет несколько сотовых сигнальные пути, что приводит к заметное воздействие на животных, как они возраста (например, продление срока службы или изменены proteostasis) в зависимости от штамма C. elegans используется5, 6,,78,9,10. Проточная цитометрия методы автоматически сортировать и передать еще11отдельных C. elegans от одной мульти хорошо пластины. Хотя этот метод является весьма эффективной и действенной, поток цитометрии оборудование чрезмерно дорогими и недоступными для многих исследователей. Альтернативой передачи животных является использование мутант моделей, которые температуры чувствительных, например Фер-15 и fem-1, которые становятся стерильные с регулировки температуры12. Хотя с помощью мутанта животных является полезным в некоторых ситуациях, эти конкретные штаммов растут медленнее, чем одичал тип животных, и они полагаются на изменения генома, выступающей в качестве бедных представителей для старения или здоровые черви. Кроме того, зависимость от температуры перехода побудить стерильности приводит также в отсутствие статической окружающей среды, и изменения температуры легко доказано влияние генов выражения13,14, 15. исследовательские группы опубликовали ранее методы, описывающие использование сетки для фильтрации C. elegans , размер16. Однако мы не смогли найти предыдущую работу, тестирование на любые изменения в общих результатов в отношении здоровья, которые могут быть связаны с использованием таких фильтров.

Таким образом, существует необходимость в C. elegans исследовательского сообщества для доступной, эффективного, быстрого и точного метода для передачи большого количества животных между пластинами культуры. Мы разработали улучшения, доступный кусок оборудования (название Caenorhabditis сито) и связанный протокол для его производства и эксплуатации, которая отвечает потребностям C. elegans научно-исследовательского сообщества. Здесь мы разделяем дизайн Caenorhabditis сито и методы для ее использования, и мы демонстрируем, что его использование не влияет на общее здоровье или любой стресс маркеры по сравнению с Стандартный ручной сбор и лечения с наиболее часто используемых ограничение рождаемости химических FUDR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Caenorhabditis сито строительство и использование

  1. Строительство протокол
    1. Приобрести 2 крышки от 50 мл конические трубы (рис. 1A).
    2. Снимите центральную область внутри внутренней губы крышки (если смотреть снизу, рис. 1B) с помощью горелки Бунзена и горячего металла зонд или паяльник или шагнуло сверла.
      Примечание: Использование тепла сократить пластиковой крышкой предпочтительнее лезвием, потому что есть меньше риск получения травмы.
    3. Чистота и песок срезанных краев и топ поверхности с изогнутой файл или роторные, шлифовальный инструмент (например, Dremel). Смотрите Рисунок 1 c.
    4. Вырежьте круг леска сетки для соответствующего диаметра (рис. 1 d). Для этого проследить крышкой на листе сетка нейлон Мононить и вырезать только внутри нарисованную линию.
    5. Вырежьте канавки/косые черты в верхней поверхности крышки для повышения адгезии двух крышек, когда клей применяется для пластика (Рисунок 1E).
    6. Очистить крышки с этанолом и дайте им высохнуть.
    7. Прикладываете Цианакрилатный клей к верхней поверхности обоих крышками, сохраняя к внешнему краю.
      Примечание: немного клея проходит долгий путь.
    8. Положите леска сетки, согласно таблице 1, на один из клееного крышкой (Рисунок 1F). Поместите крышку второй Перевернутый поверх сетки; Обе крышки должны иметь их вершины вместе. Нажмите твердо вместе (рис. 1 g). Убедитесь, что Сетка натянута.
      Примечание: как меру безопасности, использование пинцета поставить сетки на крышках.
    9. После начального слоя клей высохнет, применять кольцо Цианакрилатный клей вокруг внешней разрыв между крышками. Быть щедрым, поскольку это добавляет целостности и предотвращает любой пилинг врозь или утечки.
    10. Этикетка фильтр с размером пор сетки леска сетки.
      Примечание: Здесь, мы используем два размера поры сетки — 20 мкм и 50 мкм.
  2. Использовать протокол
    1. Предварительно Влажные сито.
      1. Пипетка физиологический раствор, например M9 [5 г NaCl, 6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 1 Л сверхчистого H2O и 1 мл MgSO4 (1 М)]17, через центр сита до формы капли , конденсируется и капает от центра дно фильтра (рис. 2A). При необходимости наносить ворса протрите (например, Kimwipe) на дно формы или капельку влаги на сетке.
      2. Поместите сито 50 мл Конические трубки. Этикетке трубки как «Отходы пробки» (рис. 2B).
    2. Вымойте население C. elegans от плиты агара.
      1. Вымойте тарелку с M9 буфера и место червь содержащих среднего на верхней части сетки леска 1 мл одновременно (рис. 2 c). Убедитесь в том работать в центре сетки. Вымойте все черви от пластины.
        Примечание: Как правило, 3 мл M9 60 мм пластины является достаточным.
      2. Чтобы свести к минимуму количество червей, потеряли в закупорить, используйте стеклянные пипетки Пастера для перемещения червей пластине и на центр сетки (повторять при необходимости).
      3. Промойте фильтр с буфером M9 сверху. Опять же убедитесь, что для работы в центре сетки и промойте все черви в этой области. Вымойте, как столько раз, сколько необходимо обеспечить, чтобы все бактерии и мелких червей прошло через сетку.
    3. Урожай размер соответствует животных из сита.
      1. Прикрепите новый 50 мл Конические трубки в верхней части сита, с взрослых червей из шага 1.2.2.3 обращена внутрь новой коллекции трубки (Рисунок 2D).
      2. Удалите первый трубки (отходов трубки) и быстро Переверните сито и новые трубки сохранить дроплет от миграции (Рисунок 2E).
        Примечание: Если стерильность не требуется, используйте ворса протрите (например, Kimwipe) чтобы фитиль жидкости из нижней части сетки до листать.
      3. Промойте сетку с M9 в новый Тюбик 50 мл от новой верхней (Рисунок 2F). Опять же работают в центре сетки и сохранить дроплет на нижней части сетки.
      4. Разрешить червей, чтобы урегулировать или нежно спина их вниз (например, < 16 x g) для примерно 1 мин (рис. 2 g).
      5. Аспирационная буферный раствор из Пелле червей, идеально вниз > 0,5 мл, или удалить как можно больше жидкости как можно не нарушая гранулы.
      6. Пипетка червей с помощью стеклянной пипетки Пастера на пластину НГМ и дайте им высохнуть. Несколько капель места вне на новой пластинкой так они высыхают быстрее (Рисунок 2 H).
    4. Очистите сетчатый фильтр.
      1. Промойте сито этанола и обратного осмоса вода мягко и тщательно. Дайте ему высохнуть.
      2. Храните его в чистый контейнер для неопределенного будущего использования.
      3. Отменить его, когда сетка развивается «sag» внешний вид.

