Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing

Published: October 16, 2018 doi: 10.3791/58016
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Virus Research, The Westmead Institute for Medical Research, University of Sydney

Summary

Full-length individuele proviraal sequencing (FLIPS) een efficiënte en hoog-productie methode voorziet in de versterking en sequentiebepaling van één, in de buurt van full-length (intact en defecte) HIV-1 proviruses en zorgt voor de bepaling van hun potentieel replicatie-competentie. FLIPS overwint beperkingen van eerdere tests ontworpen om de volgorde van het latente reservoir van HIV-1.

Abstract

De Full-Length individuele proviraal Sequencing (FLIPS) bepaling is een efficiënte en hoog-productie methode ter versterken en volgnummer één, in de buurt van full-length (intact en defecte), HIV-1 proviruses. FLIPS kunt bepaling van de genetische samenstelling van geïntegreerde HIV-1 binnen een celpopulatie. Door het identificeren van de gebreken binnen HIV-1 proviraal sequenties die zich tijdens reverse transcriptie, zoals grote interne deleties voordoen, schadelijke stop codonen/hypermutation, frameshift mutaties en mutaties/verwijderingen in DIS handelend elementen vereist voor virion rijping herkent FLIPS geïntegreerde proviruses niet in staat om replicatie. De FLIPS bepaling kan worden gebruikt om het identificeren van HIV-1 proviruses die gebrek aan deze gebreken en dus potentieel replicatie-bevoegd zijn. Het FLIPS protocol omvat: lysis van HIV-1 besmette cellen, genest PCR van in de buurt van full-length HIV-1 proviruses (gebruikend inleidingen gericht tot de HIV-1-5' en 3' LTR), DNA zuivering en kwantificering, bibliotheek voorbereiding voor Next-generation Sequencing (NGS), NGS, DOVO vergadering van proviraal contigs en een eenvoudig proces van eliminatie voordeidentificatie van replicatie-bevoegde proviruses. FLIPS biedt voordelen ten opzichte van traditionele methoden ter volgorde geïntegreerd HIV-1 proviruses, zoals de één-proviraal sequencing. FLIPS versterkt sequenties in de buurt van full-length proviruses inschakelen replicatie competentie worden vastgesteld en gebruikt ook minder versterking primers, voorkomen van de gevolgen van de primer incongruenties. Salto is een nuttig hulpmiddel voor het begrijpen van de genetische landschap van geïntegreerde HIV-1 proviruses, met name binnen het latente reservoir, echter het gebruik kunt uitbreiden voor elke toepassing waarin de genetische samenstelling van geïntegreerde HIV-1 vereist is.

Introduction

Genetische karakterisering van het latente reservoir van HIV-1, die personen op lange termijn antiretrovirale therapie (ART) of langer aanhoudt, is essentieel om te begrijpen dat de meerderheid van de geïntegreerde proviruses defect en replicatie-incompetente1 zijn , 2. tijdens het proces van omgekeerde transcriptie, fouten in de geïntegreerde proviraal volgorde worden binnengebracht. Sommige mechanismen die het genereren van defecte proviraal sequenties bevatten de foutgevoelige HIV-1 reverse-transcriptase enzym3, sjabloon schakelen4en/of APOBEC-geïnduceerde hypermutation5,6. Twee recente studies is gebleken dat ongeveer 5% van de HIV-1 proviruses van individuen op lange termijn ART geïsoleerd genetisch intact, en potentieel replicatie-bevoegde zijn, en aan de snelle opleving in HIV-1 plasma niveaus bij stopzetting van de kunst bijdragen kan 1 , 2 , 7. vorige studies hebben vastgesteld dat de replicatie-bevoegde HIV-1 proviruses aanhouden in naïef en rusten geheugen CD4+ T cel subsets (met inbegrip van Midden-, overgangs- en effector geheugencellen T) het belang van gericht op deze cellen in de toekomst uitroeiing strategieën,2,,8,9.

Vroege inzichten in de distributie, de dynamiek en het onderhoud van de latente HIV-1 reservoir werden bereikt door het gebruik van de methoden van de één-proviraal sequencing (SPS) die genetisch sub-genomic regio's van de HIV-1 genoom10 karakteriseren ,11,12,13. SPS is een veelzijdig instrument, kundig voor volgorde een één provirus van HIV-1 uit binnen een enkele geïnfecteerde cel. SPS is echter niet in staat om te bepalen van de replicatie-bekwaamheid van proviruses, aangezien het alleen sub-genomic regio's en missers in de proviruses, die grote deleties binnen primer bandplaatsen bevatten sequenties. Een eerdere studie heeft aangetoond dat SPS overschat de grootte van de replicatie-bevoegde reservoir door 13 - tot 17 keer via het selectief sequencing intact sub-genomic regio2.

Inspelen op de beperkingen van SPS, Ho et al. 4 en Bruner et al. 1 ontwikkeld testen in reeks in de buurt van full-length HIV-1 proviruses. Hierdoor konden de frequentie van genetisch intact, en potentieel replicatie-bevoegde, HIV-1 proviruses in individuen op lange termijn kunst te bepalen. Deze testen versterkt en sequenced (via Sanger sequencing) sub-genomic regio's die vervolgens werden gemonteerd om te verkrijgen van een opeenvolging van de (intacte of defect) HIV-1 provirus. Drie beperkingen van deze benadering zijn: 1) het gebruik van meerdere sequencing inleidingen verhoogt het risico van onbedoeld invoering van gebreken in de proviraal reeks, 2) primer incongruenties kan versterking van bepaalde proviruses, en 3) vaak de proviraal reeks kan niet worden opgelost als gevolg van de techniciteit van deze methoden.

Om te overwinnen van de beperkingen van bestaande full-length HIV-1 proviraal sequencing testen, ontwikkelden we de Full -Length ikndividual Proviral Sequencing (FLIPS) bepaling. Salto is een next-generation sequencing (NGS)-gebaseerde test die versterkt en in de buurt van full-length (intact of defect) proviruses van HIV-1 sequenties in een high-throughput en efficiënte manier. FLIPS biedt voordelen ten opzichte van eerdere testen, zoals het beperkt het aantal inleidingen gebruikt; Dus, het vermindert de kans voor primer incongruenties, die het aantal proviruses beperken kunnen gevangen of onbedoeld introduceren gebreken in een virale reeks. Salto is ook minder technisch uitdagende dan eerdere tests en omvat 6 belangrijke stappen: 1) lysis van HIV-1 besmette cellen, 2) versterking van één HIV-1 proviruses via genestelde PCR uitgevoerd te beperken met behulp van primers specifiek voor de zeer geconserveerde verdunning HIV-1 5' en 3' U5 LTR regio (figuur 1A), 3) zuivering en kwantificering van versterkte producten, 4) voorbereiding van de bibliotheek van versterkte proviruses voor NGS, 5) NGS, en 6) DOVO vergadering van gesequenceerd proviruses verkrijgen van contigs voor elk individuele provirus.

Reeksen gegenereerd door FLIPS kunnen ondergaan een strenge proces van eliminatie om te identificeren die genetisch intact en potentieel replicatie-bevoegde (Figuur 1 c)2 zijn. Genetisch intact proviruses missen alle bekende gebreken die in het genereren van een replicatie-incompetente provirus resulteren. Deze gebreken omvatten: inversie sequenties, grote interne verwijderingen, hypermutation/schadelijke stop codonen, leesraamverschuiving of mutaties in de 5' verpakking signaal of grote splice donor (MSD) site.

Figure 1
Figuur 1: kritische stappen in de full-length individuele proviraal sequencing (FLIPS) assay. (A) HIV-1 DNA-genoom met primer bandplaatsen regio 5' en 3' U5 LTR gebruikt door FLIPS om te versterken in de buurt van full-length (defect en intact) HIV-1 proviruses via genestelde PCR. (B) lay-out van een 96-Wells PCR plaat met 80 monster wells (20 wells voor elke verdunning), 4 negatieve controleputjes en 1 positieve controle goed. (C) proces van eliminatie gebruikt voor het identificeren van genetisch intact, en potentieel replicatie-bevoegde, HIV-1 proviruses. Dit cijfer is gewijzigd van Hiener et al. 2 . Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele beoordeling besturen op de Universiteit van Californië-San Francisco en de Western Sydney lokale gezondheidsdistricten, waarin de Westmead Institute for Medical Research.

1. lysis van HIV-1-geïnfecteerde cellen

Opmerking: Cellen kunnen worden geïsoleerd uit perifeer bloed, leukaferese monsters, beenmerg biopsie of biopsie van weefsel. Cel bevolking kunnen worden gesorteerd met behulp van fluorescentie-activated cell sorting (FACS).

  1. Bereiden een lysis-buffermengsel met 10 mM Tris-HCl, 0,5% Nonidet P-40, 0,5% Tween-20 en 0,3 mg/mL proteïnase K. Voeg 100 µL van lysis buffer per 1 x 106 cellen aan een cel pellet. Pipetteer omhoog en omlaag als u wilt mengen. Incubeer bij 55 ° C gedurende 1 uur, gevolgd door 85 ° C gedurende 15 minuten lyse de cellen en vrijgeven van genomic DNA voor PCR versterking.
    Opmerking: Lysis van de cel is voldoende om het verkrijgen van genomic DNA voor versterking. Er is geen DNA isolatie of zuivering nodig. Het protocol kan worden onderbroken op dit punt en genomic DNA kan worden achtergelaten bij-20 ° C voor onbepaalde tijd.

2. versterking van één HIV-1 DNA Proviruses via genestelde PCR

  1. Meng de reagentia voor de eerste ronde PCR (PCR1) vermeld in tabel 1 (Zie Tabel van materialen). 38 µL van master mix aan 85 putjes (80 monsters, 4 negatieve controles, 1 positieve controle) van een 96-wells-plaat voor PCR (volg de lay-out in figuur 1B) toevoegen. Het aanwijzen van deze plaat 'PCR1'.
Reagens Eindconcentratie Volume voor PCR1 plaat (µL) Volume voor PCR2 plaat (µL)
Voorwaartse Primer 1 ΜM 32.3 23,8
Omgekeerde Primer 1 ΜM 32.3 23,8
Buffer (10 x) 1 x 323 238
MgSO4 (50 mM) 2 mM 129.2 95,2
dNTP (10 mM) 0.2 mM 64,6 47.6
De polymerase van DNA (5 U/µL) 0,025 U/ΜL 16.2 11,9
Ultrazuiver H2O 2632.5 1939.7

Tabel 1: Reagentia en volumes voor PCR meester mixen.

Opmerking: De inleidingen gebruikt voor PCR1 zijn:
BLOuterF: 5'-AAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3' (HXB2 positie 623-649)
BLOuterR: 5'-TGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTC-3' (HXB2 positie 9662-9686)

  1. Na de voorbereiding van de master mix, verplaats de PCR1 plaat naar schone ruimten aangewezen voor de toevoeging van genomic DNA.
    1. Serieel verdunde genomic DNA van 1:3 1:81 met Tris-HCl (5 mM, pH 8), voorbereiden 45 µL op elke verdunning (genoeg voor 20 putten voor elke verdunning). 2 µL van verdunde genomic DNA aan elk monster goed en 2 µL van Tris-HCl (5 mM, pH 8) om elke negatieve controle goed (volg de lay-out in figuur 1B) toevoegen. Verzegelen alle de putjes van de plaat van de PCR1, met uitzondering van de positieve controle goed, met behulp van een duidelijk Zelfklevende zegel (Zie Tabel van materialen).
      Opmerking: De bovenstaande aanbevolen verdunningen dienen slechts als een begin gids voor het bepalen van de verdunning van het eindpunt. Verdunningen hangt af van de concentratie van geïntegreerde DNA van HIV-1 binnen de monsters.
  2. Verplaatst naar een gebied aangewezen voor de toevoeging van positieve controle. 2 µL van positieve controle (pNL4-3 verdund tot 105 exemplaren/µL) toevoegen aan de positieve controle goed van de PCR1 plaat en verzegel de plaat. Kort draaien de plaat van de PCR1 in een PCR plaat spinner of centrifuge (400 x g voor 10 s bij kamertemperatuur) te trekken van de resterende inhoud van de kanten van de putten.
  3. Uitvoeren van de PCR1 plaat in een thermocycler: 94 ° C gedurende 2 minuten; vervolgens 94 ° C gedurende 30 s, 64 ° C gedurende 30 s, 68 ° C gedurende 10 minuten voor 3 cycli; 94 ° C gedurende 30 s, 61 ° C gedurende 30 s, 68 ° C gedurende 10 minuten voor 3 cycli; 94 ° C gedurende 30 s, 58 ° C gedurende 30 s, 68 ° C gedurende 10 minuten voor 3 cycli; 94 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s, 68 ° C gedurende 10 min voor 21 cycli; vervolgens 68 ° C gedurende 10 minuten (totaal 30 cycli). Houd bij 4 ° C.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken en de PCR1 plaat bewaard bij 4 ° C voor maximaal 2 dagen.
  4. Meng de reagentia voor de tweede ronde van PCR (PCR2) vermeld in tabel 1. 28 µL aan 85 putjes (80 monsters, 4 negatieve controles, 1 positieve controle) van een nieuwe PCR 96-wells-plaat (volg de lay-out in figuur 1B) toevoegen. Het aanwijzen van deze plaat 'PCR2'.

Opmerking: De inleidingen gebruikt voor PCR2 zijn:
275F: 5'-ACAGGGACCTGAAAGCGAAAG-3' (HXB2 positie 646-666)
280R: 5'-CTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACG-3' (HXB2 positie 9650-9676)

  1. Kort draaien de plaat van de PCR1 in een PCR plaat spinner of centrifuge (400 x g voor 10 s bij kamertemperatuur) te trekken van de resterende inhoud van de kanten van de putten. Voeg 80 µL van Tris-HCl (5 mM, pH 8) toe aan elk putje van de plaat van de PCR1.
    1. Breng 2 µL van de PCR1 plaat aan de plaat van de PCR2 met behulp van een meerkanaalspipet. Zorgen monsters worden overgedragen goed tot ruim (dat wil zeggen, 2 µL van goed A1 van PCR1 plaat wordt overgedragen aan goed A1 van PCR2 plaat). Het zegel van de plaat van de PCR2 met behulp van een duidelijk Zelfklevende zegel (Zie Tabel van materialen).
    2. Kort draaien de plaat van de PCR2 in een PCR plaat spinner of centrifuge (400 x g voor 10 s bij kamertemperatuur) te trekken van de resterende inhoud van de kanten van de putten. Zegel van de PCR1 plaat met een heat sealing film voor lange termijn opslag bij-20 ° C (Zie Tabel van materialen).
  2. Uitvoeren van de PCR2 plaat in een thermocycler: 94 ° C gedurende 2 minuten; vervolgens 94 ° C gedurende 30 s, 64 ° C gedurende 30 s, 68 ° C gedurende 10 minuten voor 3 cycli; 94 ° C gedurende 30 s, 61 ° C gedurende 30 s, 68 ° C gedurende 10 minuten voor 3 cycli; 94 ° C gedurende 30 s, 58 ° C gedurende 30 s, 68 ° C gedurende 10 minuten voor 3 cycli; 94 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s, 68 ° C gedurende 10 min voor 31 cycli; vervolgens 68 ° C gedurende 10 minuten (totaal 40 cycli). Houd bij 4 ° C.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken en de PCR2 plaat bewaard bij 4 ° C voor maximaal 2 dagen.
  3. Kort draaien de plaat van de PCR2 in een PCR plaat spinner of centrifuge om neer te trekken de resterende inhoud van de kanten van de putten. Voeg 60 µL van Tris-HCl (5 mM, pH 8) naar elk goed met behulp van een meerkanaalspipet.
    1. 15 µL van elk putje draaien op 2 x 48-well geprefabriceerd 1% agarose gel met ethidiumbromide (0.1\u20120.3 µg/mL, Zie Tabel van materialen). Gebruik van een ladder met een bereik tot 10 kb (Zie Tabel van materialen). Visualiseer ter identificatie van de putjes met de versterkte product en de geschatte grootte. Sla de afbeelding van de gel.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de positieve controle goed versterkte product bevat. Als de negatieve controle putten versterkte product bevat, overwegen besmetting en veronachtzaming van de plaat.
  4. De verdunning waartegen niet meer dan 30% van putten positief voor versterkte product zijn bepalen.
    Nota: Dit is het eindpunt verdunning waarin een meerderheid (80%) van putten bevatten versterkte product uit één sjabloon. Deze verdunning moet worden voorbereid en gebruikt in daaropvolgende PCRs om nadere te verkrijgen proviraal waarbij. De geschatte omvang van elke versterkte product opnemen.

3. DNA zuivering en kwantificering

  1. Kort draaien de plaat van de PCR2 in een PCR plaat spinner of centrifuge om neer te trekken de resterende inhoud van de kanten van de putten. Breng 40 µL de putjes met versterkte product (op of onder de eindpunt-verdunning) aan een nieuwe midi 96-wells-plaat (met een goed volume van 0,8 mL, Zie Tabel van materialen).
    Opmerking: Noteer de oorspronkelijke en nieuwe goed positie van elke versterkte product in een werkblad als een record van elke versterkte product te worden sequenced.
  2. Zuiveren de versterkte DNA-producten met behulp van een magnetische kraal gebaseerd PCR zuivering kit (zie tabel van materialen) inleidingen, nucleotiden, enzymen, oliën en zouten te verwijderen. Voordat u begint, breng magnetische kralen op kamertemperatuur en bereiden van verse 80% ethanol. Gebruik nieuwe Pipet tips indien nodig om kruisverontreiniging van DNA-monsters.
    1. Vortex magnetische kralen om ervoor te zorgen zij zijn grondig geresuspendeerde. Met behulp van een meerkanaalspipet, voeg 40 µL van parels aan de 40 µL van versterkte product in de 0,8 mL midi 96-wells-plaat. Pipetteer zachtjes op en neer 10 keer te mengen. Als alternatief, meng de oplossing door de afdichting van de plaat dan schudden in een roteerapparaat microplate bij 1800 rpm voor 2 min. Incubate bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    2. Plaats de plaat op een magnetische staan (Zie Tabel of Materials) voor 2 min. verwijderen en gooi deze weg bezinken.
    3. Wassen kralen door 200 µL van 80% ethanol toe te voegen aan elk putje met de plaat op de stand. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 s. verwijderen en verwijder het supernatant. Eenmaal herhaald. Met behulp van een meerkanaalspipet met fijne tips, verwijder alle overtollige ethanol na de tweede wash. Met de plaat op de stand, kunt u de kralen in de lucht droog gedurende 15 minuten.
    4. Verwijderen de plaat uit de stand. Voeg 30 µL van elutie buffer (Zie Tabel van materialen) aan elk putje. Pipetteer zachtjes op en neer 10 keer te mengen. Als alternatief, meng de oplossing door de afdichting van de plaat dan schudden in een roteerapparaat microplate bij 1800 rpm voor 2 min. Incubate bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
    5. Plaats de plaat op een magnetische stand voor 2 min. met behulp van een meerkanaalspipet, 25 µL van supernatant (gezuiverde DNA) overbrengen naar een nieuwe 96-Wells PCR plaat. Zorgen dat de monsters goed-te-goed worden overgedragen (dat wil zeggen, supernatant van goed A1 in 0,8 mL plaat is overgeplaatst naar goed A1 van nieuwe 96-wells-plaat).
      Opmerking: 5 uL van het eluted monster wordt achtergelaten om ervoor te zorgen geen overdracht van resterende zuivering kralen.
  3. Bepalen en vastleggen van de geschatte concentratie van elke versterkte product van DNA na zuivering met behulp van een spectrofotometer (absorptie bij een golflengte van 260 nm).
    Opmerking: Meten van het geschatte concentratie van elk versterkte product is nodig om ervoor te zorgen geen monsters gaan verloren tijdens de zuivering stappen en dat het geschatte concentratie binnen het bereik van de standaard curve gebruikt in de volgende fase (in dit stadium 0.001 – 1 ng/µL DNA in 100 µL van volume). Het protocol kan hier worden onderbroken en gereinigd monsters kunnen worden achtergelaten bij-20 ° C voor maximaal 6 maanden.
  4. Kwantificeren van de concentratie van DNA van elk gezuiverde product met behulp van een kwantificering dsDNA kit (zie tabel van materialen).
    Opmerking: Dit gaat met behulp van een standaard curve te bepalen van de concentratie van dsDNA in een monster. De kit bevat buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), een lamda dsDNA standard en een fluorescente kleurstof. Houd alle reagentia op ijs. Betrekking hebben op de buis met kleurstof met folie om te voorkomen dat blootstelling aan licht. Het meten van de concentratie van elk versterkte product in drievoud.
    1. Verdunde buffer om 1 x in steriele DNase gratis H2O. toevoegen 99 µL van buffer om het juiste aantal lege wells (3 maal het aantal versterkte producten te worden gemeten, Zie tabel 2 voor een voorbeeld van de lay-out) van een platte weefselkweek bodemplaat. Voeg 100 µL van de buffer toe aan 3 lege putjes.
    2. Voor elke versterkte product te meten, voeg 1 µL van gezuiverde DNA (uit stap 3.2.5) in drievoud aan elk putje met buffer (Zie tabel 2 voor een voorbeeld van de lay-out).
    3. Ter voorbereiding van normen, Verdun lamda dsDNA 10-fold van 2 ng/µL aan 0.002 ng / µL. Voeg 100 µL van elke standaard dsDNA 3 putjes.
      Opmerking: Na stap 3.4.4, de uiteindelijke concentratie van de normen zal variëren van 1 tot 0,001 ng/µL
    4. Verdun de fluorescente kleurstof 1:200 met buffer. Snel 100 µL toevoegen aan elk putje met monster, lege waarden en normen. Meng op en neer met een pipet. De afdekplaat met folie contact met licht te vermijden.
    5. Lees fluorescentie emissie op een microplate-lezer (excitatie 480 nm, emissie op 520 nm). Recordresultaten in een werkblad.
    6. Bepaal de concentratie van dsDNA in elk monster met behulp van de metingen van de fluorescentie opgenomen. Aftrekken van de fluorescentie gemeten in de lege putten uit de steekproef en normen. Bepaal de gemiddelde fluorescentie voor elk monster en de standaard van de triplicates. Een standaard curve op basis van de fluorescentie-meting van de normen te tekenen. Bepaal de concentratie van de monsters ten opzichte van de normen.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Standaard (1 ng/mL) Standaard (0.1 ng/mL) Norm (0,01 ng/mL) Standaard (0,001 ng/mL) Leeg
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL buffer
B Standaard (1 ng/mL) Standaard (0.1 ng/mL) Norm (0,01 ng/mL) Standaard (0,001 ng/mL) Leeg
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL buffer
C Standaard (1 ng/mL) Standaard (0.1 ng/mL) Norm (0,01 ng/mL) Standaard (0,001 ng/mL) Leeg
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL buffer
D Voorbeeld 1: Voorbeeld 2: Voorbeeld 3: Voorbeeld 4: Voorbeeld 5: Voorbeeld 6: Voorbeeld 7: Voorbeeld 8: Voorbeeld 9: Voorbeeld 10: Voorbeeld 11: Monster 12:
1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer
E Voorbeeld 1: Voorbeeld 2: Voorbeeld 3: Voorbeeld 4: Voorbeeld 5: Voorbeeld 6: Voorbeeld 7: Voorbeeld 8: Voorbeeld 9: Voorbeeld 10: Voorbeeld 11: Monster 12:
1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer
F Voorbeeld 1: Voorbeeld 2: Voorbeeld 3: Voorbeeld 4: Voorbeeld 5: Voorbeeld 6: Voorbeeld 7: Voorbeeld 8: Voorbeeld 9: Voorbeeld 10: Voorbeeld 11: Monster 12:
1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer
G
H

Tabel 2: Voorbeeld van de lay-out van 96-wells-plaat voor de kwantificering van dsDNA.

  1. Verdun elk gezuiverde product (verkregen in stap 3.2.5) met H2O 0,2 ng/µL.

4. sequencing bibliotheek voorbereiding

  1. Versterkte en gezuiverde proviraal DNA voorbereiden NGS met behulp van een NGS DNA bibliotheek voorbereiding kit (Zie Tabel van materialen). Volg de instructies van de fabrikant voor alle tagmentation, PCR versterking en schoonmaak stappen [behalve dat de volumes van de reactie met inbegrip van invoer DNA (uit stap 3.5) worden gehalveerd om uit te breiden van het gebruik van de bibliotheek voorbereiding reagentia].
  2. Normaliseren van bibliotheken handmatig met behulp van een qPCR gebaseerde NGS bibliotheek kwantificering kit (Zie Tabel van materialen) om het bepalen van de afzonderlijke concentratie van provirus. Combineren van individuele provirus bibliotheken in mengsel bedraagt een eindconcentratie van 4 nM, of zoals aangegeven door de dienstverlener sequencing.
    Opmerking: Het protocol hier kan worden onderbroken en de gepoolde bibliotheek opgeslagen bij-20 ° C.
  3. De definitieve gepoolde bibliotheek met behulp van dezelfde dsDNA kwantificering kit gebruikt in stap 3.4 te kwantificeren. Volg de instructies van de fabrikant. Bepalen van de lengte van de gemiddelde fragment door 1 µL van de gebundelde bibliotheek uitvoeren op een systeem van de geautomatiseerde elektroforese met behulp van een geschikte kit (Zie de Tabel van de materialen). Gebruik de concentratie en de gemiddelde fragment lengtes om te bepalen van de molarity van de gebundelde bibliotheek.
  4. 5 µL van de gebundelde bibliotheek combineren met 5 µL van 0,2 N NaOH te denatureren van de bibliotheek. Voeg 5 µL van 200 mM Tris-HCl te neutraliseren. Verdun de definitieve bibliotheek tot 5 uur met gekoeld hybridisatie buffer (beschikbaar met DNA bibliotheek voorbereiding kit) onmiddellijk voorafgaand aan het rangschikken.
  5. 2 x 150 nucleotide (nt) gekoppeld-eind rangschikken uit te voeren op een passende NGS-platform (Zie Tabel van materialen).
    Opmerking: Wanneer 96 proviraal bibliotheken zijn geïndexeerd per run, dit levert ongeveer 20 miljoen gekoppeld-einde leest per run of 200.000 leest per individuele provirus bibliotheek voor analyse na-multiplexing. Stap 4.4 en 4.5 worden doorgaans uitgevoerd door een sequencing faciliteit.

5. DOVO vergadering van gesequenceerd HIV-1 Proviruses

Opmerking: Voor het verkrijgen van de genetische sequentie van elke versterkte provirus, contigs zijn geassembleerd DOVO van de gepaarde-einde leest. Vele platformen (bijvoorbeeld, CLC Genomics Workbench14), laat het ontwerp van aangepaste werkstromen voor DOVO vergadering. Andere open source-software zoals FastQC15, Trimmomatic16, Cutadapt17en FLASH18 kan ook worden gebruikt voor verwerking leest, alsmede instrumenten zoals Bowtie219 en SPAdes20 voor lees kartering en DOVO vergadering. De stappen voor de montage van de DOVO van HIV-1 contigs met behulp van een specifieke commercieel platform (Zie de Tabel van materialen) worden hieronder nader belicht (Figuur 2). Aangepaste werkstroom bestand is beschikbaar op aanvraag.

  1. Importeren van sequenties en controleren van de kwaliteit: Import de gepaarde volgorde leest (in fastq.gz formaat) in de software, die zal dan worden gecombineerd als enkele set van gepaarde luidt als volgt. Een reeks QC rapport genereren en onderzoeken van de kwaliteit van uw gegevens.
  2. Kwaliteitscontrole
    1. Lees trimmen volgens de QC-rapport uitvoeren Verwijder elke adapter sequenties en dubbelzinnige nucleotiden. Trim vijftien 5' en twee 3' terminal nucleotiden. Discard leest minder dan 50 nucleotiden in lengte. Een limiet van de strenge kwaliteitseisen van 0,001 overeenkomt met een score van QC phred van 30 gebruiken.
  3. Samenvoegen van overlappende paren
    1. Vormen één uitgebreide leest door de samenvoeging van gepaarde vooruit en achteruit leest met overlappende gebieden.
  4. DOVO vergadering
    1. Gebruiken van de inheemse CLC genomics DOVO assembler met een woord (of k-mer) grootte van 30 nt en een maximale belgrootte van 65 nt te monteren een aselecte deelsteekproef van 10.000 niet-overlappende gepaarde leest. De verwachte dekking voor de DOVO geassembleerd aanliggend is ~ 200 x voor een reeks ~ 9 kb.
      Opmerking: Deze steekproef kan verlichten de computationele zodanig dat de meeste standaard bureaucomputers kunnen omgaan met de vergadering en analyse, en gezien de tentiemechanismen van elke provirus (een bibliotheek is een provirus), dit wordt niet beperkt in de diversiteit.
  5. Opnieuw toewijzen van alle leesbewerkingen te contigs
    1. Kaart voor het verkrijgen van de laatste meerderheid consensus opeenvolging van elke provirus, de volledige lees ingesteld op de aanliggend DOVO gemonteerd. Accepteer alleen contigs met een gemiddelde minimumdekking van 1.000 x en zorgen de definitieve aanliggend lengte komt overeen met de grootte van de band op de oorspronkelijke agarose gel (stap 2.8.1). De meerderheid van de definitieve consensus volgorde opslaan als .fasta bestand.
      Opmerking: De meeste contigs kan worden gemonteerd met behulp van de bovenstaande stappen. Echter in sommige gevallen, voor een enkele provirus, worden meerdere contigs met een vergelijkbare dekking geassembleerd. In deze omstandigheden, contigs tot een in de omgeving van full-length (~ 9 kb) worden uitgelijnd consensus opeenvolging van dezelfde deelnemer en handmatig gemonteerd in een enkele aanliggend. Alle leesbewerkingen worden vervolgens toegewezen aan de handmatig geassembleerde aanliggend en de uiteindelijke consensus aanvaard of lees dekking is zelfs tijdens de vergadering en niet single nucleotide polymorphisms (SNPs) > 40% aanwezig zijn.
  6. De controle van de kwaliteit van de verdere
    1. Om ervoor te zorgen elke aanliggend vertegenwoordigt een enkel provirus, en is niet te wijten aan de amplificatie van meerdere proviruses binnen een enkele goed, lezen scherm dekking en variant roeping van de definitieve aanliggend.
    2. Meerdere proviraal sjablonen aanwezig tijdens PCR worden vaak aangeduid met zeer ongelijke Lees dekking (als gevolg van de co amplificatie van proviruses van verschillende grootte) wanneer toewijzen aan een full-length consensus vanuit eenzelfde deelnemer of door de aanwezigheid van SNPs met een frequentie van > 40% (Zie representatieve resultaten, Figuur 4). Negeren van gemengde bevolking in latere analyses.
  7. Uitlijning
    1. De uiteindelijke consensus van elke proviraal sequentie importeren reeks software zoals moleculaire evolutionaire genetica analyse (MEGA) 721weergeven. Hiermee lijnt u elke sequentie handmatig in de reeks van de referentie HXB2. Trim de 5' en 3' eindigt posities 666-9650 van HXB2 te verwijderen van de primer sequenties.
    2. De lijst reeks in fasta-indeling exporteert en vervolgens uitlijnen MAFFT versie 722, met handmatige bewerking eventueel te verkrijgen van de laatste aanpassing.
      Opmerking: Als alle sequenties doen niet is uitgelijnd, eerste omgekeerde als aanvulling op de reeks. Als de volgorde nog steeds niet is uitgelijnd een zoekopdracht BLAST om ervoor te zorgen dat de volgorde is HIV-1. Het is mogelijk te versterken, niet-HIV-1 sjablonen en deze in dit stadium kunnen worden geïdentificeerd. Als sequenties zijn van HIV-1 maar doen niet uitgelijnd, kunt u overwegen de aanwezigheid van inversies (zie stap 6.1).

6. bepaling van potentiële replicatie competentie van HIV-1 proviraal sequenties

Opmerking: Om te identificeren sequenties van genetisch intact, en potentieel replicatie-bevoegde, HIV-1 proviruses die een strenge proces van eliminatie is gevolgd (Figuur 1 c). Proviraal sequenties ontbreekt Inversies, grote interne deleties, schadelijke stoppen codonen / hypermutation, frameshift mutaties en/of gebreken in de MSD-site of verpakking-signaal worden beschouwd als genetisch intact en potentieel replicatie-bevoegde.

  1. Inversies
    1. Tijdens de fase van de uitlijning, identificeren inversies. Inversies zijn regio's waar de volgorde niet is uitgelijnd op de objectverwijzing HXB2 tenzij de regio wordt reverse aangevuld.
      Opmerking: Afhankelijk van de toepassing van de gegevens, sequenties met inversies wellicht worden weggelaten uit verdere analyse.
  2. Grote interne verwijderingen
    1. Identificeren van contigs met grote interne verwijderingen (> 600 bp) in het werkgebied uitlijnen. Tenzij de verwijdering binnen nef zit, kan de volgorde worden gedefinieerd als defect.
      Opmerking: Alle sequenties met interne verwijderingen < 600 bp zal worden geïdentificeerd door Gene Cutter (stap 6.3.1) als onvolledig gensequenties.
  3. Schadelijke stop codonen, frameshift mutaties en verwijderingen
    1. Controleer alle contigs met een lengte > 8400 nucleotiden voor de aanwezigheid van schadelijke stop codonen, leesraamverschuiving en onvolledige gensequenties met behulp van het Los Alamos National laboratorium HIV reeks Database Gene Cutter hulpmiddel23.
      Opmerking: Het hulpprogramma Gene Cutter verdeelt de proviraal volgorde in de genen gag, pol vif, vpr, tat, rev, vpu, env, en nef, en vertaalt ze naar aminozuren. Gene Cutter dan schermen voor de aanwezigheid van stop codonen en frameshift mutaties (als gevolg van invoegingen of verwijderingen). Contigs met stop codonen of leesraamverschuiving in elk gen, met uitzondering van nef24, worden geclassificeerd als defect. Gene Cutter identificeert ook onvolledig gensequenties en een proviruses met een schrapping < 600 bp in een gen dan nef kan worden heringedeeld als defect als gevolg van een grote interne schrapping.
  4. Hypermutation
    1. Het genereren van een consensus van de resterende full-length proviraal sequenties met behulp van het Los Alamos National Laboratory HIV reeks Database Consensus Maker gereedschap (eenvoudige consensus maker)25. De volgorde van de consensus toevoegen naar de top van een uitlijning met alleen de resterende full-length proviraal sequenties. Met behulp van deze afstemming en het Los Alamos National Laboratory HIV reeks Database Hypermut werktuig26 G-A-hypermutation APOBEC-geïnduceerde in de resterende full-length proviraal sequenties identificeren.
  5. Gebreken in de MSD en verpakking signaal
    1. Controleer elk van de resterende contigs voor gebreken in de MSD en het signaal van de verpakking (HXB2 regio 670-810), waardoor de proviraal volgorde defecte4. Zoekt u een punt-mutatie in de MSD-site (reeks GT, HXB2 744-745) of eventuele schrapping in de vier stammen lussen van het signaal van de verpakking (SL1 (HXB2 691-734), SL2 (HXB2 736-754), SL3 (HXB2 766-779), en SL4 (HXB2 790-810)).

Representative Results

De FLIPS bepaling versterkt en één, in de buurt van full-length proviruses van HIV-1 sequenties. Het protocol bestaat uit 6 stappen te verkrijgen in de buurt van full-length proviraal sequenties. Deze stappen omvatten: lysis van geïnfecteerde cellen, genestelde PCR van full-length (intact en defecte) HIV-1 proviruses, DNA zuivering en kwantificering, bibliotheek voorbereiding, NGS, sequencing en DOVO vergadering van sequenced proviruses. Het einde van elke stap kan worden beschouwd als een controlepost waarin de kwaliteit van het product (bijvoorbeeld versterkt DNA, gezuiverde DNA, sequencing bibliotheek of sequentie) voorafgaand aan de volgende stap kan worden beoordeeld. Een overzicht van de beoordeling uitgevoerd aan het einde van elke stap en de verwachte resultaten zoals hieronder is beschreven.

Naar aanleiding van genestelde PCR, versterkte producten worden uitgevoerd op een 1% agarose gel (Figuur 3). De oorspronkelijke kwaliteit van de PCR kan worden bepaald door de inspectie van negatieve en positieve controles. Negatieve-controleputjes met versterkte product geven verontreiniging en positieve controleputjes afwezig van versterkte product geven onvoldoende versterking. Vervolgens zijn putten met versterkte product geselecteerd voor het rangschikken. Voorkom putten met mengsels van meerdere versterkte proviruses, worden alleen putten met versterkte product draaien bij verdunning van het eindpunt beschouwd voor het rangschikken. Volgens de Poisson-verdeling, wordt de end-point verdunning gevonden wanneer 30% van putten positief voor versterkte product zijn. Bij deze verdunning, is er een 80% kans deze putjes bevatten een enkel versterkte provirus. Daarnaast kunnen putten met meerdere versterkte proviruses van verschillende lengtes worden gevisualiseerd in dit stadium, zoals meerdere banden op de gel verschijnen zal. Deze putten moeten niet zijn geselecteerd voor de rangschikking (Figuur 3).

Na zuivering van de versterkte proviruses geselecteerd voor het rangschikken, kwantificering zorgt ervoor dat geen proviraal DNA verloren tijdens de fase van de zuivering. Indien de concentratie van het DNA van een versterkte provirus < 0,2 ng/µL, het resterende monster in de PCR2 plaat kan worden gezuiverd. Een soortgelijke controlepost treedt op na de bereiding van de bibliotheek, waarin elke individuele bibliotheek wordt gekwantificeerd. Dit zorgt voor individuele proviruses zijn op de juiste manier gefragmenteerd, gelabeld en versterkt voorafgaand aan het rangschikken. Individuele proviraal bibliotheken zijn gebundeld in mengsel bedragen tot een concentratie van de definitieve bibliotheek van 4 nM (of zoals aangegeven door de sequencing-provider). Als de concentratie van een individuele proviraal bibliotheek te laag is, het kan worden uitgesloten uit de sequencing bibliotheek groep, of de afzonderlijke bibliotheek opnieuw bereid. Een definitieve controle van de concentratie van de gebundelde bibliotheek wordt uitgevoerd voorafgaand aan het rangschikken samen met de bevestiging van de gemiddelde fragment lengtes.

Kwaliteitscontrole stappen voordat de DOVO vergadering fase zorgt voor de kwaliteit van de leest gebruikt voor het monteren van de laatste proviraal aanliggend. Deze stappen omvatten: verwijdering van adapter sequenties, trimmen van 5' en 3' nucleotiden, een strenge kwaliteitscontrole limiet, en rekening te houden met korte leest. CLC Genomics Workbench kan kwaliteitscontrole rapporten die kunnen worden gebruikt voor de oorspronkelijke kwaliteit van de leest en gids trimmen instellingen, en vervolgens na beoordelen om te bepalen als het wegsnijden volstond om te verwijderen van de regio's van lage kwaliteit bieden. Bovendien, voor DOVO de montage, de kwaliteit van de verzamelde contigs kan worden beoordeeld voor voldoende diepte (> 1000 X) en gelijkmatigheid van de dekking (figuur 4A). Gemengde bevolking kunnen ook in dit stadium worden geïdentificeerd. Mengsels van meerdere full-length (~ 9 kb) proviruses worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van meerdere SNPs met een frequentie van meer dan 40%, overwegende dat mengsels van korte (met een grote interne schrapping) en full-length proviruses kunnen worden geïdentificeerd door ongelijke Lees dekking na toewijzing aan een volledige referentie van eenzelfde deelnemer (figuur 4B).

Afhankelijk van de toepassing, kan de uiteindelijke uitlijning worden gevisualiseerd met behulp van hulpprogramma's zoals ggtree beschikbaar als een pakket in "R: A taal en omgeving voor het berekenen van statistische"27. In een recente studie, FLIPS werd gebruikt om de reeks HIV-1 proviruses uit het naïef, midden-, overgangs-, en effector geheugen CD4+ T cellen geïsoleerd van individuen op lange termijn kunst, met het doel om te identificeren als bepaalde cel subsets hoger toonde verhoudingen van genetisch intact en potentieel replicatie-bevoegde HIV-1-2. Hier wordt de visuele representatie van de sequenties van één deelnemer van deze studie (deelnemer 2026) geïsoleerd (Figuur 5) gepresenteerd. In deze deelnemer, de meerderheid (97%) van de sequenties werden defecte, met intact sequenties gevonden in effector en tijdelijke geheugen CD4+ T cellen. Deze visualisatie tool is handig voor het weergeven van het aantal sequenties met grote interne verwijderingen en hun positie in het genoom. Het kan verder worden geannoteerd om aan te geven van de sequenties met schadelijke stop codonen, frameshift mutaties en verwijderingen/mutaties in de MSD-site en/of de verpakking signaal.

Een toepassing van de bepaling van de FLIPS is de identificatie van genetisch intact en potentieel replicatie-bevoegde HIV-1 proviruses. In een recente studie van 531 sequenties van CD4 geïsoleerd+ T cellen van 6 deelnemers op lange termijn kunst, 26 (5%) genetisch intact HIV-1 proviruses werden geïdentificeerde2. De resterende defecte proviruses opgenomen die met inversie sequenties (6%), grote interne verwijderingen (68%), schadelijke stop codonen/hypermutation (9%), frameshift mutaties (1%) en gebreken in de verpakking signaal en/of de mutaties in de MSD-site (11%) .

Figure 2
Figuur 2: Overzicht van workflow voor DOVO montage van HIV-1 proviruses. De grote stappen in de workflow zijn: 1) volgorde lezen kwaliteitscontrole, 2) het samenvoegen van overlappende paren, 3) DOVO vergadering, en 4) remapping en consensusvorming zijn rood, blauw, groen en oranje, respectievelijk. Dit cijfer is gewijzigd van Hiener et al. 2 . Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: voorbeeld agarose gel van PCR versterkt HIV-1 proviruses. Putjes 1, 2, 3, 6, 9 en 10 bevatten versterkte HIV-1 proviruses. Goed 10 bevat een provirus met een grote interne schrapping, goed 2 bevat co versterking van twee HIV-1 proviruses van verschillende lengtes (mengsel) en goed 12 bevat positieve controle. Opmerking het percentage van putten met versterkte product is 60%, hetgeen hoger is dan het percentage moet isoleren van één sjablonen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: voorbeeld van de uitvoer van Lees toewijzing. (A) voorbeeld tonen zelfs dekking als gevolg van de versterking van een enkele full-length HIV-1 provirus. Na assemblage van DOVO , worden alle leesbewerkingen toegewezen aan de geassembleerde aanliggend tot een consensus-reeks. Het softwareplatform kan de toegewezen leest te inspecteren voldoende en zelfs dekking. (B) voorbeeld demonstreren co versterking van twee HIV-1 proviruses van verschillende lengtes (mengsel). Om te bepalen van mengsels, zijn leest toegewezen aan een full-length (~ 9 kb) referentie opeenvolging van eenzelfde deelnemer en lees toewijzing geïnspecteerd. De aanwezigheid van ongelijke dekking geeft een mengsel. Deze afbeelding is gereproduceerd met toestemming van Qiagen14. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Voorbeeld visualisatie van HIV-1 proviraal sequenties van CD4 geïsoleerd+ T cel subsets van een individu op lange termijn ART. Individuele HIV-1 proviraal sequenties worden vertegenwoordigd door horizontale lijnen. Dit cijfer is gewijzigd van Hiener et al. 2 . Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De FLIPS assay is een efficiënte en hoog-productie methode voor frequentiebanden te versterken en sequencing honkslag, in de buurt van full-length HIV-1 proviruses. Meerdere factoren en kritische stappen in het protocol die invloed hebben op het aantal en de kwaliteit van de sequenties die verkregen zijn geïdentificeerd. Ten eerste, het aantal cellen en de HIV-1 infectie frequentie de celpopulatie invloed op het aantal proviruses versterkt. Bijvoorbeeld, in een eerdere publicatie, ongeveer de helft zoveel sequenties werden verkregen uit hetzelfde aantal naïef CD4+ T cellen ten opzichte van effector geheugen CD4+ T cellen. Dit komt doordat naïef cellen meestal een lagere frequentie van de infectie dan effector geheugen cellen2 hebben. Ten tweede is de lysis van de cel beter dan kolom gebaseerde extractiemethoden voor het verkrijgen van genomic DNA als er geen risico is van het verliezen van DNA in het extractieproces. Tot slot, net als bij een PCR-gebaseerde assay, voorkomen van besmetting is van cruciaal belang. Gescheiden schone gebieden moeten worden aangewezen voor het voorbereiden van meester mixen, behandeling van genomic DNA, positieve controles, DNA zuivering en kwantificering en voorbereiding van de bibliotheek toevoegen. Dit is vooral belangrijk voor single-kopie assays zoals degene die hier gepresenteerd.

Uitvoering van de FLIPS bepaling dient eerst een positieve controle zoals pNL4-3 plasmiden in plaats van deelnemer monsters uitgevoerd. Hierdoor kan voor elke probleemoplossing voorafgaand aan het gebruik van HIV-1 positieve cellen, zoals de sequenties die verkregen kunnen worden vergeleken met beschikbare referentie sequenties voor deze plasmiden. Bij het gebruik van HIV-1 positieve cellen, is het belangrijk om te overwegen het HIV-1-subtype (inleidingen ontworpen voor FLIPS specifiek voor subtype B zijn) en de frequentie van de besmetting van de bevolking van de cel als weinig tot geen proviruses worden versterkt. Primer sequenties kunnen worden gewijzigd/ontworpen aan andere subtypen. Bovendien, moet een putje met een positieve controle worden opgenomen in elke PCR uitgevoerd.

Salto heeft het overwinnen van de beperkingen van eerdere sequencing tests, met inbegrip van SPS. Door middel van frequentiebanden te versterken en de sequencing in de buurt van full-length HIV-1 proviruses, kunnen FLIPS bepalen de potentiële replicatie-bekwaamheid van HIV-1 proviruses. Dit was niet mogelijk met behulp van SPS, die gesequentieerd alleen sub-genomic regio's en daarom geselecteerd voor sequenties met intact primer bandplaatsen. Bovendien FLIPS overwint de beperkingen die zijn gekoppeld met behulp van meerdere versterking en sequencing primers, zoals was werkzaam bij vorige full-length sequencing testen-1,4. Door middel van twee rondes van PCR gericht op de regio van de HIV-1 LTR's gecombineerd met NGS, FLIPS vermindert het aantal en de complexiteit van inleidingen vereist. Salto is dus minder gevoelig voor de gevolgen van de primer incongruenties, namelijk de foutieve identificatie van defecte proviruses en een onvermogen om te vergroten wat proviruses binnen een populatie. Het protocol FLIPS is ook efficiënter en zorgt voor een hogere doorvoersnelheid van sequencing dan eerdere methoden.

Blijkbaar, FLIPS biedt voordelen ten opzichte van bestaande methoden die bepalend zijn voor de genetische samenstelling van HIV-1 proviruses. Het is echter belangrijk te erkennen van de beperkingen van FLIPS. Ten eerste, de FLIPS assay is niet ontwikkeld als een instrument voor het meten van de omvang van de latente reservoir voor HIV-1, zoals analyses om te bepalen of FLIPS versterkt elke HIV-1 provirus aanwezig in een celpopulatie nog niet zijn voltooid. Salto is in plaats daarvan handig voor het maken van relatieve vergelijking van de samenstelling van het reservoir tussen verschillende cel populaties2. Ten tweede, de replicatie-bekwaamheid van intact HIV-1 proviruses met zekerheid zonder in vivo analyses, zoals uitgevoerd door Ho et al. kan niet worden bepaald 4. ten derde FLIPS is niet ontworpen voor het bepalen van de plaats van de integratie van HIV-1 proviruses.

Kleine variaties op de FLIPS protocol kunnen het verhogen van de toepassing ervan. Wordt bijvoorbeeld gewijzigd in primer sequenties verschillende kunnen en meerdere HIV-1 subtypes worden versterkt en sequenced. Rangschikken van plasma van HIV-1 virionen is mogelijk door de toevoeging van cDNA synthese vóór genestelde PCR. Toekomstige gebruik van één molecuul sequencing methoden zal elimineren de noodzaak voor DOVO vergadering.

Genetische rangschikken van geïntegreerde HIV-1 proviruses toegenomen ons begrip van de latente HIV-1-reservoir. Salto is een belangrijk instrument voor toekomstige studies ophelderen van de samenstelling en verdeling van het latente reservoir. Echter, de toepassingvan FLIPS kan verder reiken dan het reservoir. Toekomstige studies kunnen gebruik maken van FLIPS te bepalen van specifieke doelen voor CRISPR-Cas technologie, helpen bij de identificatie van de codering en niet-coderende regio's waardoor het virus ontvankelijker voor latency omkering van agenten. Virale recombinatie kan beter worden begrepen door het kijken naar de sites van de kruising van de grote interne verwijderingen.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund de Delaney AIDS onderzoek onderneming (DARE) om te zoeken naar een remedie (1U19AI096109 en 1UM1AI126611-01); een amfAR Research Consortium op HIV uitroeiing (ARCHE) Collaboratief onderzoek subsidie van de Foundation for AIDS Research (amfAR 108074-50-RGRL); Australian Centre for HIV en Hepatitis Virologie onderzoek (ACH2); UCSF-GIVI Center for AIDS Research (P30 AI027763); en de Australische nationale gezondheids- en medische Onderzoeksraad (AAP1061681). Wij zouden graag willen bedanken Dr. Joey Lai, Genomics Facility Manager bij de Westmead Institute for Medical Research voor zijn opleiding in bibliotheek voorbereiding en het gebruik van zijn faciliteit en het Ramaciotti-centrum voor genomica (Universiteit van New South Wales, Sydney, Australië) voor het uitvoeren van sequencing. Wij erkennen met dankbaarheid de deelnemers die gedoneerd monsters voor deze studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 Invitrogen 15568025 Dilute to 5 mM for nested PCR
Nonidet P 40 Substitute solution Sigma 98379
Tween-20 Sigma P9416
Proteinase K Solution (20 mg/mL) Promega AM2548
96 well thermocycler Any 96 well thermocycler can be used
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen 11304011
10x High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] Invitrogen 11304011
50 mM MgSO4 Invitrogen 11304011
PCR Nucleotide Mix, 10 mM Promega C1141
Ultrapure H2O Invitrogen 10977023
PCR1 and PCR2 Primers Desalted. Dilute to (100 µM) with H2O
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear Axygen PCR-96M2-HS-C
Microseal 'B' Adhesive Seals BioRad MSB1001 Required to seal 96 well PCR plates
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). Diluted to 105 copies/mL and used as positive control
PCR plate spinner or benchtop centrifuge
E-GEL 48 1% Agarose Invitrogen G800801 Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide.
DirectLoad Wide Range DNA Marker Sigma D7058 Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Mother E-Base device Invitrogen EBM03 Required for running precast 48 well 1% agarose gels
Gel Doc EZ Gel Documentation System BioRad 1708270 Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used
PlateMax Peelable Heat Sealing Axygen HS-200 Heat sealing film for long term storage
96 Well 0.8 mL Storage Plate ThermoFisher Scientific AB0765 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) Beckman Coulter A63880 Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106)
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology Sigma E7023
Magnetic Stand-96 Invitrogen AM10027
Microplate shaker Optional
Buffer EB Qiagen 19086 Elution buffer
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496 A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
Microplate reader
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-2001
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Biorad HSP9601 Required for Nextera XT DNA library preparation kit
Library Quantification Kit - Illumina/Universal Kapa Biosystems KK4824 Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)
2100 Bioanalyzer Agilent Technology Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit
High Sensistivty DNA kit Agilent Technology 5067-4626
Illumina MiSeq Platform Illumina

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruner, K. M., et al. Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection. Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).
  2. Hiener, B., et al. Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants. Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).
  3. Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication. Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).
  4. Ho, Y. C., et al. Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure. Cell. 155 (3), 540-551 (2013).
  5. Harris, R. S., et al. DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection. Cell. 113 (6), 803-809 (2003).
  6. Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein. Science. 300 (5622), 1112 (2003).
  7. Chun, T. W., et al. Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication. AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).
  8. Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).
  9. Soriano-Sarabia, N., et al. Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells. Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).
  10. Josefsson, L., et al. The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).
  11. Evering, T. H., et al. Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection. Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506 (2012).
  12. von Stockenstrom, S., et al. Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy. Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).
  13. Palmer, S., et al. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).
  14. Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from: https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench (2018).
  15. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  16. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  17. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), (2011).
  18. Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
  19. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  20. Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
  21. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  22. Katoh, K., Standley, D. M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).
  23. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html (2018).
  24. Foster, J. L., Garcia, J. V. Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis. Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).
  25. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html (2018).
  26. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html (2018).
  27. Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data. Methods in Ecology and Evolution. , (2016).

Tags

Genetica kwestie 140 Next-generation sequencing HIV-1 HIV sequencing proviruses één-proviraal HIV-DNA replicatie-bekwaamheid antiretrovirale therapie latency HIV reservoir geïntegreerde HIV
Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh,… More

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh, B. A., Palmer, S. Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58016, doi:10.3791/58016 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter