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Genetics

Amplificação de perto completos provírus HIV-1 para a próxima geração de sequenciamento

Published: October 16, 2018 doi: 10.3791/58016
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Virus Research, The Westmead Institute for Medical Research, University of Sydney

Summary

Sequenciamento proviral individual completo (aletas) fornece um método eficiente e de alta produtividade para a amplificação e sequenciamento de single, perto de provírus completos de HIV-1 (intactos e com defeito) e permite a determinação do seu potencial replicação-competência. FLIPS supera as limitações dos ensaios anteriores projetados para sequenciar o reservatório latente do HIV-1.

Abstract

O ensaio completo Individual Proviral sequenciamento (aletas) é um método eficiente e de alta produtividade, projetado para amplificar e sequência única, perto de provírus de HIV-1 (intactas e defeituosos), longa-metragem. FLIPS permite a determinação da composição genética do HIV-1 integrado dentro de uma população celular. Através da identificação de defeitos em sequências proviral de VIH-1 que surgem durante a transcrição reversa, tais como grandes exclusões internas, códons de parada deletérios/hipermutação, mutações frameshift e mutações/exclusões em cis agindo elementos necessários para a maturação do virion, FLIPS podem identificar provírus integrados incapazes de replicação. O ensaio de FLIPS pode ser utilizado para identificar o provírus HIV-1 que faltam esses defeitos e são, portanto, potencialmente competentes de replicação. O protocolo de FLIPS envolve: lise das células infectadas de HIV-1, aninhados PCR de perto completos provírus HIV-1 (usando as primeiras demão direcionadas para o HIV-1 5' e 3' LTR), purificação de DNA e quantificação, preparação de biblioteca para geração de sequenciamento (NGS), NGS, de novo montagem de contigs proviral e um simples processo de eliminação para a identificação de provírus replicação competente. FLIPS fornece vantagens sobre os tradicionais métodos destinados a sequência integrada provírus HIV-1, tais como sequenciamento single-proviral. FLIPS amplifica e sequências perto de provírus completos, habilitando a competência de replicação ser determinada e também usa menos iniciadores de amplificação, impedindo que as consequências da primeira demão incompatibilidades. ALETAS é uma ferramenta útil para a compreensão da paisagem genética de provírus integrados do HIV-1, especialmente dentro do reservatório latente, no entanto, sua utilização pode estender para qualquer aplicação em que a composição genética do HIV-1 integrado é necessária.

Introduction

Caracterização genética do HIV-1 reservatório latente, que persiste em indivíduos em longo prazo terapia antiretroviral (arte), tem sido vital para a compreensão de que a maioria de provírus integrados está com defeito e replicação-incompetente1 , 2. durante o processo de transcrição reversa, erros são introduzidos na sequência proviral integrado. Alguns mecanismos que geram sequências proviral defeituosas incluem o propenso de enzima transcriptase reversa HIV-13, modelo4, e/ou induzida por APOBEC Hipermutação5,6de comutação. Dois estudos recentes descobriram que aproximadamente 5% dos HIV-1 provírus isoladas de indivíduos na arte a longo prazo são geneticamente intacta e potencialmente replicação competente e pode contribuir para a recuperação rápida em níveis do plasma HIV-1 após a cessação da arte 1 , 2 , 7. estudos anteriores identificaram que provírus replicação do HIV-1 persistem no ingênuo e descansando memória CD4+ T célula subconjuntos (incluindo o central, transição e células de memória T efetoras), indicando a importância da visando estas células no futuro estratégias de erradicação a2,8,9.

Primeiros insights sobre a distribuição, a dinâmica e a manutenção do reservatório de latente do HIV-1 foram alcançados por meio da utilização de métodos de sequenciamento single-proviral (SPS) que caracterizam geneticamente genômica sub regiões do genoma do HIV-1,10 ,11,12,13. SPS é uma ferramenta versátil, capaz de sequenciar um único pró-vírus de HIV-1 de dentro de uma única célula infectada. No entanto, o SPS é incapaz de determinar a competência de replicação de provírus, desde que apenas sequências subgenômica provírus regiões e misses que contêm grandes exclusões dentro de sítios de ligação da primeira demão. Um estudo anterior demonstrou que a SPS superestima o tamanho do reservatório de replicação por 13 - a 17 vezes por meio de sequenciamento seletivamente intacta regiões genômicas sub2.

Para resolver as limitações do SPS, Ho et al . 4 e Bruner et al . 1 desenvolvidos ensaios de sequência perto completos provírus HIV-1. Isto permitiu que a frequência de geneticamente intactas e potencialmente competentes para replicação, provírus HIV-1 em indivíduos na arte a longo prazo a fixar. Estes ensaios amplificado e sequenciados (através de Sanger sequenciamento) regiões subgenômica que então foram montadas para obter um pró-vírus de HIV-1 sequência do (intacta ou com defeito). Três limitações desta abordagem são: 1) a utilização de múltiplos primers sequenciamento aumenta o risco de inadvertidamente introduzir defeitos na sequência proviral, 2) cartilha incompatibilidades podem impedir a amplificação de provírus particulares e 3) muitas vezes o toda a sequência de proviral não pode ser resolvida devido à tecnicidade desses métodos.

Para superar as limitações existentes completos ensaios de sequenciamento proviral de HIV-1, desenvolvemos o Full -Lcomprimento eusubjugado Pmentos Sequencing (aletas) do ensaio. ALETAS é um sequenciamento de próxima geração (NGS)-ensaio baseado que amplifica e sequências perto de provírus completos de HIV-1 (intactas ou com defeito) de forma eficiente e de alta produtividade. FLIPS oferece vantagens em ensaios anteriores, como limitar o número de primers utilizados; Portanto, ela diminui a chance de primer incompatibilidades, que podem limitar a população de provírus capturaram ou involuntariamente apresentar defeitos em uma sequência viral. FLIPS é também menos tecnicamente desafiador do que ensaios anteriores e envolve 6 etapas principais: células de 1) lise de infectados de HIV-1, 2) amplificação de provírus de HIV-1 único através de PCR aninhado realizada em limitar a diluição utilizando primers específicos para o altamente conservadas HIV-1 5' e 3' U5 LTR região (figura 1A), 3) purificação e quantificação dos produtos amplificados, 4) preparação da biblioteca de provírus amplificados para NGS, 5) NGS e 6) montagem de novo de provírus sequenciadas para obter contigs de cada pró-vírus individuais.

Sequências geradas por FLIPS podem se submeter a um processo rigoroso de eliminação para identificar aqueles que são geneticamente intacta e potencialmente competentes de replicação (Figura 1)2. Provírus geneticamente intactas faltam todos os defeitos conhecidos que resultar na geração de pró-vírus uma replicação-incompetente. Estes defeitos incluem: sequências de inversão, grandes exclusões internas, códons de parada Hipermutação/deletérios, frameshifts ou mutações na 5' embalagens maiores ou sinal splice local doador (MSD).

Figure 1
Figura 1: passos críticos no ensaio de sequenciamento proviral individuais completos (aletas). (A) genoma de DNA do HIV-1 com sítios de ligação cartilha em 5' e 3' regiões LTR U5 usados por FLIPS para amplificar perto completos (com defeito e intactos) provírus HIV-1 através de PCR aninhado. (B) o Layout de uma placa PCR de 96 poços contendo 80 poços de amostra (20 poços para cada diluição), 4 poços de controlo negativo e 1 controle positivo bem. (C) processo de eliminação, usado para identificar geneticamente intactas e potencialmente competentes para replicação, provírus HIV-1. Esta figura foi modificada de Hiener et al . 2 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelos conselhos revisão institucional da Universidade da Califórnia em San Francisco e o Western Sydney distrito de saúde Local, que inclui Instituto Westmead para pesquisa médica.

1. a Lise das células infectadas pelo VIH-1

Nota: As células podem ser isoladas do sangue periférico, leucoaférese amostras, biópsia de medula óssea ou biopsia de tecido. Populações de células podem ser classificadas usando fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação.

  1. Preparar um tampão de Lise contendo 10 mM Tris-HCl, 0,5% Nonidet P–, de 40 0.5% Tween-20 e proteinase 0,3 mg/mL K. Um pellet de células, adicione 100 µ l de tampão de Lise por 1 x 106 células. Pipete para cima e para baixo para misturar. Incube a 55 ° C durante 1 hora seguida de 85 ° C por 15 min lisar as células e liberar o DNA genômico para amplificação por PCR.
    Nota: Lysis da pilha são suficiente para obter o DNA genômico para amplificação. Sem isolamento do DNA ou purificação é necessária. O protocolo pode ser interrompido neste ponto e DNA genômico pode ser armazenado a-20 ° C indefinidamente.

2. amplificação de provírus único DNA HIV-1 através de PCR aninhado

  1. Misturar os reagentes para a primeira rodada PCR (PCR1) listados na tabela 1 (ver Tabela de materiais). Adicione 38 µ l do mix mestre 85 poços (80 amostras, 4 controles negativos, 1 controle positivo) de uma placa PCR de 96 poços (siga o layout na figura 1B). Designe esta placa 'PCR1'.
Reagente Concentração final Volume para placa PCR1 (µ l) Volume para placa PCR2 (µ l)
Primer para a frente 1 ΜM 32,3 23,8
Primer reverso 1 ΜM 32,3 23,8
Tampão (10x) 1 x 323 238
MgSO4 (50 mM) 2 mM 129.2 95,2
dNTP (10 mM) 0,2 mM 64,6 47,6
DNA polimerase (5 U / µ l) 0.025 U/Μ l 16.2 11,9
Ultrapura H2O 2632.5 1939.7

Tabela 1: Reagentes e volumes para PCR mestre misturas.

Nota: Os primers utilizados para PCR1 são:
BLOuterF: 5'-AAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3' (HXB2 posição 623-649)
BLOuterR: 5'-TGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTC-3' (HXB2 posição 9662-9686)

  1. Depois de preparar a mistura de mestre, mova a placa PCR1 para uma área limpa, designada para a adição de DNA genômico.
    1. DNA genômico serialmente diluída de 1:3 a 1:81 com Tris-HCl (5 mM, pH 8), preparando 45 µ l de cada diluição (suficiente para 20 poços para cada diluição). Adicione 2 µ l de DNA genômico diluído para cada amostra bem e 2 µ l de Tris-HCl (5 mM, pH 8) para cada controlo negativo bem (siga o layout na figura 1B). Sele todos os poços da placa de PCR1, excluindo o positivo controlam bem, usando um selo adesivo (veja a Tabela de materiais).
      Nota: As diluições recomendadas acima servem apenas como um guia inicial para a determinação da diluição de ponto de extremidade. Diluições dependerá da concentração de DNA de HIV-1 integrado dentro das amostras.
  2. Mover para uma área designada para a adição de controle positivo. Adicionar 2 µ l de controlo positivo (pNL4-3 diluído a 105 cópias / µ l) para o controlo positivo bem da placa PCR1 e a placa do selo. Brevemente, girar a placa de PCR1 em um girador de placa do PCR ou centrífuga (400 x g durante 10 s à temperatura ambiente) para derrubar qualquer conteúdo residual dos lados dos poços.
  3. Verificar a placa de PCR1 em um thermocycler: 94 ° C por 2 min; Depois de 94 ° C por 30 s, 64 ° C por 30 s, 68 ° C por 10 min. para 3 ciclos; 94 ° C por 30 s, 61 ° C por 30 s, 68 ° C por 10 min. para 3 ciclos; 94 ° C por 30 s, 58 ° C por 30 s, 68 ° C por 10 min. para 3 ciclos; 94 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 68 ° C por 10 min para 21 ciclos; Então 68 ° C por 10 min (total de 30 ciclos). Manter a 4 ° C.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e a placa de PCR1 mantido a 4 ° C por até 2 dias.
  4. Misture os reagentes para a segunda fase do PCR (PCR2) listados na tabela 1. Adicione 28 µ l 85 poços (80 amostras, 4 controles negativos, 1 controle positivo) de uma nova placa PCR de 96 poços (siga o layout na figura 1B). Designe esta placa 'PCR2'.

Nota: Os primers utilizados para PCR2 são:
275F: 5'-ACAGGGACCTGAAAGCGAAAG-3' (HXB2 posição 646-666)
280R: 5'-CTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACG-3' (HXB2 posição 9650-9676)

  1. Brevemente, girar a placa de PCR1 em um girador de placa do PCR ou centrífuga (400 x g durante 10 s à temperatura ambiente) para derrubar qualquer conteúdo residual dos lados dos poços. Adicione 80 µ l de Tris-HCl (5 mM, pH 8) a cada poço da placa de PCR1.
    1. Transferi 2 µ l da placa de PCR1 para a placa de PCR2 usando uma pipeta multicanal. Certifique-se de amostras são transferidas para bem bem (ou seja, 2 µ l de bem A1 de PCR1 placa é transferida para a placa de A1 de PCR2 bem). Sele a placa PCR2 usando um selo adesivo (veja a Tabela de materiais).
    2. Brevemente, girar a placa PCR2 em um girador de placa do PCR ou centrífuga (400 x g durante 10 s à temperatura ambiente) para derrubar qualquer conteúdo residual dos lados dos poços. A placa PCR1 do selo com um calor de selagem de filme para armazenamento a longo prazo a-20 ° C (ver Tabela de materiais).
  2. Verifique a placa de PCR2 em um thermocycler: 94 ° C por 2 min; Depois de 94 ° C por 30 s, 64 ° C por 30 s, 68 ° C por 10 min. para 3 ciclos; 94 ° C por 30 s, 61 ° C por 30 s, 68 ° C por 10 min. para 3 ciclos; 94 ° C por 30 s, 58 ° C por 30 s, 68 ° C por 10 min. para 3 ciclos; 94 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 68 ° C por 10 min para 31 ciclos; Então 68 ° C por 10 min (total de 40 ciclos). Manter a 4 ° C.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e a placa PCR2 mantido a 4 ° C por até 2 dias.
  3. Brevemente, gire a placa PCR2 em um girador de placa do PCR ou centrifugador para derrubar qualquer conteúdo residual dos lados dos poços. Adicione 60 µ l de Tris-HCl (5 mM, pH 8) a cada poço usando uma pipeta multicanal.
    1. Executar 15 µ l de cada poço em 2 x 48-bem pré-moldado 1% gel de agarose contendo brometo de etídio (0.1\u20120.3 µ g/mL, consulte Tabela de materiais). Use uma escada com um intervalo de até 10 kb (ver Tabela de materiais). Visualize para identificar os poços contendo o produto amplificado e seus tamanhos aproximados. Salve a imagem do gel.
      Nota: Certifique-se que o controlo positivo bem contém produto amplificado. Se os poços de controlo negativo contem produto amplificado, considerar a contaminação e desconsiderar a placa.
  4. Determine a diluição em que não mais do que 30% dos poços são positivos para o produto amplificado.
    Nota: Esta é a diluição de ponto de extremidade em que a maioria (80%) dos poços conter produto amplificado de um modelo único. Esta diluição deve ser preparada e usada em PCRs subsequentes para obter mais proviral amplicons. Grave o tamanho aproximado de cada produto amplificado.

3. quantificação e purificação de DNA

  1. Brevemente, gire a placa PCR2 em um girador de placa do PCR ou centrifugador para derrubar qualquer conteúdo residual dos lados dos poços. Transferência de 40 µ l de poços contendo produto amplificado (em ou abaixo da diluição de ponto de extremidade) para uma nova placa de 96 poços midi (com um bom volume de 0,8 mL, consulte Tabela de materiais).
    Nota: Anote a original e nova bem posição de cada produto amplificado em uma planilha como um registro de cada produto amplificado para ser sequenciado.
  2. Purificar o amplificado produtos de DNA usando uma purificação de PCR magnético do grânulo com base kit (veja a tabela de materiais) para remover as primeiras demão, nucleotídeos, enzimas, óleos e sais. Antes de começar, trazer grânulos magnéticos à temperatura ambiente e preparar fresco 80% de etanol. Use novas pontas de pipetas, quando apropriado, para evitar a contaminação cruzada das amostras de DNA.
    1. Grânulos de vórtice magnéticos para garantir que eles são completamente resuspended. Usando uma pipeta multicanal, adicione 40 µ l de grânulos para a 40 µ l de produto amplificado em placa de 96 poços midi de 0,8 mL. Delicadamente, pipete acima e para baixo 10 vezes para misturar. Como alternativa, misture a solução selando a placa então a tremer num agitador microplacas a 1.800 rpm por 2 min. Incubar à temperatura ambiente por 5 min.
    2. Lugar a placa em um magnético fica (ver Tabela de materiais) por 2 min. Retire e descarte sobrenadante.
    3. Lave os grânulos adicionando-se 200 µ l de etanol 80% a cada poço com a placa para depor. Incubar a temperatura ambiente por 30 s. remover e descartar o sobrenadante. Repeti uma vez. Usando uma pipeta multicanal com dicas bem, retire qualquer excesso etanol após a segunda lavagem. Com a placa no stand, permitem que os grânulos para o ar seco por 15 min.
    4. Retire a placa do suporte. Adicionar 30 µ l de tampão de eluição (ver Tabela de materiais) para cada poço. Delicadamente, pipete acima e para baixo 10 vezes para misturar. Como alternativa, misture a solução selando a placa então a tremer num agitador microplacas a 1.800 rpm por 2 min. Incubar à temperatura ambiente por 2 min.
    5. Coloque o prato num suporte magnético para 2 min. com uma pipeta multicanal, transferir 25 µ l do sobrenadante (DNA purificado) para uma nova placa PCR de 96 poços. Certifique-se de que as amostras sejam transferidas para bem (i.e., o sobrenadante do poço A1 em chapa de 0,8 mL é transferido para poço A1 da nova placa de 96 poços).
      Nota: 5 uL de eluted amostra é deixado para trás para garantir que não há transferência de grânulos de purificação residual.
  3. Determinar e registrar a concentração aproximada de cada produto de DNA amplificado após purificação usando um espectrofotômetro (absorvância no comprimento de onda de 260 nm).
    Nota: Medir a concentração aproximada de cada produto amplificado é necessário nesta fase para garantir que não há amostras são perdidas durante as etapas de purificação e que a concentração aproximada está dentro do intervalo da curva padrão usado na próxima etapa ( 0,001 – 1 ng / µ l DNA em 100 µ l de volume). O protocolo pode ser pausado aqui e limpado as amostras podem ser armazenadas a-20 ° C por até 6 meses.
  4. Quantificar a concentração de DNA de cada produto purificado usando uma quantificação de dsDNA kit (veja a tabela de materiais).
    Nota: Isto envolve o uso de uma curva padrão para determinar a concentração de dsDNA em uma amostra. O kit inclui tampão (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), um padrão de dsDNA lamda e um corante fluorescente. Manter todos os reagentes no gelo. Cobrir o tubo contendo a tintura com papel alumínio para evitar a exposição à luz. Medir a concentração de cada produto amplificado em triplicado.
    1. Tampão diluído para 1x em estéril DNase livre H2O. Adicionar 99 µ l de buffer para um número adequado de poços vazios (3 vezes o número de produtos amplificados serão medidos, consulte tabela 2 para um layout de exemplo) de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano. Adicione 100 µ l de tampão 3 poços em branco.
    2. Para cada produto amplificado ser medido, adicionar 1 µ l de DNA purificado (da etapa 3.2.5) em triplicata para cada poço contendo tampão (ver tabela 2 para um layout de exemplo).
    3. Para preparar as normas, diluir lamda dsDNA 10-fold de 2 ng / µ l a 0,002 ng / µ l. Adicionar 100 µ l de cada dsDNA padrão 3 poços.
      Nota: Na sequência passo 3.4.4, a concentração final das normas variam de 1 a 0,001 ng / µ l
    4. Dilua a 1: 200 tintura fluorescente com buffer. Rapidamente, adicione 100 µ l de cada bem que contém a amostra, espaços em branco e padrões. Misture acima e para baixo com uma pipeta. Cubra o prato com papel alumínio para evitar o contato com a luz.
    5. Leia a emissão de fluorescência em um leitor de microplacas (excitação em 480 nm, emissão em 520 nm). Registro de resultados em uma planilha.
    6. Determine a concentração de dsDNA em cada amostra utilizando as medidas de fluorescência gravadas. Subtrai a fluorescência medida em poços em branco da amostra e padrões. Determine a média fluorescência para cada amostra e o padrão do triplica. Desenhe uma curva padrão com base em medições da fluorescência das normas. Determine a concentração das amostras em relação as normas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Padrão (1 ng/mL) Padrão (0,1 ng/mL) Padrão (0,01 ng/mL) Padrão (0,001 ng/mL) Em branco
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL de tampão
B Padrão (1 ng/mL) Padrão (0,1 ng/mL) Padrão (0,01 ng/mL) Padrão (0,001 ng/mL) Em branco
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL de tampão
C Padrão (1 ng/mL) Padrão (0,1 ng/mL) Padrão (0,01 ng/mL) Padrão (0,001 ng/mL) Em branco
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL de tampão
D Exemplo 1: Exemplo 2: Exemplo 3: Exemplo 4: Exemplo 5: Exemplo 6: Exemplo 7: Exemplo 8: Exemplo 9: Exemplo 10: Exemplo 11: Exemplo 12:
DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão
E Exemplo 1: Exemplo 2: Exemplo 3: Exemplo 4: Exemplo 5: Exemplo 6: Exemplo 7: Exemplo 8: Exemplo 9: Exemplo 10: Exemplo 11: Exemplo 12:
DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão
F Exemplo 1: Exemplo 2: Exemplo 3: Exemplo 4: Exemplo 5: Exemplo 6: Exemplo 7: Exemplo 8: Exemplo 9: Exemplo 10: Exemplo 11: Exemplo 12:
DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão DNA de 1 mL + 99 mL de tampão
G
H

Tabela 2: Layout de exemplo da placa de 96 poços para quantificação de dsDNA.

  1. Dilua cada produto purificado (obtido na etapa 3.2.5) com H2O para 0,2 ng / µ l.

4. sequenciamento biblioteca preparação

  1. Preparar amplificado e purificado DNA proviral NGS utilizando uma preparação de biblioteca de DNA NGS kit (veja a Tabela de materiais). Siga as instruções do fabricante para todos os tagmentation, amplificação por PCR e limpar passos [exceto que os volumes de reação, incluindo entrada de DNA (da etapa 3.5) podem ser reduzidos para metade, para estender o uso de reagentes de preparação de biblioteca].
  2. Normalizar a bibliotecas manualmente usando uma quantificação de biblioteca baseada em qPCR NGS kit (veja a Tabela de materiais) para determinar a concentração de pró-vírus cada. Combinar as bibliotecas individuais pró-vírus em montantes equimolar a uma concentração final de 4 nM, ou conforme especificado pelo provedor de serviço de sequenciamento.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e a biblioteca em pool armazenado a-20 ° C.
  3. Quantificar a biblioteca em pool final usando o mesmo kit de quantificação de dsDNA usado no passo 3.4. Siga as instruções do fabricante. Determinar os comprimentos médios fragmento executando 1 µ l da biblioteca em pool em um sistema automatizado de electroforese usando um apropriado kit (veja a Tabela de materiais). Use a concentração e comprimentos de fragmento de média para determinar a molaridade da biblioteca em pool.
  4. Combine 5 µ l da biblioteca em pool com 5 µ l de 0,2 N NaOH para desnaturar a biblioteca. Adicione 5 µ l de 200 mM Tris-HCl para neutralizar. Dilua a biblioteca final para 12:05 com tampão de hibridização refrigerados (disponível com kit de preparação de biblioteca de DNA) imediatamente antes de sequenciamento.
  5. Realizar o sequenciamento de emparelhado-fim de nucleotídeos (nt) 2 x 150 em uma plataforma NGS apropriada (consulte a Tabela de materiais).
    Nota: Quando 96 proviral bibliotecas são indexadas por execução, isso resulta em cerca de 20 milhões emparelhado-final leituras por execução ou 200.000 leituras por biblioteca de pró-vírus individual para análise de sequência de-multiplexing. Etapas 4.4 e 4.5 são normalmente executadas por um mecanismo de sequenciamento.

5. montagem De Novo de sequenciado provírus HIV-1

Nota: Para obter a sequência genética de cada pró-vírus amplificado, contigs são montados de novo do lê emparelhado-final. Muitas plataformas (por exemplo, CLC Genomics Workbench14), permitem que o design de fluxos de trabalho personalizados para montagem de novo . Outros softwares de código aberto como FastQC15, Trimmomatic16, Cutadapt17e18 de FLASH também podem ser utilizado para leituras de processamento, bem como ferramentas como Bowtie219 e espadas20 para mapeamento de leitura e de novo montagem. Os passos para a montagem de novo de HIV-1 contigs usando uma plataforma comercial específica (consulte a Tabela de materiais) são descritos abaixo (Figura 2). Arquivo de fluxo de trabalho personalizado está disponível mediante pedido.

  1. Importação de sequências e verificar a qualidade: importação a sequência emparelhada lê (no formato fastq.gz) para o software, que será então combinado como único conjunto de leituras emparelhados. Gerar uma relatório QC de sequência e examinar a qualidade dos seus dados.
  2. Controle de qualidade
    1. Realize leitura aparamento de acordo com o relatório QC. Remova qualquer adaptador sequências e nucleotídeos ambíguos. Guarnição 15 5' e dois 3' terminal nucleotídeos. Descarte lê menos de 50 nucleótidos de comprimento. Use um limite de qualidade rigorosos de 0.001 correspondente a uma pontuação de PQV QC de 30.
  3. Mesclando pares sobrepostos
    1. Formam o único estendido lê mesclando-se emparelhado frente e reverter leituras com sobreposição de regiões.
  4. Montagem de novo
    1. Usar nativo assembler CLC genomics de novo com uma palavra (ou k-mer) tamanho de 30 nt e um tamanho máximo de bolha de 65 nt para montar uma subamostra aleatória dos 10.000 leituras emparelhadas não sobrepostas. A cobertura esperada para o contig de novo montado é ~ 200 x para uma sequência de ~ 9 kb.
      Nota: Esta diminuição da resolução pode reduzir a carga computacional tal que a maioria dos computadores desktop podem lidar com a montagem e análise e tendo em conta a clonality de cada pró-vírus (uma biblioteca é um pró-vírus), isto não limita a diversidade.
  5. Re-mapeamento de todas as leituras de contigs
    1. Para obter a sequência de consenso final da maioria de cada pró-vírus, mapear o conjunto completo de leitura para o novo de montado contig. Aceitar apenas contigs com uma cobertura mínima média de 1.000 x e garantir que o comprimento final contig corresponde ao tamanho da banda sobre o gel de agarose original (etapa 2.8.1). Salve a sequência de consenso de maioria final como um arquivo de .fasta.
      Nota: a maioria dos contigs pode ser montado usando as etapas acima. No entanto, em alguns casos, para um único pró-vírus, contigs múltiplos com uma cobertura semelhante são montados. Nestas circunstâncias, contigs estão alinhados para um próximo longa-metragem (~ 9 kb) sequência de consenso do mesmo participante e montados manualmente em um único contig. Todas as leituras são então mapeadas para o contig montado manualmente e o consenso final aceite se leia cobertura é o mesmo em todo o conjunto e não único nucleotídeo polimorfismos (SNPs) > 40% estão presentes.
  6. Controle de qualidade mais
    1. Para garantir cada contig representa um único pró-vírus e não é devido a amplificação de provírus múltiplas dentro de um único poço, tela leia cobertura e variante chamada do contig final.
    2. Vários modelos proviral presentes durante a PCR são frequentemente identificados pela cobertura de leitura muito irregular (devido a co amplificação de provírus de tamanhos diferentes) quando o mapeamento para um consenso completo do mesmo participante, ou pela presença de SNPs com um frequência de > 40% (ver resultados representativos, Figura 4). Desconsidere as populações mistas em análises subsequentes.
  7. Alinhamento
    1. Importe o consenso final de cada sequência proviral em sequência software tais como Molecular evolutiva genética análise (MEGA) 721de visualização. Alinhe cada sequência manualmente para a sequência de referência HXB2. Apare a 5' e 3' termina a posições 666-9650 HXB2 remover sequências da primeira demão.
    2. Exportar a lista de sequência no formato fasta e então alinhar usando MAFFT versão 722, com edição manual, se for caso disso obter o alinhamento final.
      Nota: Se as sequências não alinhar, primeira reversa complementar a sequência. Se a sequência não alinhar, realize uma busca de explosão para assegurar que a sequência é HIV-1. É possível amplificar-HIV-1 modelos e estes podem ser identificados nesta fase. Se as sequências são HIV-1 mas não alinhar, considere a presença de inversões (consulte a etapa 6.1).

6. determinar a competência de replicação potenciais de sequências Proviral de VIH-1

Nota: Para identificar sequências de geneticamente intacta e potencialmente replicação competente, provírus HIV-1 que é um processo rigoroso de eliminação seguiram (Figura 1). Proviral sequências inversões de falta, grandes exclusões internas, deletérias parem códons / hipermutação, mutações frameshift, e/ou defeitos no sinal de site ou embalagem de MSD são considerados geneticamente intacta e potencialmente competentes de replicação.

  1. Inversões
    1. Durante a fase de alinhamento, identifica inversões. Inversões são regiões onde a sequência não alinhar com a referência HXB2 a menos que a região é reverter complementado.
      Nota: Dependendo da aplicação dos dados, sequências contendo inversões podem precisar ser omitido de uma análise mais aprofundada.
  2. Grandes exclusões internas
    1. Identificar contigs com exclusões internas grandes (> 600 bp) na fase de alinhamento. A menos que a exclusão se senta dentro nef, a sequência pode ser definida como defeituoso.
      Nota: Qualquer sequências com exclusões internas < 600 bp será identificado pelo Gene Cutter (etapa 6.3.1) como tendo a sequências de genes incompletos.
  3. Códons de parada deletérios, mutações frameshift e exclusões
    1. Verifique todos os contigs de comprimento > 8400 nucleotídeos para a presença de códons de parada deletérios, frameshifts e sequências de genes incompletos usando o Los Alamos National laboratório HIV sequência de banco de dados Gene cortador ferramenta23.
      Nota: A ferramenta de Gene Cutter divide a sequência proviral nos genes gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env e nefe converte-los para aminoácidos. Gene Cutter e telas para a presença de códons de parada e mutações frameshift (devido à inserção e deleção). Contigs contendo códons de parada ou frameshifts em qualquer gene, excluindo nef24, classificam-se como defeituoso. Gene Cutter também identifica sequências de genes incompletos e qualquer provírus com uma exclusão < 600 bp em um gene que não sejam nef pode ser reclassificado como defeituosa devido a uma grande exclusão interna.
  4. Hipermutação
    1. Gere um consenso das restantes sequências proviral completos usando a ferramenta de Los Alamos National Laboratory HIV sequência fabricante de consenso de base de dados (fabricante do simples consenso)25. Adicione a sequência de consenso para o topo de um alinhamento que contém apenas as sequências proviral completos no restantes. Usando este alinhamento e o Los Alamos National Laboratory HIV sequência de banco de dados Hypermut ferramenta26 para identificar APOBEC-induzido G-A Hipermutação nas restantes sequências proviral completos.
  5. Defeitos no MSD e sinal de embalagens
    1. Inspecione todos os restantes contigs por defeitos no MSD e o sinal de empacotamento (região HXB2 670-810), que tornam a sequência proviral com defeito4. Procure um ponto de mutação no site MSD (sequência GT, HXB2 744-745) ou qualquer exclusão em quatro loops do sinal do empacotamento da haste (SL1 SL2 (HXB2 691-734), (HXB2 736-754), SL3 (HXB2 766-779) e SL4 (HXB2 790-810)).

Representative Results

O ensaio de FLIPS amplifica e sequências simples, perto de longa-metragem provírus HIV-1. O protocolo envolve 6 etapas para obter perto sequências proviral completos. Estas etapas incluem: lise de infectados células, PCR aninhado de provírus de HIV-1 (intactos e defeituosos) completos, purificação de DNA e quantificação, sequenciamento de preparação de biblioteca, NGS, e de novo conjunto de sequenciado provírus. O final de cada etapa pode ser considerado um ponto de verificação em que a qualidade do produto (por exemplo, amplificado DNA, DNA purificado, biblioteca de sequenciamento ou sequência) pode ser avaliada antes da próxima etapa. Uma visão geral da avaliação realizada no final de cada etapa e os resultados esperados é descrito abaixo.

Após PCR aninhado, produtos amplificados são executados em um gel de agarose 1% (Figura 3). A qualidade inicial da PCR pode ser determinada pela inspeção de controles positivos e negativos. Poços de controlo negativo contendo o produto amplificado indicam contaminação e poços de controle positivo ausente do produto amplificado indicam amplificação insuficiente. Em seguida, poços contendo produto amplificado são selecionados para o sequenciamento. Para evitar poços que contêm misturas de vários provírus amplificados, somente poços contendo produto amplificado executar a diluição de ponto de extremidade são considerados para sequenciamento. De acordo com a distribuição de Poisson, a diluição de ponto de extremidade é encontrada quando 30% dos poços são positivos para o produto amplificado. A esta diluição, há um 80% chance esses poços contêm um único pró-vírus amplificado. Além disso, poços contendo múltiplos provírus amplificados de comprimentos diferentes podem ser visualizados nesta fase como várias bandas aparecerão no gel. Esses poços não deverá ser seleccionados para sequenciamento (Figura 3).

Após a purificação dos provírus amplificados selecionado para sequenciamento, quantificação garante que nenhum DNA proviral é perdido durante a fase de purificação. Se a concentração de DNA de um amplificado pró-vírus é < 0.2 ng / µ l, a amostra restante no PCR2 placa pode ser purificada. Um posto de controle semelhante ocorre após a preparação da biblioteca, em que cada biblioteca individual é quantificada. Isso garante provírus individuais foram adequadamente fragmentados, marcados e amplificados antes de sequenciamento. Bibliotecas proviral individuais são agrupadas em montantes equimolar a uma concentração final de biblioteca de 4 nM (ou conforme especificado pelo provedor de sequenciamento). Se a concentração de uma biblioteca proviral individual é muito baixa, pode excluir-se do pool de biblioteca do sequenciamento, ou a biblioteca preparado novamente. É realizada uma verificação final da concentração da biblioteca em pool antes de sequenciamento juntamente com confirmando os comprimentos médios de fragmento.

Etapas de controle de qualidade antes da fase de montagem de novo garante a qualidade dos lê usado para montar o contig proviral final. Estas etapas incluem: remoção de sequências de adaptador, aparando de 5' e 3' nucleotídeos, um limite de qualidade rigorosos e desconsiderando leituras curtas. CLC Genomics Workbench pode fornecer relatórios de controle de qualidade que podem ser usados antes para avaliar a qualidade inicial da guia Configurações de aparamento e leituras e depois para determinar se o corte foi suficiente para remover a regiões de baixa qualidade. Além disso, para montagem de novo , a qualidade do contigs montado pode ser avaliada por profundidade suficiente (> 1000 X) e a uniformidade da cobertura (Figura 4A). As populações mistas também podem ser identificadas nesta fase. Misturas de vários provírus completos (~ 9 kb) são identificadas através da presença de SNPs múltiplos com uma frequência superior a 40%, Considerando que as misturas de curtas (contendo uma grande exclusão interna) e provírus completos podem ser identificadas por desigual Leia cobertura após o mapeamento de uma referência de longa-metragem do mesmo participante (Figura 4B).

Dependendo da aplicação, o alinhamento final pode ser visualizado usando ferramentas como o ggtree disponível como um pacote em "r.: A linguagem e ambiente para computação estatística"27. Em um estudo recente, FLIPS foi utilizado para provírus sequência HIV-1 da memória ingênuo, central, transicional e efetoras CD4+ T células isoladas de indivíduos na arte a longo prazo, com o objetivo de identificar se os subconjuntos de célula específica mostraram maiores proporções de geneticamente intacta e potencialmente competentes a replicação de HIV-12. Aqui, uma representação visual das sequências isoladas de um participante deste estudo (participante 2026) é apresentada (Figura 5). Neste participante, a maioria (97%) das sequências foram defeituosa, com sequências intactas encontradas em efetoras e de memória transitória CD4+ T células. Esta ferramenta de visualização é útil para visualizar o número de sequências com grandes exclusões internas e sua posição no genoma. Pode ser anotado mais para indicar sequências com códons de parada deletérios, mutações frameshift e exclusões/mutações do site MSD e/ou sinal de embalagem.

Uma aplicação do ensaio FLIPS é a identificação de geneticamente intactas e potencialmente replicação competente provírus HIV-1. Em um estudo recente de 531 sequências isoladas de CD4+ T células de 6 participantes na arte a longo prazo, 26 (5%) geneticamente intactas provírus de HIV-1 foram identificados2. Os provírus defeituosas restantes incluíam aqueles com sequências de inversão (6%), grandes exclusões internas (68%), códons de parada deletérios/Hipermutação (9%), mutações frameshift (1%) e defeitos do sinal de embalagens e/ou mutações no site MSD (11%) .

Figure 2
Figura 2: Visão geral do fluxo de trabalho para montagem de novo de provírus HIV-1. As principais etapas do fluxo de trabalho incluem: sequência 1) ler o controle de qualidade, 2) mesclando pares sobrepostos, 3) montagem de novo e 4) remapeamento e construção de consenso foram cor vermelha, azul, verde e laranja, respectivamente. Esta figura foi modificada de Hiener et al . 2 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: gel de agarose a exemplo do PCR amplificados provírus HIV-1. Poços, 1, 2, 3, 6, 9 e 10 contêm amplificados provírus HIV-1. Bem 10 contém uma pró-vírus com uma grande exclusão interna, bem 2 contém co amplificação de provírus de HIV-1 dois comprimentos diferentes (mistura) e bem 12 contém controle positivo. Observe a porcentagem de poços que contém o produto amplificado é 60%, o que está acima o percentual necessário para isolar os modelos simples. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: exemplo de saída do mapeamento leitura. (A) exemplo demonstrando mesmo cobertura devido a amplificação de um único pró-vírus completos do HIV-1. Na sequência de montagem de novo , todas as leituras são mapeadas para o contig montado para produzir uma sequência de consenso. A plataforma de software permite que o lê mapeado a inspeccionar para cobertura suficiente e mesmo. (B) exemplo demonstrando co amplificação de provírus de HIV-1 dois comprimentos diferentes (mistura). Para determinar as misturas, leituras são mapeadas para uma sequência de referência completos (~ 9 kb) a partir do mesmo participante e ler mapeamento inspecionado. A presença de cobertura irregular indica uma mistura. Esta figura é reproduzida com permissão da Qiagen14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Visualização de exemplo de HIV-1 proviral sequências isoladas de CD4+ T subconjuntos de um indivíduo na arte de longa duração da pilha. Proviral sequências individuais HIV-1 são representadas por linhas horizontais. Esta figura foi modificada de Hiener et al . 2 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O ensaio de FLIPS é um método eficiente e de alta produtividade para amplificar e single de sequenciamento, perto de longa-metragem provírus HIV-1. Múltiplos fatores e passos críticos no protocolo que influenciam o número e a qualidade das sequências obtidas foram identificados. Em primeiro lugar, o número de células e a frequência de infecção do HIV-1 da população celular influenciaram o número de provírus amplificado. Por exemplo, em uma publicação anterior, aproximadamente metade como muitas sequências foram obtidas com o mesmo número de ingênuo CD4+ T células comparadas a memória efetoras CD4+ T células. Isto é porque ingênuo células geralmente têm uma menor frequência de infecção do que de células efetoras memória2. Em segundo lugar, a lise celular é preferível métodos baseados em colunas de extração para obtenção de DNA genômico como não há nenhum risco de perder o DNA no processo de extração. Por último, tal como acontece com qualquer ensaio baseados em PCR, evitando a contaminação é crítico. Separadas de áreas limpas devem ser designadas para a preparação de misturas de mestre, manipulação de DNA genômico, adicionando controles positivos, purificação de DNA e quantificação e preparação de biblioteca. Isto é particularmente importante para os ensaios de cópia única como a apresentada aqui.

Implementação do ensaio FLIPS primeiro deve incluir executando um controle positivo como plasmídeos pNL4-3, ao invés de amostras de participantes. Isso permitirá que qualquer prévia de solução de problemas para o uso de células positivas do HIV-1, como as sequências obtidas podem ser comparadas com sequências de referência disponível para estes plasmídeos. Ao usar células de HIV-1 positivas, é importante considerar o subtipo do HIV-1 (primeiras demão projetados para FLIPS são específicas para o subtipo B) e a frequência de infecção da população celular, se pouco ou nenhum provírus é amplificado. Sequências da primeira demão podem ser modificado/redesenhado para combinar com outros subtipos. Além disso, um bem que contém um controle positivo deve ser incluído em cada PCR realizado.

FLIPS tem de superar as limitações dos ensaios anteriores de sequenciamento, incluindo SPS. Através de amplificação e sequenciamento perto completos provírus HIV-1, FLIPS podem determinar a potencial replicação-competência de provírus HIV-1. Isto não era possível usar SPS, que sequenciado somente regiões subgenômica e, portanto, selecionados para sequências com sítios de ligação intacta da primeira demão. Além disso, FLIPS supera as limitações associadas utilizando múltiplos amplificação e sequenciamento primers, como foi empregado por sequenciamento completos anteriores ensaios1,4. Através de duas rodadas de PCR, visando as regiões de HIV-1 LTR combinadas com NGS, FLIPS diminui o número e a complexidade das primeiras demão necessária. ALETAS é, portanto, menos suscetível às consequências da primeira demão incompatibilidades, ou seja, a identificação errônea de provírus defeituosos e uma incapacidade para amplificar um provírus dentro de uma população. O protocolo de FLIPS também é mais eficiente e permite um maior rendimento de sequenciamento do que métodos anteriores.

Evidentemente, FLIPS fornece vantagens sobre os métodos existentes que determinam a composição genética de provírus HIV-1. No entanto, é importante reconhecer as limitações de FLIPS. Em primeiro lugar, o ensaio de FLIPS não foi desenvolvido como uma ferramenta para medir o tamanho do reservatório latente HIV-1, como análises para determinar se a FLIPS amplifica todos os presentes em uma população celular de pró-vírus HIV-1 não foram concluídas. ALETAS em vez disso é útil para fazer comparações relativas da composição do reservatório entre populações de célula diferente2. Em segundo lugar, a replicação-competência da intactas provírus HIV-1 não pode ser determinada com certeza na vivo de análise, como aquelas realizadas por Ho et al . 4. em terceiro lugar, FLIPS não foi concebido para determinar o local de integração de provírus HIV-1.

Pequenas variações no protocolo FLIPS podem aumentar a sua aplicação. Por exemplo, mudanças na primeira demão sequências podem permitir diferentes e vários subtipos de HIV-1 para ser amplificado e sequenciados. Sequenciamento dos virions do plasma HIV-1 é possível através da adição de síntese do cDNA antes da PCR aninhado. Futura utilização de métodos de sequenciamento de molécula vai eliminar a necessidade de montagem de novo .

Sequenciamento genético de provírus integrados do HIV-1 tem aumentado nossa compreensão do reservatório latente do HIV-1. ALETAS é uma importante ferramenta para estudos futuros, elucidar a composição e a distribuição do reservatório latente. No entanto, a aplicação de FLIPS pode estender além do reservatório. Estudos futuros podem utilizar FLIPS para determinar objectivos específicos para tecnologia CRISPR-Cas, ou auxiliar na identificação de codificação e regiões não-codificantes que tornar o vírus mais responsivos a latência invertendo os agentes. Recombinação viral pode ser melhor entendida por olhar para os locais de junção de grandes exclusões internas.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado o Delaney AIDS Research Enterprise (DARE) para encontrar uma cura (1U19AI096109 e 1UM1AI126611-01); um amfAR Research Consortium na erradicação do HIV (ARCHE) Collaborative Research Grant de The Foundation for AIDS Research (amfAR 108074-50-RGRL); Centro Australiano para HIV e hepatite Virology Research (ACH2); UCSF-GIVI Center for AIDS Research (P30 AI027763); e o australiano nacionais de saúde e Conselho de pesquisa médica (AAP1061681). Gostaríamos de agradecer o Dr. Joey Lai, genómica Facility Manager no Instituto de pesquisa médica para a sua formação na biblioteca preparação e utilização de suas instalações de Westmead e o centro de Ramaciotti para a genómica (Universidade de New South Wales, Sydney, Austrália) para a realização de sequenciamento. Reconhecemos com gratidão os participantes que doou as amostras para este estudo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 Invitrogen 15568025 Dilute to 5 mM for nested PCR
Nonidet P 40 Substitute solution Sigma 98379
Tween-20 Sigma P9416
Proteinase K Solution (20 mg/mL) Promega AM2548
96 well thermocycler Any 96 well thermocycler can be used
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen 11304011
10x High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] Invitrogen 11304011
50 mM MgSO4 Invitrogen 11304011
PCR Nucleotide Mix, 10 mM Promega C1141
Ultrapure H2O Invitrogen 10977023
PCR1 and PCR2 Primers Desalted. Dilute to (100 µM) with H2O
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear Axygen PCR-96M2-HS-C
Microseal 'B' Adhesive Seals BioRad MSB1001 Required to seal 96 well PCR plates
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). Diluted to 105 copies/mL and used as positive control
PCR plate spinner or benchtop centrifuge
E-GEL 48 1% Agarose Invitrogen G800801 Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide.
DirectLoad Wide Range DNA Marker Sigma D7058 Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Mother E-Base device Invitrogen EBM03 Required for running precast 48 well 1% agarose gels
Gel Doc EZ Gel Documentation System BioRad 1708270 Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used
PlateMax Peelable Heat Sealing Axygen HS-200 Heat sealing film for long term storage
96 Well 0.8 mL Storage Plate ThermoFisher Scientific AB0765 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) Beckman Coulter A63880 Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106)
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology Sigma E7023
Magnetic Stand-96 Invitrogen AM10027
Microplate shaker Optional
Buffer EB Qiagen 19086 Elution buffer
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496 A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
Microplate reader
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-2001
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Biorad HSP9601 Required for Nextera XT DNA library preparation kit
Library Quantification Kit - Illumina/Universal Kapa Biosystems KK4824 Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)
2100 Bioanalyzer Agilent Technology Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit
High Sensistivty DNA kit Agilent Technology 5067-4626
Illumina MiSeq Platform Illumina

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