2. Проверка Caenorhabditis сито, метод сортировки

  1. Общее техническое обслуживание
    1. Для всех экспериментов, культура черви на стандартные средства роста нематода17 (1 Л NGM состоит из 2,5 g Пептон, 17 g агар, 3 г NaCl, 975 мл двойной дистиллированной воды, 1 мл холестерин 5 мг/мл, 1 мл 1 М CaCl2 1 мл 1 М MgSO4, 25 мл 1 М KHPO4и 0,5 мл стрептомицина 100 мг/мл) при 25 ° C.
  2. Экспериментальное лечение администрация
    1. Сравните три группы: подбор, fluorodeoxyuridine (FUDR) и Caenorhabditis сито.
      1. Для лечения группы FUDR добавить 100 мг/мл FUDR NGM СМИ до конечной концентрации 100 мкм для предотвращения любого производства потомства и передать свежие NGM пластины избежать истощения Еда черви каждый день.
      2. Для выбора группы выберите и передачи червей, вручную с помощью платины цикла.
      3. Для группы лечения сито Caenorhabditis выполните шаг 1.2 и Пипетка червей на пластину NGM.
  3. Caenorhabditis Сито процентная доходность
    1. Дать количественную оценку, насколько эффективна при сортировке C. elegansсито, растут возраст синхронных N2 животных до 1 день совершеннолетия при 25 ° C (т.е., 48 ч после откладки) и затем передать их, выбирая их на свежий NGM пластины (группировка N = 50 или N = 100 животных на tre atment группы).
    2. После того, как 24 h восстановления, передать новые пластины NGM населения с Caenorhabditis сито после выше протокола (см. шаг 1.2) и подсчитать количество успешно переданных животных.
    3. Вычислить доходность в процентах как отношение числа животных, передаваемых по сравнению с начальный номер в начале передачи, умноженное на 100 (%).
  4. Healthspan анализов
    Примечание: Оценка healthspan параметров класса моторики, глоточные насоса и передней и задней нежное прикосновение ответ на дни, 2, 4, 6 и 8 совершеннолетия для синхронизации возраст N2 животных на уровне 25 ° C.
    1. Подвижность отслеживание
      1. Присвоить оценки подвижности, на основе системы, основанной на классе (классы A, B и C) следующие методы Херндон и др. 18. сравнить эффекты трех экспериментальных групп с использованием порядкового логистической статистики модели в статистический анализ программного обеспечения.
        Примечание: Класс A лиц спонтанно двигаться в нормальной, синусоидальные шаблон. Класс B лица двигаться в заметно несинусоидальных движений и могут потребовать подталкивание для поощрения движения. Класс C лиц переместить их головы или хвоста в ответ на давление, но не в состоянии двигаться через агар.
    2. Глоточные насоса
      1. Граф точильщика движения животного терминала глоточные колбы визуально под стереомикроскопом 600 X окончательное увеличение за 1 мин.
      2. Проводить статистический анализ с односторонний дисперсионный анализ с α = 0,05 и Бонферрони после испытания с α = 0,05.
    3. Ответ ощупь
      1. Запишите ответ нежное прикосновение и сравнения между группами три лечения. Выполнение анализов на основе методов, описанных в Каликсто et al. 19.
      2. Запись передней и задней сенсорных ответ, осторожно поглаживая ресниц забрать перпендикулярно через хвост или головы (5 x, чередуя голова и хвост) животных.
      3. Оценка любое движение в противоположном направлении ход как 1 балл по шкале от 0 до 5, как для передней и задней ответ.
      4. Проводить статистический анализ с односторонний дисперсионный анализ с α = 0,05 и Бонферрони после испытания с α = 0,05.
  5. Плодовитость пробирного
    1. Чтобы определить использование сито Caenorhabditis воздействия на репродуктивную функцию, возраст синхронных N2 животных расти 2 день совершеннолетия при 25 ° C.
    2. 60 h после откладывают яйца, передавать новые NGM пластины с Платиновый кирку или сито Caenorhabditis животных и дать им 4 h для восстановления (сухое, котор фильтруют пластины для 20-30 мин).
    3. После восстановления, индивидуально пластины животных через ресниц выбрать NGM тарелки, дать им 24 h откладывают яйца и удалить животных. Разрешите потомства на каждой табличке развивать при нормальных условиях для другой 24 ч при температуре 25 ° C.
      Примечание: Для ресниц забрать это человека ресницы прикрепленной к концу пипетки Пастера с лаком и стерилизации с этанолом.
    4. Подсчитать количество жизнеспособных людей поколения F1. Выполнять статистический анализ с использованием T-тест с α = 0,05.
      Примечание: Жизнеспособное потомство считаются яйца, которые успешно люк и начать их развитие посредством регулярных циклов личинок.
  6. Флуоресцентный репортер стресс ответ анализов
    1. Выполните три часто используемые флуоресцентные репортер анализов для выявления потенциальных маркеров стресса: DAF-16::GFP транслокации в ядрах клеток в штамм [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; hsp 16,2 выражение [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; и дерново-3 выражение [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.
    2. Для калибровочных, культура возраст синхронных животных от групп три лечения при 20 ° C и рассмотреть их на 3 день совершеннолетия: используйте отрицательный контроль (на ежедневной основе, передача группе животных вручную с платиновым забрать), положительный контроль (на ежедневной основе Группа животных вручную с платиновым забрать плюс установленные стрессор передача) и Caenorhabditis сито (пройти животных через сито и дать им возможность восстановить 30 мин на NGM перед изображений).
    3. В assay DAF-16::GFP тепловой шок положительный контроль животных при 37 ° C за 30 мин до20изображений. Для hsp 16,2 assay тепловой шок животных положительный контроль 90 мин, 20 h до21изображений. Для дерново-3 assay лечить животных положительный контроль с параквата 100 мм за 4 ч до визуализации22.
    4. Урожай червей сразу с ресниц забрать и смонтировать их на coverslip с 1 мкл раствора 407 ПАВ Плюроники 36% для иммобилизации червей.
    5. Сэндвич-навесные червей с другой coverslip. Подключите два coverslips для изображения и слайд микроскопии стандартного стекла червей с помощью 8 крат на Перевернутый флуоресцентный микроскоп (для общего увеличения 80 X) и постоянной экспозиции с фильтром FITC.
    6. Чтобы обнаружить любые различия между тремя группами в assay DAF-16::GFP, классифицировать животных на основе расположения (ядерной если репортер перемещен в ядрах, цитозольной если репортер расположен в цитозоле и промежуточных если репортер DAF-16::GFP репортер, расположенный в ядрах и цитозоле).
    7. Сравните результаты, с использованием статистической модели порядковое логистики в статистический анализ программного обеспечения. Hsp 16,2 и дерново-3 выражение анализов, использовать односторонний дисперсионный анализ с α = 0,05 и Тьюки должность Специального тесты с α = 0,05 сравнить общее флуоресценции глава региона.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Caenorhabditis сито состоит из 2 колпачки, обеспечение области ткани нейлоновая сетка леска меньше, чем диаметр тела желаемого развития возраста, используемое для извлечения живой популяции организмов, используя метод простой промывки. Он придает стандартные конические трубы и использует на экране сетки для механически сортировки животных по диаметру тела, оставляя желаемого животных в трубе готова для дальнейшего обслуживания и эксперименты (например, передача или генетических урожая). Нежный ручной стирки с ситом Caenorhabditis быстро, примерно 5 минут, за 60-100 мм и организмы легко восстанавливаются из сетки.

Процентная доходность животных после Caenorhabditis Использование сито
Установить процент доходности Caenorhabditis сито, устройства были протестированы с 20 мкм и 50 мкм-поры сеток на взрослых животных. А значит, доходность > 90% успешной передачи животное было достигнуто для обоих размеров сетки испытания (Таблица 1).

Леска сетка с различных размеров, пробелы могут быть использованы для разделения животных различных этапах жизни. Сетка с 20 мкм пробелы подходит для промывки прочь развивающихся эмбрионов и личиночной стадии меньше, чем четвертый личиночной стадии, сохраняя последний (L4; средняя тела диаметром 32 мкм) и любых животных в более поздних этапах жизни, в то время как сетки с 50 мкм пробелы позволит всем другие жизни стадий в сторону от взрослых (с средняя тела диаметром 70 мкм) чтобы быть смыты (Таблица 2).

Caenorhabditis Сито использования не влияет на healthspan метрики
Подвижность: В C. elegans нормального синусоидальных движения (например, подвижность) уменьшается с возрастом18 и является показателем общего состояния здоровья. Чтобы определить, если сито Caenorhabditis влияние на подвижность, оценки подвижности были по сравнению для подбора, FUDR и Caenorhabditis сито лечения групп дни 2, 4, 6 и 8 взрослой жизни. Все животные в каждой группе (n = 10/группа) выставлены нормальной и спонтанного движения шаблоны (класс A) на несколько веков всей взрослой жизни (дни 2, 4, 6 и 8 взрослой жизни; p > 0,05 для нескольких сравнений на все дни, рис. 3).

Глоточные насоса: C. elegans глоточных мышц способность насоса уменьшается с возрастом и является другой биомаркер healthspan23. Чтобы определить, если сито Caenorhabditis влияние глоточные насоса животных, забрать, FUDR и Caenorhabditis сито лечения группы были сопоставлены на дни, 2, 4, 6 и 8 взрослости (n = 8-10 на группу). Существует значительная разница между животными, которые прошли сбор и FUDR методы в дни 6 (p < 0,001) и 8 (p < 0,001). Кроме того, существует значительная разница между сито и FUDR группами на 6 дней (p < 0,001) и 8-й день совершеннолетия (p < 0,001). Однако, было обнаружено статистически значимой разницы между забрать и Caenorhabditis сито группами для любой день (p > 0,05, рис. 4), указав, что сита не влияет эта мера healthspan.

Нежное прикосновение ответ: Ответ на механическое стимулом является физиологической маркер для оценки старения или общего здоровья24,-правовая25; Таким образом влияние различных методов на передней и задней нежное прикосновение ответы были протестированы. Там был никакой статистически значимой разницы между подбора, FUDR и Caenorhabditis сита лечения группы (n = 8/группа), кпереди или кзади, для любой день тестирования (p > 0,4 для всех сопоставлений; Рисунок 5А и 5B).

Плодовитость: Установить ли Caenorhabditis сито влияние на количество жизнеспособного потомства, производимых C. elegans, отдельные потомство, производится в течение 24 ч в течение 3-й день совершеннолетия был учитываются и сравнении (n = 20-22 на группу). Использование сито Caenorhabditis значительно не снижают количество потомства, когда по сравнению с группой лечения выбрать (p = 0,61, рис. 6).

Молекулярные репортер анализов
Ядерный транслокации DAF-16: В C. elegansактивация транскрипционного фактора DAF-16 связан с увеличенным усилием сопротивления26. Ядерной локализации DAF-16 был рассмотрен трансгенных нематоды штамм TJ356, который выражает DAF-16 сливается с зеленого флуоресцентного белка (DAF-16::GFP)20. В условиях нормального роста DAF-16::GFP локализуется преимущественно в цитозоле, но под различные раздражители (например, тепловой стресс), он быстро перемещаются в ядро20. Чтобы проверить влияние сортировки с Caenorhabditis сито на DAF-16 транслокации, DAF-16::GFP локализации были сопоставлены в возраст соответствует взрослых день-5 в группе положительный контроль (тепловой стресс), отрицательный контроль группы (ручной передачи через подбор), и Caenorhabditis сито лечения группы (n = 10/группа). Передача с Caenorhabditis сито не влияет на ядерной транслокации DAF-16::GFP и показал аналогичный фенотипу отрицательного контроля животных (p > 0,05, рис. 7).

HSP 16,2 репортер: белки малых теплового шока как HSP-16,2 являются биомаркерами реакции на стресс, и они сильно выражены во время воздействия теплового шока или Оксидативный стресс агентов21,27. Штамм TJ375 имеет Репортер ген GFP сливается с hsp 16,2 промоутер, который не является активным, при нормальных условиях21. Однако после воздействия теплового шока, HSP-16,2 белков индуцируется, и животные отображения высокий уровень GFP выражение21. Для проверки участия Caenorhabditis сито на ответ HSP-16,2 опосредованной стресс, плотность флуоресценции в регионе глотки (n = 10 животных/группа) соответствует возрасту животных было сравнить в день-5 взрослых между позитивным контрольной группы (тепла стресса), отрицательный контроль группа (выбор) и группа лечения Caenorhabditis сито. Передачи с Caenorhabditis сито не вызвать значительно выражение HSP-16.2::GFP (hsp-16.2::gfp) по сравнению с отрицательного контроля (p > 0,05, рис. 8).

дерново-3 репортер: В C. elegans, анти-оксидантов ген, кодирующий для Супероксиддисмутаза (SOD-3) 3 регулируется вверх во время окислительного стресса28. C. elegans штамм CF1553 выражает Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП)-помечены SOD-3 промоутер, выражением которого индуцируется окислительного стресса, такие как паракват5. Чтобы проверить участия Caenorhabditis сортировки сито на ответ антиоксидант в C. elegans, плотность флуоресценции в регионе головы соответствует возрасту день-5 взрослых сравнивали между положительный контроль населения (100 мкм параквата лечение), отрицательный контроль населения (ручной сбор) и Caenorhabditis сито переданы населения. Передачи с Caenorhabditis сито не вызвать значительно выражение дерново 3::gfp по сравнению с отрицательного контроля (p > 0,05, рис. 9).

Figure 1
Рисунок 1: Строительство сито Caenorhabditis . Прогрессирование «сделай сам» Изготовление инструмента отображается. Эти панели показывают (A) два 50 мл конические трубы Шапки (B) центры которых были удалены, (C) сократить края сглажены и (D - F) которые оснащены леска сетка соответствует желаемой жизни стадии C. elegans (см. протокол для подробной информации). (G) завершенные сито также показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Шаг за шагом изображения представление использования сито Caenorhabditis . (A) сито заранее мокрый с капли раствора M9, и (B) соответствовать на вершине 50 мл Конические трубки. (C) 1 мл M9, решение с червей накапаны на верхней части сита, (D) 50 мл Конические трубки помещен na górze сито с червями, обращена внутрь трубки и (E) сито с только что присоединенной верхняя труба является быстро перелистывание o ver. (G) промывают сито с M9 желаемого животные нося в новой 50 мл трубки и червей разрешено поселиться самотеком в нижней части трубки. (H) черви являются накапаны и размещены как капельки на свежие NGM пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Caenorhabditis сито не влияет подвижность на протяжении всей жизни. Эта цифра показывает распределение класса подвижности животных на 2, 4, 6 и 8 совершеннолетия для подбора, FUDR и Caenorhabditis сито лечения групп. Класс животных переехал обычно и спонтанно, класса B животных переехал ненормально и могут потребовалось что подталкивание и класс C животных были не в состоянии двигаться. Нет никакой разницы между Caenorhabditis сито, подбора и FUDR групп (p > 0,05). Три реплицирует (n = 10 животных на лечение пластину) были проведены и проанализированы с порядковым номером логистической моделью. класс B животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Использование Caenorhabditis сито не повлияло глоточные накачки на протяжении всей жизни. Эта цифра показывает глоточные насос ставки выбрать, FUDR, и Caenorhabditis сито группы лечения, по сравнению на дни, 2, 4, 6 и 8 взрослой жизни. Звездочки обозначает значение между забрать, сито и FUDR лечения группы для дней (*** p < 0,05). Нет никакой разницы между Caenorhabditis сито и забрать группой (p > 0,05). Два реплицирует (N = 10 животных на лечение пластину) были проведены и проанализированы с односторонним ANOVA и Бонферрони после тестирования. Столбцы представляют собой среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Использование Caenorhabditis сито не влияют передней касание ответ на протяжении всей жизни. Эти панели показывают передней (A) и (B) задняя сенсорного отклика количество подбора, FUDR и Caenorhabditis сито лечения группы по сравнению дни 2, 4, 6 и 8 взрослой жизни. Были проведены два реплицирует с N = 10 в каждой группе лечения и по сравнению с односторонним ANOVA и Бонферрони тест (p = 0,4 и p = 0,9 для передней и задней, соответственно). Столбцы представляют собой среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Caenorhabditis сито не влияет количество жизнеспособных потомков на 3 день совершеннолетия. Эта цифра показывает жизнеспособного потомства день-3 взрослых после 24 ч яйцекладка периода, охватывающих 3 день совершеннолетия для родительского животных. Столбцы представляют собой среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения. N = 20-22 животных из по меньшей мере два отдельных биологических реплицирует каждой группе лечения. Группы лечения сравниваются с t-теста, (p > 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: Caenorhabditis сито не влияет на ядерной транслокации DAF-16::GFP. Эти панели показывают представитель изображения транслокации DAF-16 (A) теплового шока группы (положительный контроль), (B) выбрать группы (отрицательный контроль) и (C) Caenorhabditis сито лечения группы. (D) животных в группе положительный контроль отображается активации ядерного транслокации DAF-16. Caenorhabditis сито не вызвать ядерный транслокации и отображается цитозольной синтез белка похож на животных в группе отрицательного контроля. N = 10 животных каждой группе лечения от по крайней мере три отдельных биологических реплицирует. Группы лечения сравнивались с односторонним ANOVA и Тьюки должность Специального теста. Шкалы бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: Caenorhabditis сито не влияет на выражение hsp16.2::gfp. HSP-16,2 выражений (в единицах произвольных флуоресценции) теплового шока группы (положительный контроль), подбор группы (отрицательный контроль) и группы лечения Caenorhabditis сито сравниваются. Звездочками обозначают высокое выражение hsp16.2::gfp для положительных контрольной группы, которая была значительно отличаются от других групп лечения (*** p < 0,05). Caenorhabditis сито не влияет на выражение hsp16.2::gfp и отображается в группе отрицательный контроль интенсивности флуоресценции похож на животных (p > 0,05). Были проведены три реплицирует с N = 10 в каждой группе лечения и по сравнению с односторонним ANOVA и Тьюки должность Специального теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 9
Рисунок 9: Caenorhabditis сито не влияет на выражение дерново 3::gfp. SOD-3 выражения (в единицах произвольных флуоресценции) группу параквата 100 мкм (положительный контроль), выбрать группу (отрицательный контроль) и Caenorhabditis сито лечения группы отображаются. Звездочками обозначают высокое выражение дерново 3::gfp для положительных контрольной группы, которая была значительно отличаются от других групп (*** p < 0,05). Caenorhabditis сито не влияет на дерново 3::gfp выражение и отображается в группе отрицательный контроль интенсивности флуоресценции похож на животных (p > 0,05). Были проведены три реплицирует с N = 10 в каждой группе лечения и по сравнению с односторонним ANOVA и Тьюки должность Специального теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Размер сетки N = 50 N = 100
20 мкм 95.33%
50 мкм 99,00% 93,33%

Таблица 1: доходность в процентах от размеров сетки. Эта таблица показывает результаты 20 мкм устройства протестированы с N = 50 взрослых 3 реплицирует и 50 мкм устройства протестированы с N = 50 взрослых для 2 реплицирует и с N = 100 для 3 реплицирует.

Размер сетки Стадии развития Диаметр корпуса
20 мкм Личиночной стадии 4 ~ 35 мкм
50 мкм День 1 Взрослый ~ 70 мкм

Таблица 2: среднее тело диаметр. Эта таблица показывает среднее тело диаметр, приобретенного путем усреднения 3 измерения, одинаково распределены каждый червь для 15 животных на каждом этапе размеренной жизнью.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы ввели дизайн и использования доступных, эффективных Caenorhabditis сито как инструмент для сортировки и поддержание C. elegans. Этот инструмент имеет ряд преимуществ для вручную выбрать отдельных животных, Стиральная населения, химической обработки (например, FUDR) и более дорогостоящие методы разделения животных. Во-первых, Caenorhabditis сито эффективно и быстро (меньше чем 20 мин) сортирует потомков от крупных смешанных популяций животных (Таблица 2). Кроме того использование инструмента имеет не обнаружено токсическое воздействие на животных healthspan (рис. 3, рис 4, Рисунок 5, Рисунок 6), не вызывают хорошо описано генетических стресс Репортеры (рис. 7, Рисунок 8 Рис. 9) и уменьшает количество иностранных химического вещества, которые могли бы повлиять лечения для культуры пластин или любой молекулярного анализа впоследствии. Его простота использования является значительное преимущество; исследователь в любой стадии их образования могут быть обучены использовать его (рис. 1 и рис. 2; Протокол).

Материалы, необходимые для изготовления и использования сито (например, пипетки, буферы) легко доступны в стандартных исследовательских лабораториях; Таким образом если разбиваются, Caenorhabditis сито не дорого для ремонта или замены. Построенных собственными характер Caenorhabditis сито позволяет ему быть универсальным инструментом: это может быть построен с сетки размерами подходящими для различных C. elegans этапы развития и фенотипы. Caenorhabditis сито может также использоваться в анализов, проведенных в других видов нематод или когда изоляция мелких организмов, предоставляется соответствующий размер используется при производстве.

В дополнение к преимуществам этот инструмент обеспечивает для обслуживания населения C. elegans , сита могут быть использованы для очистки животных перед их использованием в других экспериментальных приложений. Например с развитием микрофлюидика проводить C. elegans исследования приходит вопрос о чип использования и чистки. В зависимости от количество бактерий, прилагается к животным особые меры предосторожности должны приниматься чтобы не засорять microfluidic чип, что делает его непригодным для использования29. Часто, когда C. elegans передаются microfluidic чип, остатки от бактериальных газона привезли с собой. Это остаток можно и забить microfluidic каналы, что делает чип неисправность, которая затем требует очистки или замены. Конструкция устройства в этом протоколе предлагает метод для уборки не только синхронизированные животных для микрофлюидика, но и для очистки животных до их вставки в microfluidic устройство. Путем удаления мусора и бактериальных осадок, при сборе животных, microfluidic каналы являются менее подвержен сбоям, увеличивая срок эксплуатации отдельных чипов и последующего пропускную способность исследований, проводимых с ними.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать. Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Хизер Керрей ее первоначальный вклад дизайн исследования и доктор Сваруп Mitra для его критический обзор рукописи. Мы также хотели бы поблагодарить д-р Майкл б. Харрис для комментариев, уточнений и помощь в подготовке демонстрации этой методологии. Штаммы были предоставлены центром генетики Caenorhabditis, который финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440). Исследования в этой публикации было поддержано, национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здоровья под награду номера UL1GM118991, TL4GM118992 или RL5GM118990 и институционального развития Award (IDeA) от Национальный институт Генеральной медицинских наук национальных институтов здравоохранения грант номер 5P20GM103395-15. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья. UA — AA/EO работодателя и учебное заведение и запрещает незаконной дискриминацию в отношении любого лица: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Safety glasses Uline S-21076
Protective heat resistant glove Grainger Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube Falcon 14-432-22
Synthetic Nylon mesh Dynamic
Aqua-Supply Ltd		 NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue Scotch Super Glue Liquid SAD114
Pliers Vampliers VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file Lowe's Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR Sigma F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)  Sigma  S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127 Sigma P2443
Paraquat dichloride hydrate Sigma 36541
Inverted fluorescence microscope Olympus FSX100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  2. Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
  3. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  4. Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
  5. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
  6. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
  7. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
  8. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
  9. Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
  10. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
  11. Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
  12. Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).
  13. Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
  14. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
  15. Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
  16. Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
  17. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  18. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  19. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  20. Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
  21. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  22. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  23. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
  24. Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
  25. Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
  26. Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).
  27. Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
  28. Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
  29. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).

Tags

Биология развития выпуск 137 Caenorhabditis elegans сортировка передачи синхронизации быстрый доступный
<em>Caenorhabditis</em> Сито: Низкотехнологичные инструмент и методологии для сортировки мелких многоклеточных организмов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., … More

Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms. J. Vis. Exp. (137), e58014, doi:10.3791/58014 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter