Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Forstærkning af nær fuld længde HIV-1 provirus for næste Generation Sequencing

Published: October 16, 2018 doi: 10.3791/58016
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Virus Research, The Westmead Institute for Medical Research, University of Sydney

Summary

Fuld længde individuelle proviral sekventering (FLIPS) giver en effektiv og høj overførselshastighed metode til forstærkning og sekventering af enkelt, nær fuld længde (intakt og defekte) HIV-1 provirus og giver mulighed for bestemmelse af deres potentiale replikering-kompetence. FLIPS overvinder begrænsningerne af tidligere assays designet til sekvens latent HIV-1 reservoiret.

Abstract

Fuld-længde individuelle Proviral sekventering (FLIPS) assay er en effektiv og høj overførselshastighed metoden er designet til at forstærke og sekvens enkelt, nær fuld længde (intakt og defekt), HIV-1 provirus. FLIPS giver mulighed for bestemmelse af den genetiske sammensætning af integrerede HIV-1 inden for en celle population. Ved at identificere fejl i HIV-1 proviral sekvenser, der opstår under reverse transkription som store interne sletninger, skadelige stop kodon/hypermutation, frameshift mutationer og mutationer/sletninger i cis handler elementer kræves for virion modning, kan FLIPS identificere integreret provirus stand til replikering. FLIPS assay kan udnyttes til at identificere HIV-1 provirus, der mangler disse mangler og er derfor potentielt replikationskompetente. FLIPS protokollen indebærer: lysis af HIV-1-inficerede celler, indlejret PCR af nær fuld længde HIV-1 provirus (ved hjælp af primere målrettet mod HIV-1-5' og 3' LTR), DNA oprensning og kvantificering, bibliotek forberedelse til næste generation Sequencing (NGS), NGS, de novo forsamling af proviral contigs, og en enkel proces udelukkelsesmetoden til at identificere replikationskompetente provirus. FLIPS giver fordele i forhold til traditionelle metoder designet til sekvens integreret HIV-1 provirus, såsom single-proviral sekventering. FLIPS forstærker og sekvenser nær fuld længde provirus muliggør replikation kompetence skal fastsættes, og også bruger færre forstærkning primere, forebygge konsekvenserne af primer uoverensstemmelser. VIPPER er et nyttigt værktøj til at forstå den genetiske landskab af integrerede HIV-1 provirus, især inden for den latente reservoir, men dens udnyttelse kan udvides til enhver anvendelse, hvor den genetiske sammensætning af integrerede HIV-1 er påkrævet.

Introduction

Genetisk karakterisering af latent HIV-1-reservoiret, som fortsætter i individer på langsigtede antiretroviral behandling (ART), har været afgørende for forståelsen, at størstedelen af integrerede provirus er defekt og replikation-inkompetente1 , 2. i processen med reverse transkription, fejl er indført i den integrerede proviral sekvens. Nogle mekanismer, der genererer defekte proviral sekvenser omfatter den fejlbehæftede HIV-1 omvendt transkriptase enzym3, skabelon skifter4, og/eller APOBEC-induceret hypermutation5,6. To nylige undersøgelser har fundet at ca 5% af HIV-1 provirus isoleret fra enkeltpersoner om langsigtede kunst er genetisk intakt, og potentielt replikationskompetente, og kan bidrage til den hurtige rebound i HIV-1 plasmaniveauer ved ophør af kunst 1 , 2 , 7. tidligere undersøgelser har identificeret, at replikationskompetente HIV-1 provirus persistere i naiv og hvile memory CD4+ T celle subsets (herunder central, overgangsbestemmelser og effektor memory T celler), der angiver betydningen af målretning disse celler i fremtiden udryddelse strategier2,8,9.

Tidlig indsigt i distribution, dynamik og vedligeholdelse af latent HIV-1 reservoiret blev opnået gennem udnyttelse af single-proviral sekventering (SPS) metoder, der genetisk karakteriserer sub-genomisk regioner af HIV-1 genom10 ,11,12,13. SPS er et alsidigt værktøj, at sekventere et enkelt HIV-1 provirus fra inden for en enkelt inficeret celle. SPS er imidlertid ikke afgøre replikation-kompetence af provirus, da det kun sekvenser sub-genomisk regioner og misser provirus, der indeholder store sletninger i primer bindingssteder. En tidligere undersøgelse har vist, at SPS overvurderer størrelsen af den replikationskompetente reservoir af 13 - til 17 - gange gennem selektivt sekventering intakt sub-genomisk regioner2.

At afhjælpe begrænsningerne af SPS, Ho et al. 4 og Bruner et al. 1 udviklet assays til sekvens nær fuld længde HIV-1 provirus. Dette tillod hyppigheden af genetisk intakt, og potentielt replikationskompetente, HIV-1 provirus i individer på langsigtet ART skal fastlægges. Disse assays forstærkes og sekventeret (via Sanger sekventering) sub-genomisk regioner, der blev derefter samles for at opnå en sekvens af (intakt eller defekt) HIV-1 provirus. Tre begrænsninger af denne tilgang er: 1) anvendelsen af flere sekventering primere øger risikoen for utilsigtet Introduktion defekter i proviral rækkefølge, 2) primer uoverensstemmelser kan forhindre forstærkning af særlige provirus, og 3) ofte den hele proviral sekvens ikke kan løses på grund af teknisk detalje af disse metoder.

For at overvinde begrænsningerne af eksisterende fuld længde HIV-1 proviral sekventering assays, udviklet vi Full -Llange jegNDIVIDUELLE Proviral Sequencing (FLIPS) analysen. VIPPER er en næste generation sequencing (NGS)-baseret analyse, som forstærker og sekvenser nær fuld længde (intakt eller defekt) HIV-1 provirus i en høj overførselshastighed og effektiv måde. FLIPS giver fordele i forhold til tidligere assays, da det begrænser antallet af primere udnyttet; Derfor, det mindsker chancen for primer uoverensstemmelser, der kan begrænse befolkningen i provirus fanget eller utilsigtet indføre defekter i en viral sekvens. VIPPER er også mindre teknisk udfordrende end tidligere assays og omfatter 6 vigtigste trin: 1) lysering af HIV-1-inficerede celler, 2) forstærkning af enkelt HIV-1 provirus via indlejrede PCR udføres på begrænsning ved hjælp af primere specifikke for den yderst velbevarede HIV-1 5' og 3' U5 LTR region (figur 1A), 3) rensning og kvantificering af forstærkede produkter, 4) bibliotek forberedelse af forstærkede provirus til NGS, 5) NGS, og 6) de novo samling af sekventeret provirus at få contigs af hver enkelte provirus.

Sekvenser genereret af FLIPS kan underkastes en streng proces udelukkelsesmetoden til at identificere dem, der er genetisk intakt og potentielt replikationskompetente (figur 1 c)2. Genetisk intakt provirus mangler alle kendte fejl, som resulterer i generation af en replikation-inkompetente provirus. Disse defekter omfatter: inversion sekvenser, store interne sletninger, hypermutation/skadelige stop kodon, frameshifts eller mutationer i de 5' emballagen signal eller store splejse donor (MSD) websted.

Figure 1
Figur 1: kritisk trin i fuld længde individuelle proviral sekventering (FLIPS) analysen. (A) HIV-1 DNA genom med primer bindingssteder i 5' og 3' U5 LTR regioner bruges af vipper til at forstærke nær fuld længde (defekt og intakt) HIV-1 provirus via indlejrede PCR. (B) Layout af en 96-brønd PCR plade der indeholder 80 prøve wells (20 brønde for hver fortynding), 4 negative kontrolhullerne og 1 positiv kontrol godt. (C) proces udelukkelsesmetoden bruges til at identificere genetisk intakt, og potentielt replikationskompetente, HIV-1 provirus. Dette tal er blevet ændret fra Hiener et al. 2 . Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle review bestyrelserne på University of California San Francisco og Western Sydney lokale Health District, som omfatter Westmead Institut for medicinalforskning.

1. lysering af HIV-1-inficerede celler

Bemærk: Celler kan isoleres fra perifert blod, leukapheresis prøver, knoglemarvsbiopsi eller væv biopsi. Cellepopulationer kan sorteres ved hjælp af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS).

  1. Forberede en lysisbuffer indeholdende 10 mM Tris-HCl, 0,5% Nonidet P-40, 0,5% Tween-20 og 0,3 mg/mL proteinase K. En celle pellet, tilføje 100 µL af lysisbuffer pr. 1 x 106 celler. Pipetteres op og ned for at blande. Der inkuberes ved 55 ° C i 1 time efterfulgt af 85 ° C i 15 min til lyse celler og frigive genomisk DNA til PCR-amplifikation.
    Bemærk: Celle lysis er tilstrækkelig til at opnå genomisk DNA til forstærkning. Ingen DNA isoleret eller rensning er nødvendig. Protokollen kan afbrydes midlertidigt på dette punkt og genomisk DNA kan opbevares ved-20 ° C på ubestemt tid.

2. forstærkning af enkelt HIV-1 DNA provirus via indlejrede PCR

  1. Bland reagenser til den første runde PCR (PCR1) i tabel 1 anførte (jf. Tabel af materialer). Tilføje 38 µL af master mix til 85 wells (80 prøver, 4 negative kontroller, 1 positiv kontrol) af en 96-brønd PCR plade (Følg layout i figur 1B). Udpege denne plade 'PCR1'.
Reagens Endelig koncentration Lydstyrke for PCR1 plade (µL) Lydstyrke for PCR2 plade (µL)
Fremad Primer 1 ΜM 32.3 23,8
Omvendt Primer 1 ΜM 32.3 23,8
Buffer (10 x) 1 x 323 238
MgSO4 (50 mM) 2 mM 129.2 95.2
dNTP (10 mM) 0.2 mM 64,6 47,6
DNA polymerase (5 U/µL) 0,025 U/ΜL 16.2 11,9
Laves H2O 2632.5 1939.7

Tabel 1: Reagenser og diskenheder for PCR master mix.

Bemærk: De primere, der anvendes til PCR1 er:
BLOuterF: 5'-AAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3' (HXB2 position 623-649)
BLOuterR: 5'-TGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTC-3' (HXB2 position 9662-9686)

  1. Efter udarbejdelsen af master mix, flytte PCR1 pladen til et rent område udpeget for tilsætning af genomisk DNA.
    1. Seriefremstillede fortyndet genomisk DNA fra 1:3 til 1:81 med Tris-HCl (5 mM, pH 8), forberede hver fortynding (nok til 20 brønde for hver fortynding) 45 µL. Tilføje 2 µL fortyndede genomisk DNA til hver prøve godt og 2 µL af Tris-HCl (5 mM, pH 8) til hver negativ kontrol godt (Følg layout i figur 1B). Forsegle alle brønde af den PCR1 plade, bortset fra positivt kontrol godt, ved hjælp af en klar selvklæbende segl (Se Tabel af materialer).
      Note: De ovenstående anbefalede fortyndinger tjener kun som en start guide til bestemmelse af end-point fortynding. Fortyndinger afhænger af koncentrationen af integrerede HIV-1 DNA i prøverne.
  2. Flytte til et område, der er udpeget for tilsætning af positiv kontrol. Tilføje 2 µL af positiv kontrol (pNL4-3 fortyndet til 105 kopier/µL) til den positive kontrol godt af PCR1 pladen og forsegle pladen. Kort spin PCR1 plade i en PCR plate spinner eller centrifugeres (400 x g i 10 s ved stuetemperatur) til at trække ned enhver resterende indhold fra siderne af brøndene.
  3. Opstille PCR1 pladen i en thermocycler: 94 ° C i 2 min. derefter 94 ° C til 30 s, 64 ° C til 30 s, 68 ° C i 10 min til 3 cykler; 94 ° C til 30 s, 61 ° C til 30 s, 68 ° C i 10 min til 3 cykler; 94 ° C til 30 s, 58 ° C til 30 s, 68 ° C i 10 min til 3 cykler; 94 ° C til 30 s, 55 ° C til 30 s, 68 ° C i 10 min til 21 cykler; derefter 68 ° C i 10 min (30 cykler i alt). Hold ved 4 ° C.
    Bemærk: Protokollen kan stå i pause her og PCR1 pladen opbevares ved 4 ° C i op til 2 dage.
  4. Bland reagenser for anden runde af PCR (PCR2) i tabel 1anførte. Tilføje 28 µL til 85 wells (80 prøver, 4 negative kontroller, 1 positiv kontrol) af en ny 96-brønd PCR plade (Følg layout i figur 1B). Udpege denne plade 'PCR2'.

Bemærk: De primere, der anvendes til PCR2 er:
275F: 5'-ACAGGGACCTGAAAGCGAAAG-3' (HXB2 position 646-666)
280R: 5'-CTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACG-3' (HXB2 position 9650-9676)

  1. Kort spin PCR1 plade i en PCR plate spinner eller centrifugeres (400 x g i 10 s ved stuetemperatur) til at trække ned enhver resterende indhold fra siderne af brøndene. Tilsættes 80 µL Tris-HCL (5 mM, pH 8) til hvert hul i PCR1 pladen.
    1. Overføre 2 µL af PCR1 pladen til den PCR2 plade ved hjælp af en multikanalpipette. Sikre, at prøverne overføres klogt i at nå (dvs. 2 µL fra godt A1 PCR1 plade er overført til godt A1 af PCR2 plade). Forsegle PCR2 plade ved hjælp af en klar selvklæbende segl (Se Tabel af materialer).
    2. Kort spin PCR2 plade i en PCR plate spinner eller centrifugeres (400 x g i 10 s ved stuetemperatur) til at trække ned enhver resterende indhold fra siderne af brøndene. Forsegle PCR1 plade med en varmeforsegling film til langvarig opbevaring ved-20 ° C (Se Tabel af materialer).
  2. Opstille PCR2 pladen i en thermocycler: 94 ° C i 2 min. derefter 94 ° C til 30 s, 64 ° C til 30 s, 68 ° C i 10 min til 3 cykler; 94 ° C til 30 s, 61 ° C til 30 s, 68 ° C i 10 min til 3 cykler; 94 ° C til 30 s, 58 ° C til 30 s, 68 ° C i 10 min til 3 cykler; 94 ° C til 30 s, 55 ° C til 30 s, 68 ° C i 10 min til 31 cykler; derefter 68 ° C i 10 min (40 cyklusser i alt). Hold ved 4 ° C.
    Bemærk: Protokollen kan stå i pause her og PCR2 pladen opbevares ved 4 ° C i op til 2 dage.
  3. Kort spin PCR2 plade i en PCR plate spinner eller centrifuge til at trække ned enhver resterende indhold fra siderne af brøndene. Tilsættes 60 µL af Tris-HCl (5 mM, pH 8) til hver brønd med en multikanalpipette.
    1. Køre 15 µL af hver brønd på 2 x 48-godt præfabrikerede 1% agarosegelitris indeholdende ethidiumbromid (0.1\u20120.3 µg/mL, se Tabel af materialer). Bruge en stige med en rækkevidde op til 10 kb (Se Tabel af materialer). Visualisere for at identificere de brønde, der indeholder den forstærkede produkt og deres omtrentlige størrelser. Gemme gel billede.
      Bemærk: Sørg for den positive kontrol godt indeholder forstærket produkt. Hvis negative kontrolhullerne indeholder forstærket produkt, overveje forurening og se bort fra pladen.
  4. Bestemme den fortynding, som ikke mere end 30% af brønde er positive for forstærket produkt.
    Bemærk: Dette er den end-point fortynding, hvor et flertal (80%) af brønde indeholder forstærket produkt fra en enkelt skabelon. Denne fortynding skal fremstilles og anvendes i efterfølgende PCR'er for at indhente yderligere proviral amplikoner. Optage den omtrentlige størrelse af hver forstærket produkt.

3. DNA oprensning og kvantificering

  1. Kort spin PCR2 plade i en PCR plate spinner eller centrifuge til at trække ned enhver resterende indhold fra siderne af brøndene. Overføre 40 µL fra brøndene indeholdende forstærket produkt (på eller under end-point fortynding) til en ny 96-brønd midi plade (med et godt antal 0,8 mL, se Tabel af materialer).
    Bemærk: Nedskrive oprindelige og nye godt stilling hver forstærket produkt i et regneark som en post for hver forstærket produkt at blive sekventeret.
  2. Rense det amplificerede DNA produkter ved hjælp af en magnetisk bead baseret PCR rensning kit (se tabel af materialer) for at fjerne primere, nukleotider, enzymer, olier og salte. Før du starter, bringe magnetiske perler til stuetemperatur og forberede friske 80% ethanol. Bruge nye pipette tips når det er hensigtsmæssigt at undgå krydskontaminering af DNA-prøver.
    1. Vortex magnetiske perler til at sikre, at de er grundigt genopslemmes. Ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 40 µL af perler til de 40 µL af forstærkede produkt i 0,8 mL 96-brønd midi plade. Forsigtigt pipetteres op og ned 10 gange for at blande. Alternativt, bland løsningen ved forsegling pladen derefter ryster på en mikrotiterplade shaker ved 1800 rpm i 2 min. Incubate ved stuetemperatur i 5 min.
    2. Sted plade på en magnetisk stå (Se Tabel af materialer) for 2 min. Fjern og kassér supernatanten.
    3. Vaske perlerne ved at tilføje 200 µL 80% ethanol til hver brønd med plade på standen. Inkuber ved stuetemperatur i 30 s. Fjern og supernatanten. Gentag én gang. Ved hjælp af en multikanalpipette med fine tips, fjerne eventuelle overskydende ethanol efter den anden vask. Med plade på standen, tillade perler til luft tørre for 15 min.
    4. Fjerne pladen fra standeren. Tilføj 30 µL af eluering buffer (Se Tabel af materialer) til hver brønd. Forsigtigt pipetteres op og ned 10 gange for at blande. Alternativt, bland løsningen ved forsegling pladen derefter ryster på en mikrotiterplade shaker ved 1800 rpm i 2 min. Incubate ved stuetemperatur i 2 min.
    5. Pladen anbringes på en magnetisk stå i 2 min. ved hjælp af en multikanalpipette, overføre 25 µL af supernatanten (oprenset DNA) til en ny 96-brønd PCR plade. Sikre, at prøverne overføres godt til godt (dvs. supernatanten af godt A1 i 0,8 mL plade er overført til godt A1 af nye 96-brønd plade).
      Bemærk: 5 uL den eluted prøve er efterladt til at sikre nogen overførsel af resterende rensning perler.
  3. Fastslå og registrere den omtrentlige koncentration af hver amplificerede DNA produkt efter rensning ved hjælp af et spektrofotometer (absorbans ved en bølgelængde på 260 nm).
    Bemærk: Måling den omtrentlige koncentration af hver forstærket produkt er nødvendige på dette stadium at sikre ingen prøver er tabt under rensning trin og at den omtrentlige koncentration er inden for rækkevidde af standardkurven bruges i den næste fase ( 0,001 – 1 ng/µL DNA i 100 µL af volumen). Protokollen kan stå i pause her og renset prøver kan opbevares ved-20 ° C i op til 6 måneder.
  4. Kvantificere koncentrationen af DNA af hver renset produkt ved hjælp af en dsDNA kvantificering kit (se tabel af materialer).
    Bemærk: Det indebærer at bruge en standardkurven til at bestemme koncentrationen af dsDNA i en prøve. Sættet indeholder buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), en lamda dsDNA standard og et fluorescerende farvestof. Holde alle reagenser på is. Dække det rør, der indeholder farvestof med folie for at undgå udsættelse for lys. Mål koncentrationen af hver forstærket produkt i tre eksemplarer.
    1. Fortyndet buffer til 1 x i sterilt DNase gratis H2O. tilføje 99 µL af buffer til et passende antal tomme wells (3 gange antallet af forstærkede produkter skal måles, se tabel 2 for et eksempel layout) af en flad bund vævskultur plade. Tilføje 100 µL af buffer til 3 tomme brønde.
    2. For hver forstærket produkt skal måles, tilføje 1 µL af oprenset DNA (fra trin 3.2.5) i tre eksemplarer til hver godt indeholdende buffer (Se tabel 2 for et eksempel layout).
    3. For at forberede standarder, fortyndes lamda dsDNA 10-fold fra 2 ng/µL til 0,002 ng / µL. Tilsæt 100 µL af hver dsDNA standard 3 brønde.
      Bemærk: Efter trin 3.4.4, den endelige koncentration af standarderne vil variere fra 1 til 0,001 ng/µL
    4. Fortynd fluorescerende farvestof 1:200 med buffer. Hurtigt tilføje 100 µL til hver godt indeholder prøven, tomme og standarder. Mix op og ned med en pipette. Dække pladen med folie for at undgå kontakt med lys.
    5. Læs fluorescens emission på en mikrotiterplade læser (excitation på 480 nm, emission ved 520 nm). Registrere resultaterne i et regneark.
    6. Bestemme koncentrationen af dsDNA i hver prøve ved hjælp af fluorescens målingen registreres. Subtrahere fluorescens målt i de tomme wells fra prøven og standarder. Bestemme den gennemsnitlige fluorescens til hver prøve og standard fra tre. Tegne en standardkurve, der er baseret på fluorescens målinger af standarderne. Bestemme koncentrationen af prøver i forhold til standarderne.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Standard (1 ng/mL) Standard (0,1 ng/mL) Standard (0,01 ng/mL) Standard (0,001 ng/mL) Tom
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL buffer
B Standard (1 ng/mL) Standard (0,1 ng/mL) Standard (0,01 ng/mL) Standard (0,001 ng/mL) Tom
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL buffer
C Standard (1 ng/mL) Standard (0,1 ng/mL) Standard (0,01 ng/mL) Standard (0,001 ng/mL) Tom
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL buffer
D Prøve 1: Prøve 2: Eksempel 3: Eksempel 4: Eksempel 5: Eksempel 6: Eksempel 7: Eksempel 8: Eksempel 9: Eksempel 10: Eksempel 11: Prøven 12:
1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer
E Prøve 1: Prøve 2: Eksempel 3: Eksempel 4: Eksempel 5: Eksempel 6: Eksempel 7: Eksempel 8: Eksempel 9: Eksempel 10: Eksempel 11: Prøven 12:
1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer
F Prøve 1: Prøve 2: Eksempel 3: Eksempel 4: Eksempel 5: Eksempel 6: Eksempel 7: Eksempel 8: Eksempel 9: Eksempel 10: Eksempel 11: Prøven 12:
1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer
G
H

Tabel 2: Eksempel layout af 96-brønd plade til kvantificering af dsDNA.

  1. Fortynd hver renset produkt (fremstillet i trin 3.2.5) med H2O til 0,2 ng/µL.

4. sekventering bibliotek forberedelse

  1. Forberede forstærket og renset proviral DNA til NGS ved hjælp af en NGS DNA bibliotek forberedelse kit (Se Tabel af materialer). Følg producentens anvisninger for alle tagmentation, PCR-amplifikation og oprydning trin [bortset fra at reaktionen diskenheder herunder input DNA (fra trin 3.5) kan halveres for at udvide brugen af biblioteket forberedelse reagenser].
  2. Normalisere biblioteker manuelt ved hjælp af en qPCR-baserede NGS bibliotek kvantificering kit (Se Tabel af materialer) for at bestemme koncentrationen af provirus de enkelte. Kombinere individuelle provirus biblioteker i equimolar beløber sig til en endelig koncentration på 4 nM, eller som angivet af udbyderen af sekventering.
    Bemærk: Protokollen kan blive standset her og poolet biblioteket opbevares ved-20 ° C.
  3. Kvantificere den endelige poolede bibliotek ved hjælp af samme dsDNA kvantificering kit bruges i trin 3.4. Følg producentens anvisninger. Bestemme den gennemsnitlige fragment længder af løb 1 µL af poolede biblioteket på en automatiseret elektroforese system ved hjælp af en passende kit (Se Tabel af materialer). Bruge koncentration og gennemsnitlige fragment længder til at bestemme molariteten af poolede biblioteket.
  4. Kombiner 5 µL af poolede biblioteket med 5 µL af 0,2 N NaOH til at denaturere biblioteket. Tilsæt 5 µL af 200 mM Tris-HCl til at neutralisere. Fortynd den endelige bibliotek til kl. 5 pM med kølet hybridisering buffer (tilgængelig med DNA bibliotek forberedelse kit) umiddelbart før sekvensering.
  5. Udføre 2 x 150 nukleotid (nt) parret ende sekventering på en passende NGS platform (Se Tabel af materialer).
    Bemærk: Når 96 proviral biblioteker er indekseret pr. løb, dette giver cirka 20 millioner parret ende læser per run eller 200.000 læser per individuelle provirus bibliotek for analyse efter de multiplexing. Trin 4.4 og 4.5 udføres typisk af en sekventering facilitet.

5. De Novo forsamling af sekventeret HIV-1 provirus

Bemærk: For at opnå den genetiske sekvens af hver forstærket provirus, contigs er samlet de novo fra parret ende læser. Mange platforme (fx, CLC genomforskning Workbench14), giver mulighed for design af brugerdefinerede arbejdsprocesser for de novo forsamling. Andre open source-software som FastQC15, Trimmomatic16, Cutadapt17og FLASH18 kan også udnyttes til forarbejdning læser, samt værktøjer som Bowtie219 og spar20 Læs kortlægning og de novo forsamling. Trin til de novo samling af HIV-1 contigs ved hjælp af en specifik kommerciel platform (Se Tabel af materialer) er skitseret nedenfor (figur 2). Tilpassede arbejdsproces fil er tilgængelig efter anmodning.

  1. Importere sekvenser og kontrollere kvaliteten: Import den parrede sekvens lyder (i fastq.gz format) til den software, der vil derefter kombineres som enkelt sæt parrede læser. Generere en sekvens QC betænkning og undersøge kvaliteten af dine data.
  2. Kvalitetskontrol
    1. Udføre Læs trimning Ifølge rapporten QC. Fjern eventuelle adapter sekvenser og tvetydige nukleotider. Trim femten 5' og to 3' terminal nukleotider. Kassér læser mindre end 50 nukleotider i længde. Bruge en strenge kvalitet grænse på 0,001 svarende til en QC Jytte score af 30.
  3. Fletning af overlappende par
    1. Danne enkelt udvidet læser ved at flette parrede frem og bak læser med overlappende områder.
  4. De novo forsamling
    1. Bruge native CLC genomforskning de novo assembler med et ord (eller k-mer) størrelse 30 nt og en maksimal boblestørrelse 65 nt til at samle en tilfældigt udvalgt delprøve af 10.000 ikke-overlappende parrede læser. Den forventede dækning for de novo samlet contig er ~ 200 x for en ~ 9 kb sekvens.
      Bemærk: Denne undersampling kan reducere den beregningsmæssige byrde således, at de fleste almindelige stationære computere kan håndtere forsamling og analyse, og i betragtning af clonality af hver provirus (ét bibliotek er en provirus), dette begrænser ikke mangfoldigheden.
  5. Re kortlægning alle læser til contigs
    1. At opnå den endelige flertal konsensus sekvens af hver provirus, tilknyttes de novo fuld Læs sættet samlet contig. Accepterer kun contigs med minimum gennemsnitlig dækning af 1.000 x og sikre den endelige contig længde svarer til størrelsen af bandet på den oprindelige agarosegel (trin 2.8.1). Gemme den endelige flertal konsensus sekvens som en .fasta.
      Bemærk: De fleste contigs kan samles ved hjælp af trinene ovenfor. Dog i nogle tilfælde, for en enkelt provirus, er flere contigs med en lignende dækning samlet. Under disse omstændigheder contigs er justeret til en i nærheden af fuld længde (~ 9 kb) konsensus sekvens fra samme deltager og manuelt samlet i en enkelt contig. Alle læser knyttes derefter til den manuelt forsamlede contig og den endelige konsensus accepteret hvis Læs dækningen er endda hele forsamlingen og ingen enkelt nucleotid polymorfier (SNPs) > 40% er til stede.
  6. Yderligere kvalitetskontrol
    1. For at sikre hver contig repræsenterer en enkelt provirus, og er ikke på grund af forstærkningen af flere provirus inden for en enkelt brønd, læse skærmen dækning og variant kald af den endelige contig.
    2. Flere proviral skabeloner til stede under PCR identificeres ofte af meget uensartet Læs dækning (på grund af co forstærkningen af provirus i forskellige størrelser) Hvornår kortlægning til en fuld-længde konsensus fra den samme deltager eller ved tilstedeværelsen af SNPs med en hyppigheden af > 40% (Se repræsentative resultater, figur 4). Se bort fra blandede befolkninger i efterfølgende analyser.
  7. Justering
    1. Importere den endelige konsensus af hver proviral sekvens til sekvens visning software som Molekylær evolutionær genetik analyse (MEGA) 721. Juster hver sekvens manuelt til HXB2 reference sekvens. Trim 5' og 3' slutter til positioner 666-9650 i HXB2 til at fjerne primer sekvenser.
    2. Eksportere listen sekvens i fasta format og derefter justere ved hjælp af MAFFT version 722, med manuel redigering eventuelt at opnå den endelige justering.
      Bemærk: Hvis nogen sekvenser ikke justere, første reverse supplere sekvensen. Hvis sekvensen ikke justerer stadig udføre en BLAST søgning for at sikre sekvensen er HIV-1. Det er muligt at forstærke ikke-HIV-1 skabeloner og disse kan identificeres på nuværende tidspunkt. Hvis sekvenser er HIV-1, men ikke justere overveje tilstedeværelsen af inversioner (Se trin 6.1).

6. bestemmelse af potentielle replikering kompetenceudvikling af HIV-1 Proviral sekvenser

Bemærk: For at identificere sekvenser af genetisk intakt, og potentielt replikationskompetente, HIV-1 provirus en strenge proces udelukkelsesmetoden er fulgt (figur 1 c). Proviral sekvenser mangler inversioner, store interne sletninger, skadelige stop kodon / hypermutation, frameshift mutationer, og/eller mangler i MSD websted eller pakning signal anses for genetisk intakt og potentielt replikationskompetente.

  1. Inversioner
    1. Identificere inversioner stadiet justering. Inversioner er områder hvor sekvensen ikke justerer til reference HXB2 medmindre området bliver reverse suppleret.
      Bemærk: Afhængigt af anvendelsen af dataene muligvis sekvenser der indeholder inversioner udelades fra yderligere analyse.
  2. Store interne sletninger
    1. Identificere contigs med store interne sletninger (> 600 bp) i justering fase. Medmindre sletningen sidder inden for nef, kan rækkefølgen defineres som defekt.
      Bemærk: Enhver sekvenser med interne sletninger < 600 bp vil blive identificeret af genet Cutter (trin 6.3.1) som havende ufuldstændige gensekvenser.
  3. Skadelige stop kodon, frameshift mutationer og sletninger
    1. Tjek alle contigs længde > 8400 nukleotider for tilstedeværelse af skadelig stop kodon, frameshifts og ufuldstændige gensekvenser ved hjælp af Los Alamos National Laboratory HIV sekvens databasen gen kutteren værktøj23.
      Bemærk: Værktøjet genet Cutter opdeler den proviral sekvens i gener gag, pol, vif, benzindampgenvinding, tat, rev, vpu, env, og nef, og oversætter dem til aminosyrer. Genet Cutter så skærme for tilstedeværelsen af stop kodon og frameshift mutationer (på grund af indrykninger eller sletninger). Contigs som indeholder stop kodon eller frameshifts i nogen gen, undtagen nef24, klassificeres som defekt. Genet Cutter identificerer også ufuldstændige gensekvenser og enhver provirus med en sletning < 600 bp i et gen end nef kan omklassificeres som defekte på grund af en stor intern sletning.
  4. Hypermutation
    1. Generere en konsensus af de resterende fuld længde proviral sekvenser ved hjælp af Los Alamos National Laboratory HIV Sequence Database konsensus Maker værktøj (simpel konsensus maker)25. Tilføje konsensus sekvens til toppen af en justering, der indeholder de resterende fuld længde proviral sekvenser. Ved hjælp af denne tilpasning og Los Alamos National Laboratory HIV Sequence Database Hypermut værktøj26 at identificere APOBEC-induceret G-en hypermutation i de resterende fuld længde proviral sekvenser.
  5. Defekter i MSD og emballage signal
    1. Undersøg hvert af de resterende contigs for defekter i MSD og emballage signal (HXB2 region 670-810), der gør proviral sekvens defekte4. Kigge efter en punkt mutation i MSD websted (sekvens GT, HXB2 744-745) eller enhver sletning i de fire stammer sløjfer af emballage signal (SL1 (HXB2 691-734), SL2 (HXB2 736-754), SL3 (HXB2 766-779), og SL4 (HXB2 790-810)).

Representative Results

FLIPS assay forstærker og sekvenser, enkelt, i nærheden af fuld længde HIV-1 provirus. Protokollen indebærer 6 trin til at opnå nær fuld længde proviral sekvenser. Disse skridt omfatter: lysis af inficerede celler, indlejrede PCR fuld længde (intakt og defekte) HIV-1 provirus, DNA oprensning og kvantificering, sekventering bibliotek forberedelse, NGS, og de novo forsamling af sekventeret provirus. I slutningen af hvert trin kan betragtes som en kontrolpost, hvor kvaliteten af produktet (f.eks. amplificeret DNA, oprenset DNA, sekventering bibliotek eller sekvens) kan vurderes før det næste skridt. En oversigt over vurderingen udført i slutningen af hvert trin og de forventede resultater er skitseret nedenfor.

Efter indlejrede PCR forstærket produkter kører på en 1%-agarosegel (figur 3). Den oprindelige kvalitet af PCR kan bestemmes ved inspektion af negative og positive kontrol. Negativ kontrol wells forstærket produkt indeholdende indikerer forurening og positive kontrolhullerne fraværende af forstærkede produkt angiver utilstrækkelig forstærkning. Næste, wells forstærket produkt indeholdende udvælges til sekvensering. For at undgå brønde, der indeholder blandinger af flere forstærkede provirus, anses kun wells indeholdende forstærket produkt køre på end-point fortynding til sekvensering. Ifølge Poisson-fordelingen, er end-point fortynding fundet når 30% af brønde er positive for forstærket produkt. På denne fortynding, der er en 80% chance for disse brønde indeholder en enkelt forstærket provirus. Derudover kan brønde, der indeholder flere forstærkede provirus af forskellige længder visualiseres på dette stadium, som flere bands vil vises på gelen. Disse brønde skal ikke vælges for sekventering (figur 3).

Efter rensning af de forstærkede provirus valgt til sekvensering, kvantificering sikrer, at ingen proviral DNA er tabt under rensning fase. Hvis DNA-koncentrationen af en forstærket provirus er < 0,2 ng/µL, den resterende prøve i den PCR2 plade kan renses. En lignende checkpoint opstår efter bibliotek forberedelse, hvor hvert enkelt bibliotek er kvantificeret. Dette sikrer individuelle provirus er blevet behørigt fragmenteret, markeret og forstærket før sekvensering. Enkelte proviral biblioteker er samlet i equimolar beløber sig til en afsluttende bibliotek koncentration af 4 nM (eller som angivet af sekventering udbyder). Hvis koncentrationen af et enkelt proviral bibliotek er for lavt, det kan udelukkes fra sekventering bibliotek pool, eller det enkelte bibliotek forberedt igen. En sidste kontrol af koncentrationen af poolede biblioteket er udført før sekventering sammen med bekræfter den gennemsnitlige fragment længder.

Kvalitetskontrol trin før de novo forsamling fase sikrer kvaliteten af læser bruges til at samle den endelige proviral contig. Disse skridt omfatter: fjernelse af adapter sekvenser, trimning af 5' og 3' nukleotider, en stringent kvalitet grænse, og ses der bort fra kort læser. CLC genomforskning Workbench kan give kvalitetskontrol rapporter, der kan bruges før til at vurdere den oprindelige kvalitet af læser og guide trimning indstillinger, og derefter efter til at bestemme, hvis renskæring var tilstrækkelige til at fjerne lav kvalitet regioner. Derudover til de novo forsamling, kvaliteten af den samlede contigs kan vurderes for tilstrækkelig dybde (> 1000 X) og jævnhed af dækning (figur 4A). Blandede befolkninger kan også identificeres på dette tidspunkt. Blandinger af flere fuld længde (~ 9 kb) provirus identificeres ved tilstedeværelsen af flere SNPs med en frekvens på mere end 40%, hvorimod blandinger af kort (der indeholder en stor indre sletning) og fuld-længde provirus kan identificeres af ujævn Læs dækningen efter kortlægning til en fuld-længde reference fra samme deltageren (figur 4B).

Afhængigt af programmet, kan den endelige justering visualiseres ved hjælp af værktøjer som ggtree tilgængelig som en pakke i "R: A sprog og miljø for statistisk databehandling"27. I en nylig undersøgelse, FLIPS blev udnyttet til sekvens HIV-1 provirus fra naiv, central, overgangsbestemmelser, og effektor memory CD4+ T celler isoleret fra enkeltpersoner på langsigtet ART, med formålet at identificere, hvis særlige celle subsets viste højere proportioner af genetisk intakt og potentielt replikationskompetente HIV-12. Her præsenteres visuel repræsentation af de sekvenser, der er isoleret fra en deltager i denne undersøgelse (deltager 2026) (figur 5). I denne deltager, fleste (97%) af sekvenser var defekt, med intakt sekvenser findes i effektor og midlertidige hukommelse CD4+ T celler. Denne visualisering værktøj er nyttigt til at vise antallet af sekvenser med store interne sletninger og deres position i genomet. Det kan blive kommenteret yderligere for at angive sekvenser med skadelige stop kodon, frameshift mutationer og sletninger/mutationer i MSD websted og/eller emballage signal.

Én ansøgning af FLIPS assay er identifikation af genetisk intakt og potentielt replikationskompetente HIV-1 provirus. I en nylig undersøgelse af 531 sekvenser isoleret fra CD4+ T celler fra 6 deltagere på langsigtet ART, 26 (5%) genetisk intakt HIV-1 provirus blev identificeret2. De resterende defekte provirus inkluderet dem med inversion sekvenser (6%), store interne sletninger (68%), skadelige stop kodon/hypermutation (9%), frameshift mutationer (1%) og defekter i emballage signal og/eller mutationer i MSD websted (11%) .

Figure 2
Figur 2: Oversigt over arbejdsgangen for de novo forsamling af HIV-1 provirus. De vigtigste trin i arbejdsprocessen omfatter: 1) sekvens læse kvalitetskontrol, 2) fletning overlappende par, 3) de novo forsamling, og 4) remapping og konsensusskabelse har været farvet rød, blå, grøn og orange, henholdsvis. Dette tal er blevet ændret fra Hiener et al. 2 . Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: eksempel agarosegel af PCR forstærket HIV-1 provirus. Hul 1, 2, 3, 6, 9 og 10 indeholder forstærket HIV-1 provirus. Godt 10 indeholder en provirus med en stor intern sletning, godt 2 indeholder Co forstærkning af to HIV-1 provirus af forskellige længder (blanding) og godt 12 indeholder positive kontrol. Bemærk procent af brønde forstærket produkt indeholdende er 60%, hvilket er over den procentdel, der kræves for at isolere enkelt skabeloner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: eksempel output af Læs kortlægning. (A) eksempel demonstrerer jævn dækning på grund af forstærkningen af en enkelt fuld længde HIV-1 provirus. Efter de novo forsamling tilknyttes alle læser de forsamlede contig til at producere en konsensus sekvens. Softwareplatform giver mulighed for de tilknyttede læser skal inspiceres for tilstrækkelig og endda dækning. (B) eksempel demonstrerer Co forstærkning af to HIV-1 provirus af forskellige længder (blanding). Bestem blandinger, er læser knyttet til en fuld-længde (~ 9 kb) reference sekvens fra den samme deltager og læse kortlægning inspiceret. Tilstedeværelsen af ujævn dækning angiver en blanding. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Qiagen14. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Eksempel visualisering af HIV-1 proviral sekvenser isoleret fra CD4+ T celle subsets fra en person på langsigtet ART. Individuelle HIV-1 proviral sekvenser er repræsenteret af streger. Dette tal er blevet ændret fra Hiener et al. 2 . Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

FLIPS assay er en effektiv og høj overførselshastighed metode for uddybning og sekventering single, i nærheden af fuld længde HIV-1 provirus. Flere faktorer og kritiske trin i protokollen, der har indflydelse på antallet og kvaliteten af de sekvenser, der er opnået er blevet identificeret. For det første påvirke antallet af celler og HIV-1 infektion hyppighed af befolkningens celle antallet af provirus forstærkes. For eksempel, i en tidligere publikation, cirka halvt så mange sekvenser blev indhentet fra de samme antal naive CD4+ T celler i forhold til effektor memory CD4+ T celler. Dette er fordi naive celler har typisk et lavere infektion hyppighed end effektor hukommelse celler2. For det andet, celle lysis er at foretrække frem for kolonne-baseret udvindingsmetoder for at opnå genomisk DNA, som der ikke er nogen risiko for at miste DNA i udpakningsprocessen. Endelig, som med enhver PCR-baseret analyse, forebyggelse af forurening er kritisk. Adskilte rengøre områder bør udpeges til at forberede master mix, håndtering af genomisk DNA, tilføje positive kontroller, DNA oprensning og kvantificering og bibliotek forberedelse. Dette er især vigtigt for enkelt-kopi assays som den præsenteres her.

Gennemførelsen af FLIPS analysen bør først omfatter kører en positiv kontrol såsom pNL4-3 plasmider snarere end deltager prøver. Dette gør det muligt for enhver fejlfinding forud for brugen af HIV-1 positive celler, som de sekvenser fremstillet kan sammenlignes med tilgængelige reference sekvenser for disse plasmider. Når du bruger HIV-1 positive celler, er det vigtigt at overveje undertypen HIV-1 (primere designet for FLIPS er specifikke for subtype B) og infektion hyppighed af cellen befolkningen hvis lidt at ingen provirus forstærkes. Primer sekvenser kan blive ændret/redesigned at matche andre undertyper. Derudover bør et godt indeholdende en positiv kontrol indgå i alle PCR udføres.

FLIPS har overvinde begrænsningerne af tidligere sekventering assays, herunder SPS. Gennem uddybning og sekventering nær fuld længde HIV-1 provirus, kan FLIPS bestemme den potentielle replikation-kompetence af HIV-1 provirus. Dette var ikke muligt at bruge SPS, som sekventeret kun sub-genomisk regioner og derfor valgt for sekvenser med intakt primer bindingssteder. Derudover FLIPS overvinder de begrænsninger i forbindelse med udnytter flere forstærkning og sekventering primere, som var ansat ved tidligere fuld længde sekventering assays1,4. Gennem to runder af PCR målretning HIV-1 LTR regioner kombineret med NGS, nedsætter FLIPS antallet og kompleksiteten af primere kræves. VIPPER er derfor mindre modtagelige for konsekvenserne af primer uoverensstemmelser, nemlig en fejlagtig identifikation af defekte provirus og manglende evne til at forstærke nogle provirus inden for en befolkning. FLIPS protokol er også mere effektive og giver mulighed for en højere overførselshastighed på sekventering end tidligere metoder.

Åbenbart, FLIPS giver fordele i forhold til eksisterende metoder, der bestemmer den genetiske sammensætning af HIV-1 provirus. Det er imidlertid vigtigt at anerkende begrænsninger af vipper. For det første er FLIPS analysen ikke udviklet som et redskab til måling af størrelsen af den latent HIV-1 reservoir, som analyser til at bestemme, om FLIPS forstærker alle HIV-1 provirus findes i en celle befolkning ikke er afsluttet. FLIPS bruges i stedet for relative sammenligninger af sammensætningen af reservoir mellem forskellige celle populationer2. For det andet, replikation-kompetence af intakt HIV-1 provirus kan ikke bestemmes med sikkerhed uden i vivo analyser, som dem, der udføres af Ho et al. 4. for det tredje, FLIPS er ikke designet til at bestemme webstedet integration af HIV-1 provirus.

Mindre variationer i FLIPS protokollen kan øge sin ansøgning. For eksempel, ændringer i primer sekvenser kan tillade forskellige og flere HIV-1 undertyper skal forstærkes og sekventeret. Sekventering af plasma HIV-1 virioner er muligt gennem tilsætning af cDNA syntese før indlejrede PCR. Fremtidige udnyttelse af enkelt molekyle sekventering metoder vil fjerne behovet for de novo forsamling.

Genetiske sekventering af integrerede HIV-1 provirus har øget vores forståelse af latent HIV-1 reservoiret. VIPPER er et vigtigt redskab for fremtidige undersøgelser belyse sammensætning og fordeling af den latente reservoir. Dog kan anvendelse af FLIPS overskride reservoiret. Fremtidige studier kan udnytte vipper for at fastlægge særlige mål for CRISPR-Cas teknologi, eller bistå med identificering af kodning og ikke-kodende regioner, som gør virussen mere lydhøre over for ventetid vende agenter. Viral rekombination kan blive bedre forstået ved at se på krydset steder af store interne sletninger.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet Delaney AIDS forskning Enterprise (turde) at finde en kur (1U19AI096109 og 1UM1AI126611-01); en amfAR forskningskonsortium på HIV udryddelse (ARCHE) kollaborative forskning tilskud fra The Foundation for AIDS Research (amfAR 108074-50-RGRL); Australske Center for HIV og Hepatitis virologi forskning (ACH2); UCSF-GIVI Center for AIDS Research (P30 AI027763); og den australske National sundhed og Medical Research Council (AAP1061681). Vi vil gerne takke Dr. Joey Lai, genomforskning Facility Manager på Westmead Institut for medicinalforskning for hans uddannelse i biblioteket forberedelse og brug af sin facilitet og Ramaciotti Center for genomforskning (University i New South Wales, Sydney, Australien) for at gennemføre sekvensering. Vi accepterer med taknemmelighed de deltagere, der donerede prøver for denne undersøgelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 Invitrogen 15568025 Dilute to 5 mM for nested PCR
Nonidet P 40 Substitute solution Sigma 98379
Tween-20 Sigma P9416
Proteinase K Solution (20 mg/mL) Promega AM2548
96 well thermocycler Any 96 well thermocycler can be used
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen 11304011
10x High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] Invitrogen 11304011
50 mM MgSO4 Invitrogen 11304011
PCR Nucleotide Mix, 10 mM Promega C1141
Ultrapure H2O Invitrogen 10977023
PCR1 and PCR2 Primers Desalted. Dilute to (100 µM) with H2O
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear Axygen PCR-96M2-HS-C
Microseal 'B' Adhesive Seals BioRad MSB1001 Required to seal 96 well PCR plates
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). Diluted to 105 copies/mL and used as positive control
PCR plate spinner or benchtop centrifuge
E-GEL 48 1% Agarose Invitrogen G800801 Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide.
DirectLoad Wide Range DNA Marker Sigma D7058 Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Mother E-Base device Invitrogen EBM03 Required for running precast 48 well 1% agarose gels
Gel Doc EZ Gel Documentation System BioRad 1708270 Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used
PlateMax Peelable Heat Sealing Axygen HS-200 Heat sealing film for long term storage
96 Well 0.8 mL Storage Plate ThermoFisher Scientific AB0765 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) Beckman Coulter A63880 Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106)
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology Sigma E7023
Magnetic Stand-96 Invitrogen AM10027
Microplate shaker Optional
Buffer EB Qiagen 19086 Elution buffer
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496 A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
Microplate reader
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-2001
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Biorad HSP9601 Required for Nextera XT DNA library preparation kit
Library Quantification Kit - Illumina/Universal Kapa Biosystems KK4824 Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)
2100 Bioanalyzer Agilent Technology Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit
High Sensistivty DNA kit Agilent Technology 5067-4626
Illumina MiSeq Platform Illumina

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruner, K. M., et al. Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection. Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).
  2. Hiener, B., et al. Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants. Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).
  3. Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication. Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).
  4. Ho, Y. C., et al. Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure. Cell. 155 (3), 540-551 (2013).
  5. Harris, R. S., et al. DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection. Cell. 113 (6), 803-809 (2003).
  6. Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein. Science. 300 (5622), 1112 (2003).
  7. Chun, T. W., et al. Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication. AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).
  8. Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).
  9. Soriano-Sarabia, N., et al. Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells. Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).
  10. Josefsson, L., et al. The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).
  11. Evering, T. H., et al. Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection. Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506 (2012).
  12. von Stockenstrom, S., et al. Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy. Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).
  13. Palmer, S., et al. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).
  14. Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from: https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench (2018).
  15. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  16. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  17. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), (2011).
  18. Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
  19. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  20. Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
  21. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  22. Katoh, K., Standley, D. M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).
  23. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html (2018).
  24. Foster, J. L., Garcia, J. V. Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis. Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).
  25. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html (2018).
  26. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html (2018).
  27. Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data. Methods in Ecology and Evolution. , (2016).

Tags

Genetik spørgsmål 140 næste generation sequencing HIV-1 HIV sekventering provirus single-proviral HIV DNA ventetid replikation-kompetence antiretroviral behandling HIV reservoir integreret HIV
Forstærkning af nær fuld længde HIV-1 provirus for næste Generation Sequencing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh,… More

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh, B. A., Palmer, S. Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58016, doi:10.3791/58016 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter