Summary
Det nuvarande protokollet innehåller en metod för sortering och rengöring av åldersmatchade populationer av Caenorhabditis elegans. Det använder en enkel, billig, och effektivt skräddarsydda verktyg för att få en stor experimentell population av nematoder för forskning.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) är en väletablerad modellorganism används inom en rad grundläggande och biomedicinsk forskning. Inom nematoder forskarsamhället finns det ett behov av ett prisvärt och effektivt sätt att upprätthålla stora, åldersmatchade populationer av C. elegans. Här presenterar vi en metodik för mekaniskt sortering och rengöring C. elegans. Vårt mål är att tillhandahålla en kostnadseffektiv, effektiv, snabb och enkel process för att få djur av enhetliga storlekar och levnadsstadier för deras användning i experiment. Detta verktyg, Caenorhabditis sikten, använder en specialbyggda lock system som trådar på gemensamma koniska lab rör och sorterar C. elegans baserat på kroppsstorlek. Vi visar också att Caenorhabditis sikten effektivt överför djur från en kultur plattan till en annan vilket möjliggör en snabb sortering, synkronisera och rengöring utan att påverka markörer för hälsa, inklusive motilitet och stress-inducerbara gen reportrar. Tillgängliga och innovativa verktyget är en snabb, effektiv och icke-stressiga alternativet för att upprätthålla C. elegans populationer.
Introduction
Nematoder masken, Caenorhabditis elegans, är premier modellorganism. Förutom enkel och kontrollerad karaktären av deras odling i laboratoriet, deras hela genomet är sekvenserade1 och utvecklingsmässiga ödet för varje cell är känd2. På grund av dessa funktioner är C. elegans en allmänt använd modellorganism för genetiska studier. Dock kommer tillsammans med dessa välgörande egenskaper vissa utmaningar för forskare. På grund av deras snabba generationstid, C. elegans populationer kan snabbt slut på mat eller bli blandade populationer med flera generationer och utvecklingsstadier presentera på en gång. Således kräver experiment som utförs på solid nematoder tillväxt medier (NGM) forskare att fysiskt flytta djuren till färska plattor innan den bakteriella näringskälla utarmar och nya larver utvecklas. Detta kan vara långtråkig som en frekvent flyttande av djuren krävs för att förhindra de experimentella populationerna från att bli blandat med avkomma generationer. Fortfarande, några experiment kräver både stort antal djur och utökade tidpunkter (t.ex., DNA eller RNA extraktion i vuxen ålder). Detta föreningar noggrant upprätthålla en synkroniserad befolkning och överföra stora mängder djur utmaningar.
Nuvarande metoder för att överföra C. elegans odlade på NGM plockning eller tvätt djuren från platta till platta. kemiskt behandla djuren (e.g., med DNA-replikering hämmare fluorodeoxyuridine eller FUDR); eller med hjälp av flödescytometri för att sortera djuren i plattor med flera. Plockning innebär användning av ett verktyg, gjorda med antingen en tunn platina tråd eller en ögonfrans, kan du manuellt överföra enskilda eller flera djur3,4. Denna metod är korrekt men kräver både skicklighet och tid och är en begränsning för studier med stort antal djur. Plocka maj också vara fysiskt skadligt och stressande för djuren genom att potentiellt utsätta personer för onaturliga och inkonsekventa mängder störning och kraft. Tvätt innebär sköljning en kultur skålen med en buffertlösning och överföra lösningen med djuren via glas Pasteur-pipett till en ny kultur-platta. Denna metod är snabb och effektiv men är inte exakt som flera generationer och utvecklingsstadier av djur överförs i bulk. Kemiska behandlingar, såsom FUDR, kan upplösas i culturing media att förhindra produktion av avkomma genom blockerar någon DNA-replikation, och därmed, gamete produktion och ägg utveckling. Medan effektiva, denna metod måste tillämpas efter utvecklingsmässiga mognad att inte störa de normala utvecklingsprocesser, och detta innebär att det fortfarande finns ett krav på att överföra djuren före dess administration3. Den här metoden påverkar också flera cellulär signalering vägar, som leder till märkbara effekter på djuren när de blir äldre(t exen livslängd förlängning eller en förändrad proteostasis) beroende på stam av C. elegans används5, 6,7,8,9,10. Flödescytometri metoder automatiskt sortera och överföra enskilda C. elegans från en flera platta till en annan11. Även denna metod är mycket effektiv och ändamålsenlig, är flöde flödescytometri utrustning oöverkomligt dyra och otillgängliga för många forskare. Ett alternativ till överföra djur är att använda mutant modeller som är temperaturkänsliga, såsom fer-15 och fem-1, som blivit sterila med temperatur justering12. Med hjälp av muterade djur är användbart i vissa situationer, dessa särskilda stammar växa långsammare än vildtyp djur och de förlitar sig på en förändrad arvsmassa, tjänstgör som dålig företrädare för åldrande eller friska maskar. Dessutom förlitar sig på en temperatur Skift att inducera sterilitet resulterar också i avsaknad av en statisk miljö och temperaturförändringar har visats lätt att påverka gen uttryck13,14, 15. forskargrupper har tidigare publicerats tekniker som beskriver användningen av ett nät att filtrera C. elegans av storlek16. Dock kunde vi inte hitta tidigare arbete testning för eventuella ändringar i de övergripande hälsoresultat som kan förknippas med användning av sådana filter.
Således finns ett behov inom forskarsamhället C. elegans för en prisvärd, effektiv, snabb och noggrann metod för att överföra stora mängder djur mellan plattorna och kultur. Vi har utvecklat en förbättrad, tillgänglig utrustningsenhet (heter Caenorhabditis sikten) och ett tillhörande protokoll för dess tillverkning och drift som uppfyller behoven hos C. elegans forskarsamhället. Häri, vi dela utformningen av Caenorhabditis sikten och metoderna för dess användning, och vi visar att dess användning inte påverkar den gemensamma hälsan eller någon stress markörer jämfört med standard manuell plockning och en behandling med den vanliga, fertilitet-begränsa kemiska FUDR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Caenorhabditis Sieve konstruktion och användning
-
Konstruktion-protokollet
- Förvärva 2 lock från 50 mL koniska rör (figur 1A).
- Ta bort center området innanför inre läppen av locken (sedd från botten, figur 1B) med hjälp av en bunsenbrännare och en het metall sond eller en lödkolv eller klev drill bit.
Obs: Klipper plastlock med värme är att föredra framför ett blad eftersom det finns mindre risk för skador. - Rengör och slipa har skurna kanter och topp ytan med en böjd fil eller en roterande slipverktyg (t.ex., Dremel). Se figur 1 c.
- Skär cirkeln av monofilamentgarn mesh till lämplig diameter (figur 1 d). För detta, spåra ett lock på monofilament nylon mesh ark och skär precis innanför den linje dragen.
- Skär skåror/snedstreck i ovansidan av locken att förbättra vidhäftningen av två locken när limmet appliceras på plasten (figur 1E).
- Rengör locken med etanol och låt dem torka.
- Tillämpas cyanoakrylat lim på den övre ytan på båda locken, hålla till yttre kant.
Obs: lite lim går en lång väg. - Låg den monofilament mesh, enligt tabell 1, på ett limmade lock (figur 1F). Placera andra locket inverterad ovanpå maskan, båda locken måste ha deras toppar tillsammans. Tryck fast grupp (figur 1 g). Se till att maskorna är spända.
Obs: som en säkerhetsåtgärd, Använd pincett att placera mesh på locken. - När det första lagret av limmet har torkat, applicera en ring av cyanoakrylat lim runt yttre klyftan mellan locken. Vara generös som detta ger integritet och förhindrar eventuella peeling apart eller läcker.
- Etikett filtret med mesh porstorlek av monofilamentgarn mesh.
Obs: Här, använder vi två mesh porstorlek — 20 µm och 50 µm.
-
Använd protokollet
- Pre våt sikten.
- Pipettera en saltlösning, såsom M9 [5 g NaCl, 6 g av Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 1 L av ultrarena H2O och 1 mL MgSO4 (1 M)]17, genom centrum av sikten tills en droppe former , kondenserar och droppar utanför centrum av filtret botten (figur 2A). Du kan också tillämpa en luddfri torka (t.ex., Kimwipe) till botten för att formen eller sprida en fukt droplet på mesh.
- Placera sikten över en 50 mL konisk tub. Märk röret som 'Avfall röret' (figur 2B).
- Tvätta en befolkning på C. elegans av en agarplatta.
- Tvätta plattan med M9 bufferten och placera masken-innehållande mediet på ovansidan av monofilamentgarn mesh 1 mL i taget (figur 2 c). Se till att fungera i mitten av mesh. Tvätta alla maskar från plattan.
Obs: Vanligtvis 3 mL M9 för en 60 mm platta är tillräcklig. - För att minimera antalet maskar förlorade i pipettering, Använd ett glas Pasteur-pipett för att flytta maskar utanför plattan och på stadens mesh (upprepa efter behov).
- Skölj filtret med M9 bufferten från toppen. Igen, se till att fungera i mitten av mesh och skölj alla maskar i området. Tvätta så många gånger som nödvändigt för att säkerställa att alla bakterier och mindre maskar har passerat genom maskan.
- Tvätta plattan med M9 bufferten och placera masken-innehållande mediet på ovansidan av monofilamentgarn mesh 1 mL i taget (figur 2 c). Se till att fungera i mitten av mesh. Tvätta alla maskar från plattan.
- Skörda storlek-matchade djuren från sikten.
- Bifoga en ny 50 mL koniska tub till toppen av sikten med vuxna maskar från steg 1.2.2.3 vetter mot insidan av nya samling röret (figur 2D).
- Ta bort det första röret (avfall tube) och bläddra snabbt över sikten och ny tub att hålla droplet-programmet från att migrera (figur 2E).
Obs: Om sterilitet inte krävs, använda en luddfri torka (t.ex., Kimwipe) till veken vätska från botten av maskan före vändning. - Skölj mesh med M9 i nya 50 mL röret från nya ovansidan (figur 2F). Igen, driva i stadens mesh och underhålla en droplet på undersidan av mesh.
- Tillåta maskar reglera eller försiktigt snurra dem ner (t ex, < 16 x g) för ca 1 min (figur 2 g).
- Aspirera buffertlösningen från pelleten av maskar, helst ner till > 0,5 mL, eller ta bort så mycket vätska som möjligt utan att störa pelleten.
- Pipettera maskar använder ett glas Pasteur-pipett på en NGM plattan och låt dem torka. Utrymme flera droppar ut på en ny platta så de torkar snabbare (figur 2 H).
- Ren sikten.
- Skölj sikten försiktigt och noggrant med etanol och omvänd-osmos vatten. Låt det torka.
- Förvara den i en ren behållare för obestämd framtida användning.
- Kasta det när mesh utvecklar ett ”sag” utseende.
- Pre våt sikten.
2. validering av Caenorhabditis Sieve sorteringsmetod
- Allmänt underhåll
- För alla experiment, maskar kultur på en standard Nematoden tillväxtmassmedia17 (1 L av NGM består av 2,5 g pepton, 17 g agar, 3 g NaCl, 975 mL dubbeldestillerat vatten, 1 mL av 5 mg/mL kolesterol, 1 mL 1 M CaCl2 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL 1 M KHPO4och 0,5 mL 100 mg/mL streptomycin) vid 25 ° C.
- Experimentell behandling administration
- Jämför de tre behandlingsgrupperna: plocka, fluorodeoxyuridine (FUDR) och Caenorhabditis sikten.
- För behandlingsgruppen FUDR lägga till 100 mg/mL FUDR till NGM media till en slutlig koncentration på 100 μM till hindra någon avkomma produktion och överföra maskar varannan dag till en färsk NGM-tallrik för att undvika mat utarmning.
- För gruppen plocka Markera och överföra maskar manuellt med en platinaögla.
- För behandlingsgruppen Caenorhabditis sikten, Följ steg 1.2 och Pipettera maskar på en NGM-plattan.
- Jämför de tre behandlingsgrupperna: plocka, fluorodeoxyuridine (FUDR) och Caenorhabditis sikten.
- Caenorhabditis Sieve procentuella avkastning
- För att kvantifiera hur effektiv sikten är på sortering C. elegans, växa ålder-synkron N2 djur till dag 1 vuxen vid 25 ° C (dvs48 h efter äggläggning) och sedan överföra dem genom att plocka dem till färska NGM pläterar (totalt N = 50 eller N = 100 djur per tre atment grupp).
- Efter 24 h av återhämtning, överföra befolkningen till nya NGM plattor med Caenorhabditis sikten efter ovanstående protokoll (se steg 1.2) och räkna antalet framgångsrikt överförda djur.
- Beräkna den procentuella avkastningen som förhållandet mellan antalet djur överförs i jämförelse med startnummer i början av överföringen multiplicerat med 100 (%).
- Healthspan analyser
Obs: Poäng healthspan parametrar för klassen motilitet, den faryngeal pumphastigheten, och både den främre och bakre lätt beröring svar på dag 2, 4, 6 och 8 i vuxen ålder för ålder-synkroniserad N2 djur hålls vid 25 ° C.- Motilitet spårning
- Tilldela motilitet Poäng baserad på klass-baserade system (klasser A, B och C) efter metoderna för Herndon o.a. 18. jämföra effekterna av tre experimentella grupper använder en ordinal logistic statistik modell i statistisk analysprogramvara.
Obs: Klass A individer flytta spontant i en normal, sinusformad mönster. Klass B individer flytta i markant icke-sinusformade rörelser och kan kräva prodding att uppmuntra rörlighet. Klass C individer flytta deras huvud eller svans som svar på prodding men inte kan flytta över agar.
- Tilldela motilitet Poäng baserad på klass-baserade system (klasser A, B och C) efter metoderna för Herndon o.a. 18. jämföra effekterna av tre experimentella grupper använder en ordinal logistic statistik modell i statistisk analysprogramvara.
- Faryngeal pumphastighet
- Räkna grinder förflyttning av djurets terminal faryngala glödlampa visuellt under ett stereomikroskop på en 600 X slutliga förstoringen för 1 min.
- Genomföra en statistisk analys med en envägs ANOVA med α = 0,05 och Bonferroni efter tester med α = 0,05.
- Anslagskänslighet
- Spela in en mild anslagskänslighet och jämföra mellan de tre behandlingsgrupperna. Utföra de analyser baserat på de metoder som beskrivs av Calixto o.a. 19.
- Posten den främre och bakre tryck svar genom att försiktigt stryka en ögonfrans plocka vinkelrätt över stjärten eller huvudet (5 x varje, alternerande huvud och svans) av djuren.
- Poäng någon rörelse i motsatt riktning av stroke som 1 Poäng på en skala från 0 till 5 för både den främre och bakre svar.
- Genomföra statistisk analys med en envägs ANOVA med α = 0,05 och Bonferroni efter tester med α = 0,05.
- Motilitet spårning
- Fruktsamhet assay
- För att bestämma användningen av Caenorhabditis siktens påverkan på reproduktion, växa ålder-synkron N2 djur till dag 2 i vuxen ålder vid 25 ° C.
- 60 h efter ägg lekmanna, överföra djur till nya NGM plattor med antingen en platina plocka eller Caenorhabditis sikten och ge dem 4 h återställa (torr Söll plattorna för 20 – 30 min).
- Efter återhämtning, individuellt plattan djuren via en ögonfrans plocka till NGM plattor, ge dem 24 h att lägga ägg och ta bort djuren. Tillåta avkomman på varje platta att utveckla under normala förhållanden vid 25 ° C för en annan 24 h.
Obs: En ögonfrans plockning är en mänsklig ögonfrans säkrade till slutet av en Pasteur-pipett med nagellack och steriliseras med etanol. - Räkna antalet livskraftiga F1 generationen individer. En statistisk analys med ett T-test med α = 0,05.
Obs: Livskraftig avkomma anses vara ägg som framgångsrikt kläcks och påbörja sin utveckling genom de regelbundna larval cyklerna.
- Fluorescerande reporter stress svar analyser
- Utföra tre vanliga lysrör reporter analyser för att upptäcka potentiella markörer av stress: en DAF-16::GFP flyttning till atomkärnor av celler i en stam [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; en hsp-16,2 uttrycket [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; och en sod-3 uttrycket [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.
- För varje analys, kultur ålder-synkron djur från de tre behandlingsgrupperna vid 20 ° C och granska dem på dag 3 av vuxenlivet: Använd en negativ kontroll (på en daglig basis, överföra en grupp djur manuellt med ett platina plocka), en positiv kontroll (på en daglig basis överföra en grupp djur manuellt med en platina plocka plus en etablerad stressfaktor), och Caenorhabditis sikten (passera djuren genom sikten och tillåta dem att återhämta sig i 30 min på NGM strax före imaging).
- I DAF-16::GFP-analysen, värme chock positiv kontroll djuren vid 37 ° C i 30 min innan imaging20. För hsp-16,2 analysen, värme chock positiv kontroll djuren för 90 min, 20 h innan imaging21. För sod-3 analysen, behandla de positiva kontrolldjur med 100 mM parakvat i 4 h innan imaging22.
- Skörda maskar omedelbart med en ögonfrans plockning och montera dem på ett täckglas med 1 μL av en 36% poloxamer 407 tensiden lösning att immobilisera maskar.
- Sandwich monterade maskar med en annan täckglas. Montera de två coverslips till en vanlig glasskiva mikroskopi och bild maskar med en 8 X förstoring på en inverterad fluorescerande Mikroskop (för en övergripande förstoring 80 X) och en konstant exponering med en FITC-filter.
- För att identifiera eventuella skillnader mellan de tre grupperna i DAF-16::GFP-analysen, kategorisera djuren baserat på platsen för DAF-16::GFP reporter (kärnkraft om reportern flyttad till kärnor, cytosoliska om reportern ligger i cytosol, och mellanliggande om reportern ligger i både kärnor och cytosolen).
- Jämföra resultaten med ett ordningstal logistik statistisk modell i statistisk analysprogramvara. För det hsp-16.2 och sod-3 uttryck analyserna, använder en envägs ANOVA med α = 0,05 och Tukey's post hoc tester med α = 0,05 för att jämföra den totala fluorescensen i regionen huvud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Caenorhabditis sikten består av 2 skruvlock, säkra ett område av vävd nylon monofilament maskstorlek mindre än kroppen diametern på önskad utvecklande år, används för att extrahera levande populationer av organismer med en enkel tvätt-teknik. Den fäster till standard koniska rör och använder skärmen mesh mekaniskt sortera djur efter Diameter verktygskropp, lämnar önskad djuren i röret redo för ytterligare underhåll och experiment (t.ex., överföring eller genetiska skörd). En skonsam manuell tvättning med Caenorhabditis sikten är snabb, ca 5 min per 60 – 100 mm platta och organismerna återställs enkelt från mesh.
Procentuella avkastning av djur efter Caenorhabditis Sieve använda
För att fastställa den procentuella avkastningen av Caenorhabditis sikten, testades enheter med både 20 μm och 50 μm porstorlek maskor på vuxna djur. A menar avkastning av en > 90% lyckade djur överföring uppnåddes för båda maskstorlekar som testade (tabell 1).
Monofilament mesh med olika storlek luckor kan användas för att separera djur av olika livsstadier. Mesh med 20 μm luckor är lämpligt för att tvätta bort utveckla embryon och larval arrangerar mindre än den fjärde larvstadium, behålla den senare (L4, med en genomsnittlig diameter Verktygskropp 32 μm) och några djur i senare stadier, medan mesh med 50 μm luckor kommer att tillåta alla andra liv arrangerar bortsett från vuxna (med en genomsnittlig diameter Verktygskropp 70 μm) tvättas bort (tabell 2).
Caenorhabditis Sieve användning påverkar inte healthspan mätvärden
Motilitet: I C. elegans normala sinusformad rörelsen (dvs, motilitet) avtar med ålder18 och är en markör för övergripande hälsa. För att avgöra om Caenorhabditis sikten påverkas motilitet, motilitet betyg var jämfört för plockning, FUDR och Caenorhabditis Sieve behandlingsgrupperna dagar 2, 4, 6 och 8 i vuxen ålder. Alla djur över varje grupp (n = 10/grupp) uppvisade normala och spontan rörelsemönster (klass A) i flera åldrar under hela vuxenlivet (dagar 2, 4, 6 och 8 i vuxen ålder; p > 0,05 för multipla jämförelser på alla dagar, figur 3).
Faryngala pumphastigheten: C. elegans' pharyngeal musklerna förmåga att pumpa minskar med åldern och är en annan biomarkör healthspan23. För att avgöra om Caenorhabditis sikten påverkas djurens faryngala pumphastigheten, plocka, FUDR och Caenorhabditis Sieve behandlingsgrupperna jämfördes på dagar 2, 4, 6 och 8 i vuxen ålder (n = 8 till 10 per grupp). Det fanns en signifikant skillnad mellan djur som genomgick plockning och FUDR metoder på dagar 6 (p < 0,001) och 8 (p < 0,001). Dessutom fanns det en betydande skillnad mellan sil och FUDR grupper på dagar 6 (p < 0,001) och dag 8 i vuxen ålder (p < 0,001). Men det var ingen statistiskt signifikant skillnad mellan plocka och Caenorhabditis Sieve grupper för någon dag (p > 0,05, figur 4), vilket indikerar att sikten inte påverkar denna åtgärd av healthspan.
Gentle touch svar: Svar på mekanisk stimulering är en fysiologisk markör att bedöma åldrande eller allmänna hälsa24,25; Därför testades effekterna av olika överföringsmetoder på både den främre och bakre lätt beröring svaren. Fanns ingen statistiskt signifikant skillnad mellan de plocka och FUDR Caenorhabditis sikten behandlingsgrupperna (n = 8/grupp), antingen anteriorly eller baktill, för någon dag av testning (p > 0,4 för alla jämförelser; Figur 5A och 5B).
Fruktsamhet: För att fastställa huruvida Caenorhabditis sikten påverkat mängden livskraftig avkomma produceras av C. elegans, den individuella avkommor som har producerats i en 24 h period under dag 3 av vuxenlivet var räknade och jämfört (n = 20-22 per grupp). Användning av Caenorhabditis sikten påverkade inte signifikant antalet avkommor som produceras när jämfört med ett plocka gruppen (p = 0,61, figur 6).
Molekylär reporter analyser
DAF-16 translokationen i cellkärnan: I C. elegansär aktivering av Transkriptionfaktorn DAF-16 associerade med ökad stress motstånd26. Cellkärnelokalisering DAF-16 undersöktes i en transgena nematoder stam TJ356, som uttrycker DAF-16 smält till ett grönt fluorescerande protein (DAF-16::GFP)20. Under normala odlingsbetingelser, DAF-16::GFP är lokaliserade främst i cytosolen, men under olika stressorer (t.ex., värmestress), är det snabbt flyttad in i nucleus20. För att testa effekterna av sortering med Caenorhabditis sikten på DAF-16 translokation, DAF-16::GFP lokaliseringar jämfördes hos åldersmatchade dag-5 vuxna i en positiv kontrollgrupp (värmestress), en negativ kontrollgrupp (manuell överföring via plockning), och en Caenorhabditis Sieve behandlingsgrupperna (n = 10/grupp). Överföringen med Caenorhabditis sikten påverkade inte den nukleära flyttning av DAF-16::GFP, och visade en liknande fenotyp till de negativa kontrolldjur (p > 0,05, figur 7).
HSP-16,2 reporter: små värma chockar proteiner som HSP-16,2 är biomarkörer för en stressreaktion, och de uttrycks mycket under en exponering för värme chock eller oxidativ stress agenter21,27. Den TJ375 stammen har en god Jordbrukarsed reporter gen smält med en hsp-16,2-arrangören som inte är aktivt under normala förhållanden21. Men efter en exponering mot en värme chock, HSP-16,2 proteinuttryck induceras och djuren uppvisar höga nivåer av GFP uttryck21. Att testa medverkan av Caenorhabditis sikten på en HSP-16,2-medierad stressreaktion, fluorescens tätheten i regionen svalget (n = 10 djur/grupp) av åldersmatchade djur jämfördes i dag-5 vuxna mellan en positiv kontrollgrupp (värme stress), en negativ kontroll (plockning), och gruppen en Caenorhabditis sikten. Överföringen med Caenorhabditis sikten inducerade inte avsevärt uttrycket av HSP-16.2::GFP (hsp-16.2::gfp) jämfört med den negativa kontrollen (p > 0,05, figur 8).
SOD-3 reporter: I C. elegans, antioxidant genen som kodar för superoxiddismutas (SOD-3) 3 är uppreglerat under oxidativ stress28. C. elegans stammen CF1553 uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt SOD-3 promotorn, vars uttryck framkallas av oxidativa stressfaktorer, till exempel parakvat5. För att testa medverkan av Caenorhabditis Sieve sorteringen av antioxidant svaret i C. elegans, jämfördes fluorescens tätheten i regionen huvud av åldersmatchade dag-5 vuxna mellan en positiv kontroll befolkning (100 μM parakvat behandling), en negativ kontroll befolkning (manuell plockning), och en Caenorhabditis Sieve-överförs befolkningen. Överföringen med Caenorhabditis sikten inducerade inte avsevärt uttrycket av sod-3::gfp jämfört med den negativa kontrollen (p > 0,05, figur 9).
Figur 1: Caenorhabditis Sieve konstruktion. Progressionen av 'själv' tillverkning av verktyget visas. Dessa paneler Visa (A) två 50 mL koniska tube caps (B) vars centrerar har tagits bort, (C) skära kanter jämnas och (D - F) som är utrustade med monofilament mesh motsvarar önskad liv scenen av C. elegans (se protokoll för detaljer). (G) avslutade sikten visas också. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Steg för steg bild representation av Caenorhabditis Sieve användning. (A), sikten är redan våt med en droppe M9 lösning, och (B) passar ovanpå en 50 mL konisk tub. (C), 1 mL M9 lösning med maskar är pipetteras på ovansidan av sikten, (D) en 50 mL konisk tub är placerad ovanpå sikten med maskar som vetter mot insidan av röret, och (E) sikten med en nyligen bifogade övre röret är snabbt flippade o ver. (G) sikten sköljs med M9 bär önskad djuren till de nya 50 mL tub och maskar tillåts sedimentera självtryck till botten av röret. (H) maskar är pipetteras och släpps ut som vattendroppar på en färsk NGM-platta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Caenorhabditis Sieve påverkade inte motilitet i hela livslängd. Denna figur visar motilitet klass fördelningen av djur på dagar 2, 4, 6 och 8 i vuxenlivet för plockning, FUDR, och Caenorhabditis Sieve behandlingsgrupperna. Klass A djur flyttade normalt och spontant, klass B djur flyttade onormalt och kan ha krävt petade och klass C djur kunde inte flytta. Det fanns ingen skillnad mellan Caenorhabditis sikten, plocka och FUDR grupper (p > 0,05). Tre replikat (n = 10 djur per behandling platta) utfördes och analyseras med Ordinal logistic modell. klass B djur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Caenorhabditis Sieve användning inte inverkade faryngala pumpning under hela livslängden. Denna figur visar faryngala pump andelen plocka, FUDR, och Caenorhabditis Sieve behandlingsgrupperna jämfört dagar 2, 4, 6 och 8 i vuxen ålder. Asteriskerna beteckna en signifikans mellan plockningen, sikten och FUDR behandlingsgrupperna för dagar anges (*** p < 0,05). Det fanns ingen skillnad mellan Caenorhabditis sikten och plocka gruppen (p > 0,05). Två replikat (N = 10 djur per behandling platta) utfördes och analyseras med en envägs ANOVA och en Bonferroni efter provningen. Staplarna representerar den genomsnittliga ± standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Caenorhabditis Sieve användning inte inverkade främre anslagskänslighet under hela livslängden. Dessa paneler visar (A) den främre och (B), bakre touch svar greven av plockning, FUDR och Caenorhabditis Sieve behandlingsgrupperna jämfört dagar 2, 4, 6 och 8 i vuxen ålder. Två replikat genomfördes med N = 10 för varje behandlingsgrupp och jämfört med en envägs ANOVA och en Bonferroni post-test (p = 0,4 och p = 0,9 för främre och bakre, respektive). Staplarna representerar den genomsnittliga ± standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Caenorhabditis Sieve påverkade inte mängden livskraftig avkomma på dag 3 av vuxenlivet. Denna figur visar är livskraftig avkomma av dag-3 vuxna efter en 24 h äggläggningen, spanning dag 3 av vuxenlivet för föräldradjuren. Staplarna representerar den genomsnittliga ± standardavvikelsen för medelvärdet. N = 20-22 djur från minst två separata biologiska replikat per behandlingsgrupp. Behandlingsgrupperna jämförs med ett t-test, (p > 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Caenorhabditis Sieve påverkade inte translokationen i cellkärnan av DAF-16::GFP. Dessa paneler visar representativa bilder av på DAF-16 flyttning av (A) en värme chock (positiv kontroll), (B) en pick-gruppen (negativ kontroll), och gruppen (C) en Caenorhabditis sikten. (D) djur i gruppen positiva kontrollen visas en aktivering av de DAF-16 translokationen i cellkärnan. Caenorhabditis sikten inducerade inte en translokationen i cellkärnan och visas cytosoliska fusionsprotein liknar av djuren i gruppen negativ kontroll. N = 10 djur per behandlingsgrupp från minst tre separata biologiska replikat. Behandlingsgrupperna var jämfört med en envägs ANOVA och en Tukey's post hoc test. Skalstapeln = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Caenorhabditis Sieve påverkade inte uttrycket av hsp16.2::gfp. HSP-16,2 uttryck (i godtyckliga fluorescens enheter) av en värme chock och gruppen som (positiv kontroll), en pick grupp (negativ kontroll), en Caenorhabditis Sieve jämförs. Asteriskerna beteckna ett högt uttryck av hsp16.2::gfp för gruppen positiva kontroll som var väsentligt annorlunda från de andra behandlingsgrupperna (*** p < 0,05). Caenorhabditis sikten inte påverkade uttrycket hsp16.2::gfp och visas fluorescens stödnivåer liknar djur i den negativa kontrollgruppen (p > 0,05). Tre replikat genomfördes med N = 10 för varje behandlingsgrupp och jämfört med en envägs ANOVA och en Tukey's post hoc test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Caenorhabditis Sieve påverkade inte uttrycket av sod-3::gfp. SOD-3 uttryck (i godtyckliga fluorescens enheter) av en 100 μM parakvat grupp (positiv kontroll), en pick grupp (negativ kontroll) och en Caenorhabditis Sieve behandlingsgrupp visas. Asteriskerna beteckna ett högt uttryck av sod-3::gfp för gruppen positiva kontroll som var väsentligt annorlunda från de andra grupperna (*** p < 0,05). Caenorhabditis sikten inte påverkade uttrycket sod-3::gfp och visas fluorescens stödnivåer liknar djuren i den negativa kontrollgruppen (p > 0,05). Tre replikat genomfördes med N = 10 för varje behandlingsgrupp och jämfört med en envägs ANOVA och en Tukey's post hoc test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Maskstorlek | N = 50 | N = 100 |
| 20 μm | 95.33% | |
| 50 μm | 99,00% | 93.33% |
Tabell 1: procentuell avkastning av maskstorlekar. Den här tabellen visar resultaten av en 20 μm enhet testas med N = 50 vuxna för 3 replikat och en 50 μm enhet testas med N = 50 vuxna för 2 replikat och med N = 100 för 3 replikat.
| Maskstorlek | Utvecklingsstadier | Diameter verktygskropp |
| 20 μm | Larvstadium 4 | ~ 35 μm |
| 50 μm | Dag 1 vuxen | ~ 70 μm |
Tabell 2: genomsnittlig diameter Verktygskropp. Den här tabellen visar Genomsnittligt diameter förvärvats av genomsnitt 3 mätningar lika spridda över varje mask för 15 djur på varje uppmätt levnadsstadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi introducerade häri, utformning och användning av den tillgängliga, effektiva Caenorhabditis sikten som ett verktyg för sortering och upprätthålla C. elegans. Detta verktyg har flera fördelar med att manuellt plocka enskilda djur, tvätta populationer, kemiska behandlingar (t.ex., FUDR) och dyrare metoder av segregerande djur. Först, den Caenorhabditis sikten effektivt och snabbt (mindre än 20 min) sorterar avkomma från stora blandade populationer av djur (tabell 2). Även användningen av verktyget har inga detekterbara toxiska effekter på djurens healthspan (figur 3, bild 4, bild 5, figur 6), inducerar inte väl beskrivna genetiska stress reportrar (figur 7, figur 8 Figur 9), och minskar mängden utländska kemikalie som skulle kunna påverka tillämpad behandling till kultur plattorna eller någon molekylär analys därefter. Dess användarvänlighet är en betydande fördel; forskare vid något skede i sin utbildning kan tränas till att använda det (figur 1 och figur 2. Protokoll).
Det material som krävs för tillverkning och användning av sikten (t.ex., pipetter, buffertar) är lätt tillgängliga i standard forskningslaboratorier; Således, om trasiga, Caenorhabditis sikten är inte dyra att ersätta eller reparera. Egentillverkade beskaffenhet Caenorhabditis sikten tillåter det är ett mångsidigt verktyg: det kan konstrueras med maskstorlekar som är lämpliga för olika C. elegans utvecklingsstadier och fenotyper. Caenorhabditis sikten kan också användas i analyser som utförts i andra nematoder arter eller när isolera små organismer, under förutsättning av lämplig maskstorlek används vid tillverkning.
Förutom fördelarna ger detta verktyg för C. elegans befolkningen underhåll, sikten kan användas för att rengöra djur före deras användning i andra experimentella program. Till exempel, med utvecklingen av mikrofluidik att genomföra C. elegans kommer forskning frågan om chip användning och rengöring. Beroende på mängden bakterier som bifogas djuren, måste särskilda försiktighetsåtgärder vidtas så att inte täppa mikroflödessystem chip, gör den obrukbar29. Ofta när C. elegans överförs till en mikroflödessystem chip, är rester från bakteriell gräsmattan förde med sig. Denna rest kan och täpper mikroflödessystem kanalerna, chip felfunktion som sedan kräver rengöring eller utbyte. Den enhet construct i detta protokoll erbjuder en metod för att inte bara skörda synkroniserade djur för mikrofluidik, men också för rengöring djuren före deras införande i en mikroflödessystem enhet. Genom att ta bort skräp och bakteriell rester, tas upp när samla djur, är ultrakalla kanaler mindre benägna fel, vilket ökar den operativa livslängden enskilda marker och efterföljande genomströmning av forskning som bedrivs med dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja. Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av några kommersiella eller finansiella relationer som kunde tolkas som en potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Heather Currey för hennes första bidrag till studiedesign och Dr Swarup Mitra för hans kritiska granskning av manuskriptet. Vi vill också tacka Dr Michael B. Harris för kommentarer, finesser och hjälp producera demonstration av denna metod. Stammarna tillhandahölls av stadens Caenorhabditis genetik, som är finansierad av NIH kontor infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440). Den forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Institute Of General Medical Sciences av det nationella Institutes of Health Award nummer UL1GM118991, TL4GM118992 eller RL5GM118990 och av en institutionell utveckling Award (IDeA) från Nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper av det nationella Institutes of Health under grant number 5P20GM103395-15. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health. UA är AA/EO arbetsgivare och läroanstalt och förbjuder olaglig diskriminering mot någon individ: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
References
- C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
- Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).
- Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
- Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
- Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
- Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
- Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
- Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
- Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).
- Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
- Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
