Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

التضخيم من القرب من كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس للجيل التالي التسلسل

Published: October 16, 2018 doi: 10.3791/58016
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Virus Research, The Westmead Institute for Medical Research, University of Sydney

Summary

كامل طول التسلسل بروفيرال الفردية (تقلب) يوفر طريقة فعالة والفائق للتضخيم وتسلسل واحد، قرب كامل طول بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 (سليمة ومعيبة) ويسمح لتحديد قدراتهم النسخ المتماثل-الكفاءات. تقلب ويتغلب على القيود المفروضة على الاختبارات السابقة الرامية إلى تسلسل الخزان فيروس نقص المناعة البشرية-1 الكامنة.

Abstract

فحص كامل المدة الفردية بروفيرال التسلسل (تقلب) أسلوب كفاءة والفائق تهدف إلى تضخيم وتسلسل واحد، قرب بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 (سليمة ومعيبة)، كامل طول. تقلب يسمح تحديد التركيب الجيني المتكاملة فيروس نقص المناعة البشرية-1 ضمن عدد سكان خلية. من خلال تحديد العيوب ضمن تسلسل بروفيرال فيروس نقص المناعة البشرية-1 التي تنشأ أثناء النسخ العكسي، مثل الحذف الداخلية الكبيرة، توقف ضارة codons/هايبرموتيشن والطفرات فراميشيفت والطفرات/الحذف في رابطة الدول المستقلة بالعناصر المطلوبة لانضاج virion، يمكن تحديد تقلب بروفيروسيس متكامل قادر على النسخ المتماثل. يمكن أن تستخدم مقايسة تقلب التعرف على فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس التي تفتقر إلى هذه العيوب ومن ثم يحتمل أن تكون مختصة في النسخ المتماثل. ينطوي البروتوكول تقلب: تحلل خلايا المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية-1، متداخلة بكر من القرب من كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس (استخدام كبسولة تفجير يستهدف 5 فيروس نقص المناعة البشرية-1 'و 3' لتر)، تنقية الحمض النووي، والتقدير الكمي، إعداد المكتبة للجيل التالي التسلسل (خ ع)، خ ع، الجمعية دي نوفو كونتيجس بروفيرال، وعملية بسيطة للقضاء لتحديد بروفيروسيس النسخ المتماثل المختصة. تقلب يوفر مزايا أكثر من الأساليب التقليدية مصممة لتسلسل المتكاملة بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1، مثل تسلسل واحد بروفيرال. تقلب يسهب وتسلسل قرب بروفيروسيس كامل طول تمكين الكفاءات النسخ المتماثل يتم تحديد، ويستخدم أيضا أقل التضخيم الإشعال، منع عواقب عدم التطابق التمهيدي. تقلب أداة مفيدة لفهم المشهد الوراثية من بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 المتكاملة، لا سيما داخل الخزان الكامنة، ومع ذلك، يمكنك توسيع الانتفاع بها لأي تطبيق مطلوب التركيب الجيني لفيروس نقص المناعة البشرية-1 المتكاملة التي.

Introduction

التوصيف الوراثي لفيروس نقص المناعة البشرية-1 الخزان الكامنة، التي استمرت في الأفراد على المدى الطويل العلاج المضاد للفيروسات (الفن)، كانت حيوية لفهم أن أغلبية بروفيروسيس المتكاملة هي معيبة وغير كفء النسخ المتماثل1 , 2-خلال عملية النسخ العكسي، يتم عرض الأخطاء ضمن تسلسل بروفيرال المتكاملة. وتشمل بعض آليات توليد متواليات بروفيرال المعيبة عرضه للخطأ إنزيم المنتسخة العكسية فيروس نقص المناعة البشرية-13، القالب التبديل بين4و/أو5،هايبرموتيشن التي يسببها أبوبيك6. وقد وجدت الدراسات الأخيرة اثنين أن حوالي 5 في المائة من فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس المعزولة من الأفراد على المدى الطويل الفن سليمة وراثيا، ويحتمل أن تكون مختصة في النسخ المتماثل، وقد تساهم في انتعاش سريع في مستويات البلازما فيروس نقص المناعة البشرية-1 عند وقف أعمال الفن 1 , 2 , 7-وحددت الدراسات السابقة أن بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 النسخ المتماثل المختصة مستمرة في السذاجة ويستريح الذاكرة CD4+ تي الخلية مجموعات فرعية (بما في ذلك خلايا الذاكرة تي المستجيب والمركزية والانتقالية)، مما يشير إلى الأهمية استهداف هذه الخلايا في المستقبل القضاء على استراتيجيات2،،من89.

وتحققت أوائل ثاقبة التوزيع، وديناميات وصيانة خزان فيروس نقص المناعة البشرية-1 الكامنة من خلال استخدام أساليب تسلسل واحد بروفيرال (SPS) التي تميز المناطق الفرعية الجينوم جينوم فيروس نقص المناعة البشرية-110 وراثيا ،11،،من1213. الصحة والصحة النباتية أداة مرنة، قادرة على تسلسل بروفيروس فيروس نقص المناعة البشرية-1 واحد من داخل خلية مصابة واحدة. الصحة والصحة النباتية غير قادر على تحديد النسخ المتماثل-الكفاءات بروفيروسيس، حيث أنها تتابع فقط بروفيروسيس المناطق ويفتقد الجينومية الفرعية التي تحتوي على عمليات الحذف كبيرة داخل مواقع الربط التمهيدي. دراسة سابقة أظهرت أن الحزب الاشتراكي يغالي حجم الخزان النسخ المتماثل المختصة ب 13-إلى 17-أمثال من خلال تسلسل المناطق الفرعية الجينوم سليمة2بشكل انتقائي.

لمعالجة أوجه القصور في الصحة والصحة النباتية، هو وآخرون 4 وبرونر et al. 1 طور معبراً لتسلسل قرب كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس. هذا يسمح بتواتر بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 سليمة وراثيا، ويحتمل أن تكون النسخ المتماثل-المختصة، في الأفراد على المدى الطويل الفن يتحدد. تفصيل هذه الاختبارات والتسلسل (عبر سانغر التسلسل) المناطق الفرعية الجينوم التي تم تجميعها ثم الحصول على بروفيروس فيروس نقص المناعة البشرية-1 تسلسل (سليمة أو المعيبة). القيود الثلاثة لهذا النهج: 1) استخدام متعددة يسلسل الإشعال يزيد من خطر عن غير قصد إدخال العيوب في التسلسل بروفيرال، وقد منع عدم التطابق 2) التمهيدي التضخيم من بروفيروسيس خاصة، و 3) غالباً ما تسلسل بروفيرال بأكمله لا يمكن حلها بسبب تقنية من هذه الأساليب.

للتغلب على القيود المفروضة على فيروس نقص المناعة البشرية-1 موجود كامل طول التسلسل بروفيرال فحوصات، قمنا بتطوير وull-Lانجث أنانديفيدوال فروفيرال Sاكوينسينج (تقلب) المقايسة. تقلب الجيل التالي تسلسل (خ ع)-استناداً إلى التحليل الذي يسهب وتسلسل قرب كامل طول بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 (سليمة أو المعيبة) بطريقة عالية الإنتاجية والكفاءة. تقلب يوفر مزايا أكثر من الاختبارات السابقة، كما أنه يحد من عدد أجهزة الإشعال المستخدمة؛ ولذلك، فإنه يقلل فرصة للتمهيدي عدم التطابق، التي قد تحد من سكان بروفيروسيس القبض عليه أو عن غير قصد إدخال العيوب في تسلسل فيروسية. تقلب هو أيضا صعوبة أقل من الناحية الفنية من الاختبارات السابقة وتشمل الخطوات الرئيسية 6: 1) تحلل للمصابين بفيروس نقص المناعة البشرية-1 الخلايا، 2) التضخيم بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 واحدة عن طريق PCR المتداخلة في الحد من التخفيف باستخدام كبسولة تفجير محددة للغاية المصانة HIV-1 5 '3' منطقة U5 لتر (الشكل 1A)، 3 و) تنقية والتحديد الكمي لتضخيم المنتجات، 4) إعداد المكتبة لتضخيم بروفيروسيس خ ع، 5) خ ع، و 6) الجمعية حيثياته من بروفيروسيس متسلسل للحصول على كونتيجس لكل بروفيروس الفردية.

تسلسلات الناجمة عن تقلب يمكن الخضوع لعملية صارمة للقضاء تحديد تلك التي تكون سليمة وراثيا، ويحتمل أن تكون مختصة في النسخ المتماثل (الشكل 1)2. بروفيروسيس سليمة وراثيا تفتقر إلى كل العيوب المعروفة التي تسفر عن توليد بروفيروس غير كفء النسخ المتماثل. وتشمل هذه العيوب: تسلسل انعكاس أو الحذف الداخلية الكبيرة، codons stop هايبرموتيشن/ضارة، فراميشيفتس أو الطفرات 5 ' التعبئة والتغليف رئيسي أو إشارة لصق موقع المانحين (MSD).

Figure 1
رقم 1: الخطوات الحاسمة في فحص كامل طول التسلسل بروفيرال الفردية (تقلب). (أ) فيروس نقص المناعة البشرية-1 "الحمض النووي" الجينوم مع مواقع الربط التمهيدي في 5 '3' U5 لتر في منطقتي يستخدمها تقلب إلى تضخيم قرب كامل طول بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 (المعيبة وسليمة) عن طريق PCR متداخلة. (ب) تخطيط لوحة بكر 96-جيدا يحتوي على 80 عينة الآبار (آبار 20 لكل تمييع)، 4 آبار المراقبة السلبية، ومراقبة إيجابية 1 جيدا. (ج) عملية الإزالة المستخدمة لتحديد سليمة وراثيا، ويحتمل أن تكون النسخ المتماثل-المختصة، فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس. وقد تم تعديل هذا الرقم من هينر et al. 2 . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Protocol

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها مجالس المراجعة المؤسساتية في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو وحي الصحة المحلية سيدني الغربية التي تضم معهد Westmead "الأبحاث الطبية".

1-تحلل الخلايا المصابة من فيروس نقص المناعة البشرية-1

ملاحظة: قد تكون الخلايا المعزولة من الدم المحيطي وعينات ليوكافيريسيس وخزعة نخاع العظم أو خزعة النسيج. قد يتم فرز السكان الخلية باستخدام خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية).

  1. إعداد تحلل المخزن مؤقت الذي يحتوي على 10 ملم تريس-HCl، 0.5% نونيديت ف–40، 0.5% توين-20، و 0.3 ملغ/مل بروتيناز ك. لبيليه خلية إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل كل 1 × 106 خلايا. "الماصة؛" صعودا ونزولاً المزيج. احتضان في 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة تليها 85 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة الخلايا والإفراج عن الحمض النووي للتضخيم PCR.
    ملاحظة: تحلل الخلية غير كافية للحصول على الحمض النووي للتضخيم. مطلوب لا عزل الحمض النووي أو تنقية. يمكن أن يكون مؤقتاً في البروتوكول في هذه المرحلة ويمكن تخزين الحمض النووي في-20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.

2. التضخيم بروفيروسيس واحد فيروس نقص المناعة البشرية-1 الحمض النووي عن طريق PCR متداخلة

  1. خلط المواد الكاشفة لبكر الجولة الأولى (PCR1) المدرجة في الجدول 1 (انظر الجدول للمواد). إضافة 38 ميليلتر من مزيج الرئيسي لآبار 85 (عينات 80، 4 عناصر سلبية، ومراقبة إيجابية 1) صفيحة بكر 96-جيدا (اتبع المخطط في الشكل 1B). تعين هذه اللوحة 'PCR1'.
كاشف التركيز النهائي حجم لوحة PCR1 (ميكروليتر) حجم لوحة PCR2 (ميكروليتر)
التمهيدي إلى الأمام 1 ميكرومتر 32.3 23.8
عكس التمهيدي 1 ميكرومتر 32.3 23.8
المخزن المؤقت (10 x) س 1 323 238
مجسو4 (50 مم) 2 مم 129.2 95.2
دنتب (10 مم) 0.2 مم 64.6 47.6
بوليميراز الدنا (يو 5/ميليلتر) U/ميليلتر 0.025 16.2 11.9
عالي النقاوة ح2س 2632.5 1939.7

الجدول 1: الكواشف ووحدات التخزين لبكر سيد يمزج.

ملاحظة: يتم الإشعال المستخدمة ل PCR1:
بلوتيرف: 5 '-آآتكتكتاجكاجتجكجكككجاكاج-3' (HXB2 موضع 623-649)
بلوتير: 5 '-تجاججاتكتكتاجتاككاجاجتك-3' (موقف HXB2 9662-9686)

  1. وبعد إعداد مزيج الرئيسي، نقل لوحة PCR1 إلى منطقة نظيفة مخصص لإضافة الحمض النووي.
    1. تمييع متسلسل الحمض النووي من 1:3 إلى 1:81 مع تريس-HCl (5 ملم، ودرجة الحموضة 8)، إعداد ميليلتر 45 لكل تمييع (ما يكفي لآبار 20 لكل تمييع). إضافة 2 ميليلتر من الحمض النووي المخفف لكل عينة جيدا و 2 ميليلتر من تريس-HCl (5 ملم، ودرجة الحموضة 8) لكل عنصر سلبي جيدا (اتبع المخطط في الشكل 1B). ختم كل مراقبة آبار لوحة PCR1، باستثناء الإيجابية أيضا، باستخدام ختم واضح لاصقة (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: تخفيف الموصى به أعلاه بمثابة فقط بداية دليل لتحديد نقطة النهاية التخفيف. تخفيف سيتوقف على تركيز "الحمض النووي" فيروس نقص المناعة البشرية-1 المتكاملة داخل العينات.
  2. الانتقال إلى منطقة مخصصة لإضافة عنصر التحكم الإيجابي. إضافة 2 ميليلتر من السيطرة الإيجابية (pNL4-3 المخفف إلى 105 نسخة/ميليلتر) لمراقبة إيجابية أيضا من لوحة PCR1 وختم اللوحة. تدور باختصار لوحة PCR1 في غزل لوحة بكر أو الطرد المركزي (400 x ز ل 10 ثانية في درجة حرارة الغرفة) لهدم أي من المحتويات المتبقية من الجانبين من الآبار.
  3. تشغيل لوحة PCR1 في ثيرموسيكلير: 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ ثم 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 64 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لدورات 3؛ 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 61 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لدورات 3؛ 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لدورات 3؛ 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لدورات 21؛ ثم 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (المجموع 30 دورات). عقد في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا وإبقاء لوحة PCR1 عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 يوما.
  4. خلط المواد الكاشفة للجولة الثانية من بكر (PCR2) المدرجة في الجدول 1. إضافة ميليلتر 28 إلى آبار 85 (عينات 80، 4 عناصر سلبية، ومراقبة إيجابية 1) صفيحة بكر 96-بئر جديدة (اتبع المخطط في الشكل 1B). تعين هذه اللوحة 'PCR2'.

ملاحظة: يتم الإشعال المستخدمة ل PCR2:
275F:-أكاججاككتجااجكجااج 5 '-3' (HXB2 موضع 646-666)
280R:-كتاجتاككاجاجتكاكاكاكاجاكج 5 '-3' (HXB2 ضع 9650-9676)

  1. تدور باختصار لوحة PCR1 في غزل لوحة بكر أو الطرد المركزي (400 x ز ل 10 ثانية في درجة حرارة الغرفة) لهدم أي من المحتويات المتبقية من الجانبين من الآبار. إضافة ميليلتر 80 من HCl تريس (5 ملم، ودرجة الحموضة 8) لكل بئر من لوحة PCR1.
    1. نقل 2 ميليلتر من لوحة PCR1 إلى لوحة PCR2 استخدام ماصة متعددة القنوات. ضمان نقل العينات جيدا جيد (أي 2 ميليلتر من A1 PCR1 جيدا لنقل لوحة إلى لوحة A1 PCR2 جيدا). إغلاق لوحة PCR2 باستخدام ختم واضح لاصقة (انظر الجدول للمواد).
    2. تدور باختصار لوحة PCR2 في غزل لوحة بكر أو الطرد المركزي (400 x ز ل 10 ثانية في درجة حرارة الغرفة) لهدم أي من المحتويات المتبقية من الجانبين من الآبار. إغلاق لوحة PCR1 مع حرارة الختم الفيلم للتخزين على المدى الطويل في-20 درجة مئوية (انظر الجدول للمواد).
  2. تشغيل لوحة PCR2 في ثيرموسيكلير: 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ ثم 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 64 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لدورات 3؛ 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 61 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لدورات 3؛ 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لدورات 3؛ 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لدورات 31؛ ثم 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (مجموع 40 دورات). عقد في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا وإبقاء لوحة PCR2 عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 يوما.
  3. تدور باختصار لوحة PCR2 في غزل لوحة بكر أو الطرد المركزي لهدم أي من المحتويات المتبقية من الجانبين من الآبار. إضافة 60 ميليلتر من HCl تريس (5 ملم، ودرجة الحموضة 8) إلى كل جيدا باستخدام ماصة الأقنية.
    1. تشغيل 15 ميليلتر من كل بئر على 2 × 48-كذلك الخرسانة الجاهزة 1% [اغروس] المواد الهلامية التي تحتوي على اثيديوم بروميد (0.1\u20120.3 ميكروغرام/ملليلتر، انظر الجدول للمواد). استخدام سلم مع مجموعة تصل إلى 10 كيلو بايت (انظر الجدول للمواد). وضع تصور لتحديد الآبار المحتوية على المنتج تضخيم وأحجامها التقريبي. حفظ صورة جل.
      ملاحظة: تأكد من مراقبة إيجابية كذلك يحتوي على منتج تضخيم. إذا كانت تحتوي آبار المراقبة السلبية على تضخيم المنتج، النظر في التلوث وتجاهل لوحة.
  4. تحديد التخفيف الذي لا يزيد عن 30% آبار إيجابية لتضخيم المنتج.
    ملاحظة: هذا هو تمييع نقطة النهاية التي تحتوي أغلبية (80 ٪) من الآبار على تضخيم المنتج من قالب واحد. ينبغي إعداد هذا التخفيف والمستخدمة في تقارير إتمام المشروعات اللاحقة للحصول على مزيد من أمبليكونس بروفيرال. سجل الحجم التقريبي لكل منتج تضخيم.

3-الحمض النووي تنقية والتقدير الكمي

  1. تدور باختصار لوحة PCR2 في غزل لوحة بكر أو الطرد المركزي لهدم أي من المحتويات المتبقية من الجانبين من الآبار. نقل 40 ميليلتر من الآبار التي تحتوي على تضخيم المنتج (أو أقل تمييع نقطة النهاية) إلى لوحة ميدي 96-بئر جديدة (بحجم 0.8 مل جيدا، انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: قم بتدوين الأصلي والجديد تماما موقف كل منتج تضخيم في جدول بيانات كسجل لكل منتج تضخيم تكون متسلسلة.
  2. تنقية تضخيم الحمض النووي المنتجات باستخدام تنقية PCR حبة مغناطيسي على أساس كيت (انظر الجدول للمواد) لإزالة كبسولة تفجير، النيوكليوتيدات والأنزيمات، والزيوت والأملاح. قبل البدء، إحضار الخرز المغناطيسية في درجة حرارة الغرفة وإعداد جديدة من الإيثانول 80%. استخدام تلميحات ماصة جديدة عند الاقتضاء لتجنب التلوث المتبادل لعينات من الحمض النووي.
    1. دوامة الخرز المغناطيسي التأكد من أنها هي حراكه جيدا. استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 40 ميليلتر من الخرز إلى ميليلتر 40 من تضخيم الناتج في لوحة ميدي 96-جيدا 0.8 مل. بلطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً 10 مرات لخلط. وبدلاً من ذلك، مزيج من الحل بختم اللوحة ثم تهز على شاكر ميكروسكوبية 1,800 لفة في الدقيقة للحد الأدنى 2 إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    2. مكان لوحة على المغناطيسي الوقوف (انظر الجدول للمواد) لإزالة 2 كحد أدنى، وتجاهل طافية.
    3. أغسل حبات بإضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80% لكل بئر مع لوحة على الوقوف. احتضان في درجة حرارة الغرفة لإزالة س. 30 وتجاهل المادة طافية. كرر مرة واحدة. استخدام ماصة متعددة القنوات مع نصائح الجميلة، إزالة أي الإيثانول الزائدة بعد الغسيل الثاني. مع لوحة على الوقوف، تسمح الخرز للهواء الجاف لمدة 15 دقيقة.
    4. قم بإزالة اللوحة من الموقف. إضافة 30 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد) لكل بئر. بلطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً 10 مرات لخلط. وبدلاً من ذلك، مزيج من الحل بختم اللوحة ثم تهز على شاكر ميكروسكوبية 1,800 لفة في الدقيقة للحد الأدنى 2 إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    5. وضع اللوحة على موقف مغناطيسي من أجل 2 دقيقة ماصة متعددة باستخدام، ونقل 25 ميليلتر من المادة طافية (تنقية الحمض النووي) إلى لوحة بكر 96-بئر جديدة. ضمان نقل العينات-بئر (أي المادة طافية من A1 جيدا في لوحة 0.8 مل منقولا إلى A1 جيدا من لوحة 96-بئر جديدة).
      ملاحظة: 5 ماي عينة التيد تركت وراءها لضمان عدم نقل أي الخرز تنقية المتبقية.
  3. تحديد وتسجيل تركيز التقريبي لكل تضخيم الحمض النووي المنتج بعد التنقية باستخدام جهاز المطياف الضوئي (امتصاص في موجه 260 nm).
    ملاحظة: قياس تركيز التقريبي لكل منتج تضخيم ضروري في هذه المرحلة لضمان لا عينات يتم فقدان أثناء خطوات تنقية وأن تركيز التقريبي ضمن مجموعة المنحنى القياسي المستخدم في (المرحلة القادمة 0.001 – 1 نانوغرام/ميليلتر الحمض النووي في 100 ميليلتر من وحدة التخزين). يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا ويمكن تخزين العينات تنظيفها في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  4. قياس تركيز الحمض النووي لكل منتج المنقي باستخدام إجراء تقييم كمي دسدنا كيت (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: وهذا ينطوي على استخدام منحنى قياسي لتحديد تركيز دسدنا في عينة. وتشمل هذه المجموعة المخزن المؤقت (10 مم تريس-HCl، 1 مم يدتا، درجة الحموضة 7.5) ومعيار دسدنا الحشرات، وصبغة فلورسنت. إبقاء جميع الكواشف على الجليد. تغطية الأنبوب الذي يحتوي على صبغ مع إحباط لتجنب التعرض للضوء. قياس تركيز كل منتج تضخيم في ثلاث نسخ.
    1. المخزن المؤقت مخفف إلى س 1 في العقيمة الدناز مجاناً ح2"سين إضافة 99 ميليلتر من" المخزن المؤقت لعدد مناسب من الآبار فارغة (3 مرات عدد المنتجات تضخيم قياسه، انظر الجدول 2 لتخطيط بمثال) من لوحة مسطحة القاع زراعة الأنسجة. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت إلى 3 آبار فارغة.
    2. لكل منتج تضخيم تقاس، إضافة 1 ميليلتر لتنقية الحمض النووي (من الخطوة 3.2.5) في ثلاث نسخ لكل منها الذي يحتوي على المخزن المؤقت (انظر الجدول 2 لتخطيط بمثال).
    3. لإعداد المعايير، تمييع دسدنا الحشرات 10 إضعاف من 2 نانوغرام/ميليلتر إلى 0.002 نانوغرام/ميليلتر. إضافة 100 ميليلتر من كل دسدنا القياسية لآبار 3.
      ملاحظة: في أعقاب الخطوة 3.4.4، التركيز النهائي للمعايير سوف تتراوح من 1 إلى 0.001 نانوغرام/ميليلتر
    4. يضعف صبغة فلورسنت 1: 200 مع المخزن المؤقت. بسرعة إضافة 100 ميليلتر لكل منها أيضا يحتوي على عينة، والفراغات، والمعايير. يخلط صعودا وهبوطاً ماصة. وتغطي اللوحة بإحباط تجنب الاتصال مع الضوء.
    5. قراءة الأسفار الانبعاثات على قارئ ميكروسكوبية (الإثارة في 480 نانومتر، والانبعاثات في 520 nm). تسجيل النتائج في جدول بيانات.
    6. تحديد تركيز دسدنا في كل عينة باستخدام القياسات fluorescence المسجلة. طرح fluorescence تقاس في الآبار فارغة من عينة والمعايير. تحديد الأسفار متوسط لكل نموذج ومعيار من تريبليكاتيس. رسم منحنى قياسي استناداً إلى قياسات الأسفار من المعايير. تحديد تركيز العينات بالنسبة للمعايير.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A معيار (1 نانوغرام/ملليلتر) القياسي (0.1 نانوغرام/ملليلتر) مستوى (0.01 نانوغرام/ملليلتر) قياسي (0.001 نانوغرام/ملليلتر) فارغة
100 مل 100 مل 100 مل 100 مل المخزن المؤقت 100 مل
ب معيار (1 نانوغرام/ملليلتر) القياسي (0.1 نانوغرام/ملليلتر) مستوى (0.01 نانوغرام/ملليلتر) قياسي (0.001 نانوغرام/ملليلتر) فارغة
100 مل 100 مل 100 مل 100 مل المخزن المؤقت 100 مل
ج معيار (1 نانوغرام/ملليلتر) القياسي (0.1 نانوغرام/ملليلتر) مستوى (0.01 نانوغرام/ملليلتر) قياسي (0.001 نانوغرام/ملليلتر) فارغة
100 مل 100 مل 100 مل 100 مل المخزن المؤقت 100 مل
د نموذج 1: نموذج 2: نموذج 3: نموذج 4: نموذج 5: نموذج 6: نموذج 7: نموذج 8: نموذج 9: نموذج 10: نموذج 11: نموذج 12:
دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت
ه نموذج 1: نموذج 2: نموذج 3: نموذج 4: نموذج 5: نموذج 6: نموذج 7: نموذج 8: نموذج 9: نموذج 10: نموذج 11: نموذج 12:
دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت
و نموذج 1: نموذج 2: نموذج 3: نموذج 4: نموذج 5: نموذج 6: نموذج 7: نموذج 8: نموذج 9: نموذج 10: نموذج 11: نموذج 12:
دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت دنا مل 1 + مل 99 المخزن المؤقت
ز
ح

الجدول 2: مثال على تخطيط لوحة 96-جيدا للتحديد الكمي دسدنا.

  1. تمييع كل منتج المنقي (التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.2.5) مع ح2س إلى 0.2 نانوغرام/ميليلتر.

4-تسلسل إعداد المكتبة

  1. إعداد تضخيم وتنقية الحمض النووي بروفيرال خ ع استخدام إعداد مكتبة "خ ع الحمض النووي" مجموعة (انظر الجدول للمواد). اتبع إرشادات الشركة المصنعة لجميع تاجمينتيشن والتضخيم PCR خطوات تنظيف [إلا أن رد فعل وحدات التخزين بما في ذلك إدخال الحمض النووي (من الخطوة 3، 5) يمكن بمقدار النصف للتوسع في استخدام مكتبة إعداد الكواشف].
  2. تطبيع المكتبات يدوياً باستخدام مكتبة خ ع المستندة إلى qPCR كمي كيت (انظر الجدول للمواد) لتحديد تركيز بروفيروس الفردية. ضم مكتبات بروفيروس الفردية في المبالغ اكويمولار لتركيز نهائي من 4 نانومتر، أو كما هو محدد من موفر خدمة التسلسل.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا ومكتبة المجمعة المخزنة في-20 درجة مئوية.
  3. تحديد حجم المكتبة التجميعي النهائي باستخدام نفس مجموعة من أدوات القياس الكمي دسدنا المستخدمة في الخطوة 3، 4. اتبع إرشادات الشركة المصنعة. تحديد أطوال جزء متوسط عن طريق تشغيل 1 ميليلتر من مكتبة المجمعة على نظام التفريد مؤتمتة باستخدام مناسب كيت (انظر الجدول للمواد). استخدام تركيز وأطوال جزء متوسط لتحديد molarity مكتبة المجمعة.
  4. الجمع بين 5 ميليلتر من مكتبة المجمعة مع 5 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم N 0.2 تجريدها من المكتبة. إضافة 5 ميليلتر من 200 ملم تريس-HCl لتحييد. تمييع المكتبة النهائي إلى 12:05 م مع المخزن المؤقت التهجين المثلجة (متوفر مع مجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي) فورا قبل التسلسل.
  5. إجراء تسلسل نهاية الاقتران النوكليوتيدات (nt) 2 x 150 على منبر خ ع مناسب (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: عندما يتم فهرسة المكتبات بروفيرال 96 في تشغيل، وهذا غلة حوالي 20 مليون يقرأ نهاية الاقتران في تشغيل أو يقرأ 200,000 كل مكتبة بروفيروس الفردية لتحليل أثر إلغاء الإرسال المتعدد. عادة ما يتم تنفيذ الخطوات 4.4 و 4.5 بمنشأة لتسلسل.

5-الجمعية حيثياته من التعاقب فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس

ملاحظة: للحصول على التسلسل الجيني لكل بروفيروس تضخيم، كونتيجس يتم تجميعها حيثياته من يقرأ نهاية الاقتران. تسمح العديد من المنصات (مثلاً، "المسؤولية المدنية" علم الجينوم منضدة14)، تصميم مهام سير عمل مخصصة للجمعية حيثياته . يمكن أيضا الاستفادة من البرمجيات المفتوحة المصدر الأخرى مثل فاستقك15تريموماتيك16، كوتادابت17و فلاش18 لتجهيز ما يلي، فضلا عن أدوات مثل Bowtie219 و ورقة بنت البستوني20 لقراءة الخرائط و دي نوفو الجمعية العامة. الخطوات اللازمة للجمعية حيثياته لفيروس نقص المناعة البشرية-1 كونتيجس باستخدام منصة تجارية محددة (انظر الجدول للمواد) ترد أدناه (الشكل 2). يتوفر ملف تخصيص سير العمل عند الطلب.

  1. استيراد تسلسلات والتحقق من الجودة: استيراد تسلسل إقران يقرأ (في شكل fastq.gz) في البرنامج، الذي سيتم دمجها ثم كمجموعة واحدة من القراءات المزدوجة. إنشاء تسلسل تقرير مراقبة الجودة وفحص جودة البيانات الخاصة بك.
  2. مراقبة الجودة
    1. إجراء اقتطاع القراءة وفقا لتقرير مراقبة الجودة. إزالة أي تسلسل محول والنيوكليوتيدات غامضة. تقليم خمسة عشر 5 'وهما النيوكليوتيدات 3' المحطة الطرفية. تجاهل يقرأ النيوكليوتيدات أقل من 50 في الطول. استخدام حد جودة صارمة من 0.001 المقابلة لدرجة phred QC من 30.
  3. دمج أزواج المتداخلة
    1. شكل واحد الموسعة ما يلي: عن طريق دمج المقترنة إلى الأمام وعكس ما يلي مع المتداخلة المناطق.
  4. الجمعية دي نوفو
    1. استخدام المجمع حيثياته الجينوميات المسؤولية المدنية الأصلية بحجم كلمة (أو k-مير) من 30 nt وحجم فقاعة الحد أقصى من 65 nt لتجميع عينة فرعية عشوائية من يقرأ إقران 10,000 غير متداخلة. التغطية المتوقعة ل contig حيثياته تجميعها هو العاشر ~ 200 لتسلسل ~ 9 كيلو بايت.
      ملاحظة: هذا الاختزال يمكن تقليل عبء الحسابية مثل أنه يمكن التعامل مع أجهزة كمبيوتر سطح المكتب القياسية بالجمعية والتحليل، ونظرا كلوناليتي من كل بروفيروس (مكتبة واحدة بروفيروس واحد)، وهذا لا يحد من التنوع.
  5. إعادة تعيين كل القراءات إلى كونتيجس
    1. للحصول على تسلسل كل بروفيروس توافق أغلبية النهائي، وتعيين مجموعة قراءة كاملة حيثياته تجميعها contig. تقبل فقط كونتيجس مع تغطية 1,000 x متوسط الحد أدنى وضمان طول contig النهائي يتوافق مع حجم الفرقة في الأصل [اغروس] هلام (الخطوة 2.8.1). حفظ تسلسل توافق أغلبية النهائي كملف.fasta.
      ملاحظة: يمكن تجميع معظم كونتيجس باستخدام الخطوات المذكورة أعلاه. ومع ذلك، في بعض الحالات، بروفيروس واحد، يتم تجميعها كونتيجس متعددة مع تغطية مماثلة. وفي هذه الظروف، يتم محاذاة كونتيجس شبه كامل طول (~ 9 كيلو بايت) تسلسل توافق الآراء من نفس عدد المشتركين وتجميعها يدوياً إلى contig واحد. كل القراءات ثم تعيينها إلى contig تجميعها يدوياً وتوافق الآراء النهائية المقبولة إذا كانت التغطية القراءة حتى خلال الجمعية العامة ولا واحد النوكليوتيدات مجمع الأشكال المتعددة (بطانات) > 40% موجودة.
  6. المزيد من مراقبة الجودة
    1. لضمان كل contig يمثل بروفيروس واحد، وليس بسبب تضخيم بروفيروسيس متعددة داخل بئر واحدة، قراءة الشاشة التغطية واستدعاء متغير contig النهائية.
    2. قوالب بروفيرال متعددة حاضرين أثناء PCR غالباً ما تعرف بالتغطية اقرأ متفاوتة جداً (بسبب التضخيم المشارك من بروفيروسيس من مختلف الأحجام) عندما رسم الخرائط إلى توافق في آراء بكامل طول من المشارك نفسه، أو بسبب وجود بطانات مع تواتر > 40% (انظر النتائج التمثيلية، و الشكل 4). تجاهل السكان مختلطة في التحاليل اللاحقة.
  7. المحاذاة
    1. استيراد توافق نهائي في الآراء لكل تسلسل بروفيرال في تسلسل عرض البرامج مثل الجزيئية التطورية علم الوراثة التحليل (ميجا) 721. محاذاة كل تسلسل يدوياً إلى التسلسل المرجعي HXB2. تقليم 5 'و 3' ينتهي إلى مواقف 666-9650 HXB2 لإزالة تسلسل التمهيدي.
    2. تصدير قائمة التسلسل في تنسيق fasta ومحاذاة ثم استخدام الإصدار 7 مفت22، مع التحرير اليدوي للحصول على محاذاة النهائي حسب الاقتضاء.
      ملاحظة: إذا كان عدم محاذاة أي تسلسل، عكس الأول يكمل التسلسل. إذا كان التسلسل الذي لا يزال غير محاذاة إجراء بحث انفجار لضمان التسلسل هو فيروس نقص المناعة البشرية-1. فمن الممكن لتضخيم قوالب غير-فيروس نقص المناعة البشرية-1 ويمكن تحديد هذه في هذه المرحلة. إذا تسلسلات فيروس نقص المناعة البشرية-1 ولكن لا تتم محاذاة، أرى أن وجود العكس (راجع الخطوة رقم 6، 1).

6-تحديد الكفاءات النسخ المتماثل المحتملة لفيروس نقص المناعة البشرية-1 تسلسل بروفيرال

ملاحظة: لتحديد تسلسل سليمة وراثيا، ويحتمل أن تكون مختصة في النسخ المتماثل، بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 عملية صارمة للقضاء على اتباعها (الشكل 1). تسلسل بروفيرال تفتقر إلى العكس، إيقاف الحذف الداخلية الكبيرة، ضارة codons/هايبرموتيشن والطفرات فراميشيفت، و/أو عيوب في إشارة MSD الموقع أو التعبئة تعتبر سليمة وراثيا، ويحتمل أن تكون مختصة في النسخ المتماثل.

  1. العكس
    1. وخلال مرحلة المحاذاة، تحديد العكس. العكس هي المناطق حيث التسلسل محاذاة لا إلى مرجع HXB2 ما لم يتم عكس المنطقة تستكمل.
      ملاحظة: اعتماداً على تطبيق البيانات، تسلسل يحتوي على العكس قد تحتاج إلى حذف من مزيد من التحليل.
  2. الحذف الداخلية الكبيرة
    1. تحديد كونتيجس مع الحذف الداخلية الكبيرة (> 600 bp) في مرحلة المحاذاة. إلا إذا الحذف يجلس داخل nef، يمكن تعريف التسلسل المعيبة.
      ملاحظة: أي تسلسل مع الحذف الداخلية < 600 bp سوف تحددها الجينات كتر (الخطوة 6.3.1) كوجود تسلسل الجين غير مكتملة.
  3. Codons توقف ضارة والطفرات فراميشيفت والحذف
    1. التحقق من جميع كونتيجس من طول > أداة النيوكليوتيدات 8400 لوجود codons التوقف الضار، فراميشيفتس وتسلسل الجينات ناقصة استخدام في "لوس ألاموس الوطني مختبر فيروس نقص المناعة البشرية تسلسل قاعدة بيانات الجينات كتر"23.
      ملاحظة: أداة قطع الجينات يقسم التسلسل بروفيرال بالجينات اسكت، بول، vif، vpr، تأت، القس، والمستضعفين، والحياة الفطرية، و نيف، ويترجم لهم للأحماض الأمينية. ثم شاشات كتر الجينات لوجود stop codons والطفرات فراميشيفت (بسبب عمليات الإدراج أو الحذف). كونتيجس التي تحتوي على stop codons أو فراميشيفتس في أي الجينات، باستثناء nef24، تصنف على أنها معيبة. كتر الجينات كما يحدد تسلسل الجين غير مكتملة وأي بروفيروسيس مع حذف < 600 يمكن تصنيف بي بي في جين خلاف nef معيبة بسبب حذف داخلية كبيرة.
  4. هايبرموتيشن
    1. إيجاد توافق في آراء بتسلسل بروفيرال كامل طول المتبقية باستخدام (صانع توافق بسيط) أداة "لوس ألاموس الوطني مختبر فيروس نقص المناعة البشرية تسلسل قاعدة بيانات توافق صانع"25. إضافة تسلسل توافق الآراء إلى أعلى محاذاة تتضمن فقط تسلسل بروفيرال كامل طول المتبقية. باستخدام هذه المحاذاة و أداة "فيروس نقص المناعة البشرية مختبر لوس ألاموس الوطني قاعدة البيانات تسلسل هايبرموت"26 لتحديد التي يسببها أبوبيك هايبرموتيشن ز-أ في تسلسل بروفيرال كامل طول المتبقية.
  5. عيوب في MSD وإشارة التغليف
    1. افحص كل من كونتيجس المتبقية لعيوب في MSD وإشارة التغليف (منطقة HXB2 670-810) التي تجعل المعيبة تسلسل بروفيرال4. ابحث عن طفرة نقطة في الموقع MSD (تسلسل جي تي، HXB2 744-745) أو وقف أي حذف في أربعة حلقات إشارة التغليف (SL1 SL2 (HXB2 691-734)، SL3 (HXB2 736-754)، (HXB2 766-779)، و SL4 (HXB2 790-810)).

Representative Results

والرزن تقلب يسهب وتسلسل واحد، قرب كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس. ينطوي البروتوكول 6 خطوات للحصول على قرب متواليات بروفيرال كاملة الطول. وتشمل هذه الخطوات: تحلل من إصابة الخلايا، بكر المتداخلة كامل طول بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 (سليمة ومعيبة) وتنقية الحمض النووي والتقدير الكمي، تسلسل إعداد مكتبة، خ ع، والجمعية حيثياته للتسلسل بروفيروسيس. ويمكن اعتبار نهاية كل خطوة نقطة تفتيش التي يمكن تقييم نوعية المنتج (مثل تضخيم الحمض النووي، وتنقية الحمض النووي، مكتبة تسلسل أو تسلسل) قبل الخطوة التالية. لمحة عامة عن التقييم المنجز في نهاية كل خطوة، ويرد أدناه موجز النتائج المتوقعة.

بعد بكر متداخلة، يتم تشغيل المنتجات تضخيم على 1% [اغروس] هلام (الشكل 3). يمكن تحديد نوعية الأولية بكر بتفتيش عناصر سلبية وإيجابية. آبار المراقبة السلبية التي تحتوي على منتج تضخيم الإشارة إلى التلوث وآبار مراقبة إيجابية في غياب المنتج تضخيم الإشارة إلى التضخيم غير كافية. المقبل، يتم تحديد الآبار التي تحتوي على منتج تضخيم للتسلسل. لتجنب الآبار التي تحتوي على خليط بروفيروسيس تضخيم متعددة، تعتبر فقط من الآبار التي تحتوي على تضخيم المنتج تشغيل في تمييع نقطة النهاية للتسلسل. وفقا لتوزيع بواسون، يوجد تمييع نقطة النهاية عند 30 في المائة آبار إيجابية لتضخيم المنتج. يوجد في هذا التخفيف، 80% فرصة هذه الآبار تحتوي بروفيروس تضخيم واحد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تصور الآبار التي تحتوي على بروفيروسيس تضخيم متعددة ذات أطوال مختلفة في هذه المرحلة سوف تظهر نطاقات متعددة على الهلام. لا ينبغي تحديده هذه الآبار للتسلسل (الشكل 3).

بعد تنقية بروفيروسيس تضخيم المختارة للتسلسل، يضمن التقدير الكمي الحمض النووي بروفيرال لم يتم فقدان أثناء مرحلة تنقية. إذا كان تركيز الحمض النووي بروفيروس تضخيم < 0.2 نانوغرام/ميليلتر، العينة المتبقية في PCR2 يمكن تنقية لوحة. حاجز مماثل يحدث عقب إعداد مكتبة، الذي هو كمياً كل مكتبة الفردية. وهذا ما يضمن بروفيروسيس الفردية تم على نحو ملائم مجزأة، ومعلم وتضخيمه قبل التسلسل. يتم تجميع المكتبات بروفيرال الفردية في مبالغ اكويمولار إلى تركز مكتبة نهائية 4 نانومتر (أو كما هو محدد بالموفر التسلسل). إذا كان تركيز مكتبة بروفيرال الفردية منخفضا جداً، فإنه يمكن استبعاد من تجمع المكتبة التسلسل، أو إعداد المكتبة الفردية مرة أخرى. يتم إجراء فحص نهائي لتركيز مكتبة المجمعة قبل تسلسل جنبا إلى جنب مع تأكيد أطوال جزء متوسط.

خطوات مراقبة الجودة قبل مرحلة الجمعية حيثياته يضمن جودة ما يلي: يستخدم لتجميع contig بروفيرال النهائية. وتشمل هذه الخطوات: إزالة محول متواليات، قص ه 5 '3' النيوكليوتيدات، حد جودة صارمة، وتجاهل ما يلي قصيرة. منضدة الجينوميات النفطي يمكن أن توفر تقارير مراقبة الجودة التي يمكن استخدامها من قبل لتقييم نوعية الأولية ما يلي وإعدادات دليل التشذيب، ومن ثم بعد تقرير ما إذا كان التشذيب كافية لإزالة المناطق منخفضة الجودة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم نوعية كونتيجس المجمعة للجمعية حيثياته ، للعمق الكافي (> 1000 X) وسيفيد تغطية (الشكل 4 أ). في هذه المرحلة، يمكن أيضا تحديد المختلطة السكان. يتم تحديد خليط من عدة كاملة الطول (~ 9 كيلو بايت) بروفيروسيس من خلال وجود بطانات متعددة بتواتر أكبر من 40 في المائة، بينما يمكن تحديد المزائج القصيرة (التي تحتوي على حذف داخلية كبيرة) وطول بروفيروسيس بتفاوت قراءة التغطية التالية التعيين إلى مرجع كامل طول من المشارك نفسه (الشكل 4 باء).

اعتماداً على التطبيق، يمكن تصور المحاذاة النهائي باستخدام أدوات مثل جتري المتاحة كحزمة في "لغة r: A وبيئة الحوسبة الإحصائية"27. في دراسة أجريت مؤخرا، استخدم تسلسل فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس من ذاكرة ساذجة والمركزية والانتقالية، والمستجيب CD4+ تي تقلب الخلايا المعزولة من الأفراد في الفن طويلة الأجل، بهدف تحديد ما إذا كانت الخلية خاصة مجموعات فرعية أظهرت أعلى نسب سليمة وراثيا، ويحتمل أن تكون مختصة في النسخ المتماثل من فيروس نقص المناعة البشرية-12. هنا، هو عرض تمثيل مرئي من التسلسلات معزولة عن أحد المشاركين في هذه الدراسة (مشارك 2026) (الشكل 5). في هذا المشارك، كانت الغالبية (97 ٪) متواليات معيبة، مع تسلسل سليمة وجدت في المستجيب والذاكرة الانتقالية CD4+ تي الخلايا. هذا التصور الأداة مفيدة لعرض عدد تسلسل مع الحذف الداخلية الكبيرة ومركزها في الجينوم. يمكن المشروح كذلك تشير إلى تسلسل مع codons التوقف الضار، والطفرات فراميشيفت، والحذف/الطفرات في الموقع MSD و/أو إشارة التغليف.

وهو تطبيق واحد للمقايسة تقلب تحديد بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 سليمة وراثيا، ويحتمل أن تكون مختصة في النسخ المتماثل. في دراسة أجريت مؤخرا على تسلسلات 531 المعزولة من خلايا CD4 خلايا+ ر من المشاركين 6 في الفن طويلة الأجل، 26 (5%) بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 سليمة وراثيا تم تحديدها2. شملت بروفيروسيس المعيبة المتبقية بعكس تسلسل (6 في المائة) والحذف الداخلية الكبيرة (68 في المائة) وتوقف ضارة codons/هايبرموتيشن (9%)، والطفرات فراميشيفت (1%) والعيوب في إشارة التغليف و/أو حدوث طفرات في الموقع MSD (11%) .

Figure 2
الشكل 2: نظرة عامة على سير العمل للجمعية حيثياته لفيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس. وتشمل الخطوات الرئيسية في سير العمل: 1) تسلسل قراءة مراقبة الجودة، 2) دمج أزواج متداخلة، 3) الجمعية حيثياته ، و 4) إعادة وبناء توافق الآراء كان اللون الأحمر، والأزرق والأخضر والبرتقالي، على التوالي. وقد تم تعديل هذا الرقم من هينر et al. 2 . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مثال على [اغروس] هلام ال [بكر] تضخيم فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس- تحتوي الآبار 1، 2، 3، 6 و 9 و 10 على تضخيم فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس. 10 جيدا يحتوي بروفيروس مع حذف داخلية كبيرة، 2 جيدا التضخيم المشارك من اثنين بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 ذات أطوال مختلفة (خليط)، ويشمل 12 جيدا مراقبة إيجابية. ملاحظة المئة من الآبار التي تحتوي على تضخيم المنتج هو 60% وهو أعلاه النسبة المئوية المطلوبة لعزل قوالب واحدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: إخراج المثال تعيين القراءة- (أ) على سبيل المثال مما يدل على تغطية حتى سبب التضخيم من بروفيروس فيروس نقص المناعة البشرية-1 واحد كامل طول. في أعقاب الجمعية حيثياته ، يتم تعيين كل القراءات contig المجمعة لإنتاج تسلسل توافق آراء. منصة برمجيات تتيح القراءات المعينة التي ستخضع لتغطية كافية وحتى. (ب) على سبيل المثال إظهار التضخيم المشارك من اثنين بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 ذات أطوال مختلفة (خليط). لتحديد المزائج، تعيينها إلى سلسلة مرجع كامل طول (~ 9 كيلو بايت) من المشارك نفسه ما يلي وقراءة الخرائط تفتيشها. ويشير إلى وجود تفاوت التغطية خليط. ويرد هذا الرقم مع إذن من Qiagen14. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: مثال التصور لفيروس نقص المناعة البشرية-1 متواليات بروفيرال المعزولة من خلايا CD4+ تي الخلية مجموعات فرعية من أي فرد في الفن طويلة الأجل. تسلسل بروفيرال حدة فيروس نقص المناعة البشرية-1 يتم تمثيل بواسطة خطوط أفقية. وقد تم تعديل هذا الرقم من هينر et al. 2 . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

والرزن تقلب أسلوب كفاءة والفائق لتضخيم وتسلسل واحد, قرب كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس. وقد حددت عدة عوامل وخطوات حاسمة في البروتوكول التي تؤثر على عدد ونوعية تسلسل الحصول عليها. أولاً، عدد الخلايا وتواتر الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 السكان خلية التأثير على عدد بروفيروسيس تضخيمه. على سبيل المثال، في منشور سابق، ما يقرب من نصف عدد من تسلسل تم الحصول عليها من نفس العدد من السذاجة CD4+ تي الخلايا مقارنة بذاكرة المستجيب CD4+ تي الخلايا. يرجع ذلك إلى أن الخلايا ساذجة وعادة ما يكون تواتر إصابة أقل من الخلايا ذاكرة المستجيب2. وثانيا، تحلل الخلية الأفضل لأساليب الاستخراج المستندة إلى العمود للحصول على الحمض النووي، ليس هناك أي خطر من فقدان الحمض النووي في عملية الاستخراج. وأخيراً، كما الحال مع أي التحليل القائم على بكر، منع التلوث الحرجة. ينبغي تعيين المناطق النظيفة المنفصلين لإعداد يمزج الرئيسي، التعامل مع الحمض النووي، مشيراً إلى عناصر إيجابية وتنقية الحمض النووي والتقدير الكمي، وإعداد مكتبة. هذا مهم خاصة لفحوصات نسخة واحدة مثل تلك المعروضة هنا.

ينبغي أن يتضمن تنفيذ المقايسة تقلب أولاً تشغيل عنصر تحكم إيجابية مثل البلازميدات pNL4-3 بدلاً من عينات المشاركين. هذا سوف يسمح لأي قبل استكشاف الأخطاء وإصلاحها باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية-1 الخلايا إيجابية، كما يمكن مقارنة تسلسل الحصول عليها إلى تسلسل المرجعية المتاحة لهذه البلازميدات. عند استخدام الخلايا إيجابية فيروس نقص المناعة البشرية-1، من المهم أن تنظر النوع الفرعي لفيروس نقص المناعة البشرية-1 (كبسولة تفجير مصممة لتقلب محددة للنوع الفرعي ب) وتواتر الإصابة بالسكان الخلية إذا كان قليل من بروفيروسيس لا يتم تضخيمها. تسلسلات التمهيدي يمكن تعديل/إعادة تصميمها لتتناسب مع أنواع فرعية أخرى. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي إدراج جيدا الذي يحتوي على عنصر تحكم إيجابي في PCR كل إجراء.

تقلب والتغلب على القيود المفروضة على فحوصات التسلسل السابق، بما في ذلك الصحة والصحة النباتية. من خلال تضخيم وتسلسلها القرب من كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس، يمكن تحديد تقلب النسخ المتماثل-الكفاءات المحتملة من فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس. وهذا لم يكن ممكناً استخدام تدابير الصحة النباتية، الذي التسلسل فقط المناطق الفرعية الجينوم والمحدد ولذلك لتسلسل مع مواقع الربط التمهيدي سليمة. وعلاوة على ذلك، وتقلب يتغلب على القيود المرتبطة باستخدام متعددة التضخيم وتسلسل الإشعال، كما كان يعمل في السابق تسلسل كامل طول فحوصات1،4. من خلال جولتين من استهداف المناطق فيروس نقص المناعة البشرية-1 "لتر" جنبا إلى جنب مع خ ع PCR، تقلب يقلل عدد وتعقيد الإشعال المطلوبة. ولذلك تقلب أقل عرضه للنتائج المترتبة على عدم التطابق التمهيدي، إلا وهي تحديد الخاطئة بروفيروسيس المعيبة، وعدم قدرة على تضخيم بعض بروفيروسيس داخل مجموعة من سكان. البروتوكول تقلب هو أيضا أكثر كفاءة، ويسمح لأعلى من الناتج من تسلسل من الأساليب السابقة.

ومن الواضح أن تقلب يوفر مزايا أكثر من الأساليب القائمة التي تحدد التركيب الجيني لفيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس. ومع ذلك، من المهم أن نعترف بالقيود المفروضة على تقلب. أولاً، مقايسة تقلب لا وضعت كأداة لقياس حجم الخزان فيروس نقص المناعة البشرية-1 الكامنة، كما لم تكتمل بعد تحاليل لتحديد ما إذا كان تقلب يسهب كل بروفيروس فيروس نقص المناعة البشرية-1 الحالي في عدد سكان خلية. تقلب مفيد لإجراء مقارنات نسبية لتكوين الخزان بين خلية مختلفة السكان2بدلاً من ذلك. وثانيا، لا يمكن تحديد اختصاصات سليمة فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس النسخ المتماثل مع اليقين دون في فيفو التحليلات، مثل تلك التي يقوم بها هو وآخرون 4-ثالثا، تقلب ليست مصممة لتحديد موقع إدماج فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس.

ويمكن زيادة الاختلافات الطفيفة في بروتوكول تقلب تطبيقه. على سبيل المثال، التغييرات في التمهيدي يمكن أن تسمح تسلسلات مختلفة ومتعددة الأنواع الفرعية فيروس نقص المناعة البشرية-1 أن تتضخم ومتسلسلة. تسلسل فيريونس البلازما فيروس نقص المناعة البشرية-1 من الممكن عن طريق إضافة التوليف كدنا قبل بكر متداخلة. استخدام أساليب تسلسل جزيء واحد في المستقبل سوف تلغي الحاجة إلى الجمعية حيثياته .

التسلسل الجيني المتكاملة فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس زاد فهمنا لفيروس نقص المناعة البشرية-1 خزان الكامنة. تقلب أداة هامة للدراسات المقبلة توضيح تركيب وتوزيع خزان الكامنة. ومع ذلك، يمكن أن تتجاوز تطبيق تقلب الخزان. قد تستخدم الدراسات المستقبلية تقلب على تحديد أهداف معينة للتكنولوجيا كريسبر-الأكاديمية الصينية للعلوم، أو المساعدة في تحديد الترميز والمناطق غير الترميز الذي يجعل الفيروس أكثر استجابة للكمون عكس وكلاء. جزئ الفيروسية ويمكن فهم أفضل من خلال النظر في مواقع تقاطع الحذف الداخلية الكبيرة.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل مؤسسة بحوث الإيدز ديلاني (داري) لإيجاد علاج (1U19AI096109 و 1UM1AI126611-01)؛ كارمايكل "اتحاد البحوث" المتعلقة "القضاء على" فيروس نقص المناعة البشرية (أرش) "منحة بحثية تعاونية" من "المؤسسة" "أبحاث الإيدز" (امفار 108074-50-رجرل)؛ المركز الأسترالي لفيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد الوبائي بحوث علم الفيروسات (ACH2)؛ غيفي UCSF مركز لأبحاث الإيدز (P30 AI027763)؛ والاسترالية الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية (AAP1061681). ونود أن نشكر الدكتور جوي لأي، مدير مرفق الجينوميات في معهد "الأبحاث الطبية" لتدريبه في إعداد المكتبة واستخدام مرفق له Westmead، ومركز راماسيوتي لعلم الجينوم (جامعة نيو ساوث ويلز، سيدني، أستراليا) لإجراء تسلسل. ونعترف مع الامتنان المشاركين الذين تبرعوا بالعينات لإجراء هذه الدراسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 Invitrogen 15568025 Dilute to 5 mM for nested PCR
Nonidet P 40 Substitute solution Sigma 98379
Tween-20 Sigma P9416
Proteinase K Solution (20 mg/mL) Promega AM2548
96 well thermocycler Any 96 well thermocycler can be used
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen 11304011
10x High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] Invitrogen 11304011
50 mM MgSO4 Invitrogen 11304011
PCR Nucleotide Mix, 10 mM Promega C1141
Ultrapure H2O Invitrogen 10977023
PCR1 and PCR2 Primers Desalted. Dilute to (100 µM) with H2O
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear Axygen PCR-96M2-HS-C
Microseal 'B' Adhesive Seals BioRad MSB1001 Required to seal 96 well PCR plates
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). Diluted to 105 copies/mL and used as positive control
PCR plate spinner or benchtop centrifuge
E-GEL 48 1% Agarose Invitrogen G800801 Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide.
DirectLoad Wide Range DNA Marker Sigma D7058 Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Mother E-Base device Invitrogen EBM03 Required for running precast 48 well 1% agarose gels
Gel Doc EZ Gel Documentation System BioRad 1708270 Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used
PlateMax Peelable Heat Sealing Axygen HS-200 Heat sealing film for long term storage
96 Well 0.8 mL Storage Plate ThermoFisher Scientific AB0765 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) Beckman Coulter A63880 Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106)
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology Sigma E7023
Magnetic Stand-96 Invitrogen AM10027
Microplate shaker Optional
Buffer EB Qiagen 19086 Elution buffer
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496 A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
Microplate reader
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-2001
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Biorad HSP9601 Required for Nextera XT DNA library preparation kit
Library Quantification Kit - Illumina/Universal Kapa Biosystems KK4824 Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)
2100 Bioanalyzer Agilent Technology Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit
High Sensistivty DNA kit Agilent Technology 5067-4626
Illumina MiSeq Platform Illumina

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruner, K. M., et al. Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection. Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).
  2. Hiener, B., et al. Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants. Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).
  3. Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication. Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).
  4. Ho, Y. C., et al. Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure. Cell. 155 (3), 540-551 (2013).
  5. Harris, R. S., et al. DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection. Cell. 113 (6), 803-809 (2003).
  6. Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein. Science. 300 (5622), 1112 (2003).
  7. Chun, T. W., et al. Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication. AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).
  8. Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).
  9. Soriano-Sarabia, N., et al. Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells. Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).
  10. Josefsson, L., et al. The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).
  11. Evering, T. H., et al. Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection. Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506 (2012).
  12. von Stockenstrom, S., et al. Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy. Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).
  13. Palmer, S., et al. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).
  14. Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from: https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench (2018).
  15. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  16. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  17. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), (2011).
  18. Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
  19. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  20. Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
  21. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  22. Katoh, K., Standley, D. M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).
  23. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html (2018).
  24. Foster, J. L., Garcia, J. V. Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis. Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).
  25. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html (2018).
  26. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html (2018).
  27. Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data. Methods in Ecology and Evolution. , (2016).

Tags

علم الوراثة، العدد 140، الجيل التالي التسلسل، فيروس نقص المناعة البشرية-1، فيروس نقص المناعة البشرية، بروفيروسيس، بروفيرال--واحد تسلسلها، "فيروس الحمض النووي"، الكمون، النسخ المتماثل-الكفاءة، العلاج المضاد للفيروسات الرجعية، وخزان فيروس نقص المناعة البشرية، فيروس نقص المناعة البشرية المتكاملة
التضخيم من القرب من كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس للجيل التالي التسلسل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh,… More

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh, B. A., Palmer, S. Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58016, doi:10.3791/58016 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter