العصب استرشادا مشجعا حقن الخلايا الجذعية الذاتي قرب عصب حنجري المتكررة الأيسر الخيلي

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لحقن الخلايا الجذعية المشتقة من العضلات ذاتي بالقرب من عصب حنجري المتكررة بالمساعدة من مشجعا العصب الكهربائية. قد يصبح هذا الأسلوب رواية مفيدة لعلاج الخيول الاعتلال العصبي حنجري المتكررة.

Abstract

الاعتلال العصبي حنجري المتكررة (رلن) عادة يصيب الخيول ويتسم بالتعصب الأصوات وممارسة التنفس غير طبيعي. عصب حنجري المتكررة تظهر آفات demyelination. ثبتت فائدة تطبيق الخلايا الجذعية للأعصاب ديميليناتيد في مختلف نماذج حيوانية. وكان الهدف من هذه الدراسة لاختبار جدوى وسلامة حقن الخلايا العصبية المحيطة ذاتي المستمدة من العضلات الخلايا الجذعية الوسيطة إلى اليسار عصب حنجري المتكررة في الخيول صحية باستخدام مشجعا عصب كهربائية.

يتم الحصول على خلية ينبع المستمدة من العضلات من خمسة الخيول Standardbred صحية قبل أخذ العينات 20 ملغ أنسجة العضلات بإبرة خزعة 14 جرام شبه تلقائي من عضلة ثلاثية الرؤوس. حركات الحنجرة يتم رصده عن طريق التنظير الفيديو مجرى الهواء العلوي. اقترب من اليسار عصب حنجري المتكررة مع إبرة معزولة العصب كتلة. تحفيز العصب هو تطبيقها، بدءاً من 2 رصد mA، واختطاف ناجحة أريتينويد اليسرى. يتم تقليل كثافة التحفيز تدريجيا. ويلاحظ عند فقدان الاستجابة الحركية في 0.5 mA، 10⁷ ذاتي المستمدة من العضلات الجذعية يتم حقن الخلايا. نقاط فاحصين اثنين، الذين هم أعمى إلى النقطة الزمنية، الدالة حنجري الخيول قبل العلاج وفي يوم 1، 7، واليوم 28 بعد حقن الخلايا. في حصان السادسة، يتم حقن 1 مل ليدوكائين 2% مزيد تأكيد تحديد المواقع الصحيحة للابرة. وهذا يؤدي إلى شلل مؤقت الغضروف طرجهالي اليسرى.

تثبت هذه الدراسة أنه يمكن تناول عصب حنجري المتكررة بمساعدة مشجعا العصب الكهربائية وأن التحفيز الكهربائي للعصب جيد التحمل بالخيول. لم يلاحظ أي تعديل وظيفة الحنجرة في أي من الخيول بعد حقن الخلايا الجذعية. وينبغي إجراء مزيد من الدراسات لوصف آثار حقن الخلايا العصبية المحيطة ذاتي المستمدة من العضلات الخلايا الجذعية الوسيطة للخيول تعاني من رلن.

Introduction

رلن علم أمراض شائعة من مجرى الهواء العلوي في الخيول التي تتسم بدرجات متفاوتة من الشلل طرجهالي. الأكثر شيوعاً هو أثرت على الجانب الأيسر من الحنجرة. يمكن أن تصل إلى معدل انتشار هذا المرض تصل إلى 35 في المائة في قطاعات معينة من السكان الحصان. على الرغم من أن العديد من الفرضيات حاول أن يشرح والمسببات المرضية لهذا المرض، إلا أن السبب الدقيق رلن لا يزال غير مؤكد. علم الأمراض توصف بأنها axonopathy البعيدة العصب حنجري المتكررة مع الآفات ديمييلينيشن ولكن أيضا درجة معينة من ريميلينيشن. هذا أكسونوباثي يؤدي إلى إزالة التعصيب عضلات الحنجرة الجوهرية وما يصاحب ذلك من ضمور^1،2. هذه الأمراض تدريجيا ببطء في كثير من الأحيان، وقد يؤدي إلى خسارة كاملة لاختطاف طرجهالي الجانب المتضررة³.

الخيول المتأثرة تنبعث منها أصوات تنفسية غير طبيعية أثناء ممارسة، وأحيانا، تظهر ممارسة التعصب في الحالات الأكثر شدة. يتم إجراء التشخيص النهائي بفحص بالمنظار على حصان غير مخدراً دائمة حيث لوحظ فقدان جزئي أو كلي لاختطاف حنجري^1،،من²⁴. حاليا، العلاج الأكثر شيوعاً لارينجوبلاستي (تعرف أيضا باسم "التعادل خلفية")، الذي يرتبط في بعض الأحيان مع النخاعية-كورديكتومي. ورغم أن المعدل العام لنجاح هذه العمليات الجراحية تعتبر جيدة إلى ممتازة⁵، المضاعفات بعد العمليات الجراحية شائعة جداً. المضاعفات الأكثر شيوعاً فقدان تدريجي للاختطاف. بارنيت et al. وأفادت ⁶ فقدان درجة واحدة على الأقل للاختطاف خلال الأسابيع الستة الأولى بعد الجراحة في 76 في المائة على الأقل من الخيول. مضاعفات أخرى، مثل فشل بدلة، والسعال، والتلوث الجوي، هي أيضا الإبلاغ عن⁵.

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) كانت جزءا من الطب الخيول في البحوث والممارسة لأكثر من عقد، على الرغم من أن تثبت الدراسات على كفاءتها لا تزال نادرة. مصادر الاستغلال الأكثر شيوعاً اثنين من الكبار الخلايا الجذعية الوسيطة في الخيول هي نخاع العظام والأنسجة الدهنية⁷. كلا أساليب أخذ العينات الغازية نسبيا ولا تؤدي دائماً إلى عدد كاف من الخلايا. في الآونة الأخيرة، سيوستيرس et al. ⁷ وصف ثقافة الخلايا الجذعية المشتقة من أنسجة العضلات المخططة، التي يتم الحصول عليها بأسلوب ميكروبيوبسي أقل الغازية.

MSCs قادرون على التجديد الذاتي وتوليد الذاتي ومولتيبوتينسي والتمايز^7،8. قدرتهم على التمييز في جميع الأنساب mesoderm من الدهون والعظام والعضلات والغضاريف الآن راسخة⁹. ومع ذلك، تحت ظروف بيئية معينة، أنها يمكن أن تفرق في الأنساب غير الوسيطة مثل الخلايا العصبية، أستروسيتيس، والخلايا ميليناتينج الجهاز العصبي المحيطي والحبل الشوكي^9،10. قد استخدمت فعلا MSCs في الاعتلال العصبي عدة نماذج^10،11. وقد ثبت قدرتها على الهجرة إلى مناطق تحولت النسيج العصبي وعلى تجديد الخلايا العصبية بعد إدارة الشاملة والمحلية¹¹. وعلاوة على ذلك، يمكن توظيف خلايا شوان تشبه المستمدة من MSCs الضامة إزالة الحطام الخلوية وتفرز نيوروتروفيك عوامل تعزيز النمو محواري وريميلينيشن⁹.

الهدف من هذه الدراسة وصف تقنية حقن استرشادا مشجعا العصب المستمدة من العضلات الخلايا الجذعية الذاتي قرب عصب حنجري المتكررة الأيسر في الخيول صحية. نموذجياً، يتم استخدام مشجعا الأعصاب متصلة إبرة حقن للكهربائية-إضفاء الطابع المحلي على الأعصاب الطرفية من أجل تطبيق المخدرات الموضعية إلى أن المنطقة¹². يتم توفير دفعة ضعف تيار المباشر بالقرب من العصب للحث على استجابة الحركية. القدرة على إنتاج هذه الاستجابة الحركية يعتمد على معلمات متعددة، مثل منطقة موصلة إبرة، أي مقاومة من الأنسجة والحالية المطبقة ومدة النبضة والمسافة من الإبرة في العصب. العصب مشجعا الإبر مصممة لتحتوي على منطقة موصلة تقييدية للغاية في طرف الإبرة، بينما هو معزول بقية الإبرة. ويساعد هذا التصميم إلى دقة ترجمة العصب. المنبهات العصبية الحديثة تتكيف مع اختلاف الأنسجة ممانعات وتوصيل التيار المستمر على الجهاز. وعلاوة على ذلك، تستخدم معظم الآلات مدة نبض 0.1 s، حيث تكون المعلمات محسومة الحالية المطبقة والمسافة إلى الإبرة. يتم وصف العلاقة بين المسافة إبرة للأعصاب والحالية اللازمة لإنتاج استجابة محرك بقانون كولوم في: E = خمس/البحث والتطوير؛ ه هو المسؤول عن تحفيز المطلوبة، k هو ثابت كولوم في، س هو المسؤول عن تحفيز المطلوبة الحد الأدنى، حيث r هي المسافة بين الأقطاب اثنين. في الكهربائية-ترجمة الأعصاب، تعتبر المسافة بين قطبين إبرة للعصب مسافة¹². حشوة كهربائية تبدد بعد سيادة مربع معكوس من الإبرة للعصب مسافة¹³. وقد أظهرت الممارسة السريرية أن المحرك العصبية التحفيز في 0.5 mA ارتباطاً قويا إلى كتلة العصب الناجحة، وأن فقدان الإشارات الحركية في أقل من التيارات سوف يمنع المستخدم من إدارة حقن إينترانيورونال عرضي. الهدف من هذه الدراسة اختبار جدوى وسلامة هذا الأسلوب في عدد محدود من الخيول. إذا ثبتت جدوى وسلامة هذا الأسلوب، يمكن نقلها بسهولة إلى الخيول المتأثرة. كذلك، الخيول رلن يمكن أن تستخدم كنموذج للاعتلال العصبي المحيطي التنكسية.

Protocol

وافقت اللجنة للاستعمال الأخلاقي للحيوانات من جامعة لييج في بروتوكول الدراسة.

1-عضلة ميكروبيوبسي

1. تحديد موقع العينة بالفحص البصري والجس، في الرأس طويل عضلة ثلاثية الرؤوس، تقريبا من خط الوسط بين نقطة الكوع والنقطة من الكتف.
2. مقطع منطقة حوالي 2 × 2 سم² مع ماكينة كهربائية. تطبيق فرك الجراحية تتألف من الصابون السائل بولييوديدي والكحول يضغط لمدة 1 دقيقة على المنطقة المقطوعة. حقن تحت الجلد 1 مل محلول ليدوكائين 2% مع إبرة 25 غ في وسط المنطقة المقطوعة وتطهيرها.
3. فرك اليدين بالصابون اليد المضادة للبكتيريا. وضع قفازات معقمة. استخدام ثني عقيمة المتاح كسطح عقيمة لوضع إبرة خزعة وتروكار على.
4. ذراع إبرة خزعة 14 جرام شبه التلقائي عن طريق سحب إليه الربيع كما هو موضح في الأرقام 1 باء و جيم 1. الإفراج عن إبرة خزعة للحصول على دراية به إليه. ضع إبرة خزعة المسلح على السطح العقيمة. الحصول على دراية تروكار، الذي يتألف من قنية وسدادي كما هو مبين في الشكل 1.

الشكل 1 : مجموعة إبرة خزعة. مجموعة إبرة خزعة يتكون من () القنية وبه سدادي والخزعة الإبرة (من الأعلى إلى الأسفل). لوحات أخرى تظهر إبرة خزعة في (ب) محايدة والمسلح (ج) موقف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

5. إعداد تروكار عن طريق تجميع القنية وسدادي والاحتفاظ بها في موقف مغلق. إدخال في تروكار عمودياً على الجلد من خلال المنطقة المنزوعة الحساسية سابقا. المضي قدما في تروكار إلى موضع حيث غيض تروكار حوالي 1.5 سم في عمق العضلات. إخراج تروكار وتنأى القنية من سدادي به ومكان سدادي على سطح العقيمة.
6. إدخال إبرة خزعة المسلح من خلال القنية. إدخال الإبرة والقنيه من خلال شق الجلد في العضلات. دفع الإبرة إلى موضع حيث غيض الإبرة في منتصف الرأس طويل عضلة ثلاثية الرؤوس.
7. الإفراج عن إبرة خزعة وثم سحب إبرة خزعة جنبا إلى جنب مع القنية. سحب إبرة خزعة من القنية. اترك القنية على سطح العقيمة.
8. فتح إبرة خزعة بسحب الربيع مع يد واحدة وعقد مع الآخر.
   ملاحظة: العينة تصبح مرئية على طرف إبرة خزعة.
9. مع المساعدة من شخص ثان، فتح أنبوب عينة تحتوي على متوسط العينة. استخدام إبرة حقن ز 19 لإزالة قطعة صغيرة من العضلات من إبرة خزعة. المكان عينة العضلات في الأجلين المتوسط وأخذ العينات. إغلاق الأنبوب بسداده ملولبة وآماله بلطف أنه x 2 للتأكد من أن العينة هي عائمة في الأجل المتوسط.
10. ذراع إبرة خزعة. يتخذ القنية من على سطح الأرض العقيمة ويحشدوا إبرة خزعة المسلحة وقنية. إدخال إبرة مسلحة والقنيه من خلال شق الجلد كما تم وصفه سابقا. كرر الإجراء العينة x 2 – 3 حتى يتم أخذ عينات حوالي 20 ملغ أنسجة العضلات. أغلق أنبوب أخذ العينات. بلطف تشغيل الأنبوب 2 x لخلط القطع العضلات مع المتوسط أخذ العينات.
11. شحن العينات إلى المختبر في درجة حرارة ثابتة بين 4 إلى 8 درجات مئوية.
    ملاحظة: سوف ثم عملية المختبر العينة. يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
12. الإجراء هو جيد التحمل ولا يحترم وجع إلى جانب أخذ العينات. في الحدث غير المحتمل من وجع العضلات التي شوهدت في موقع أخذ العينات، إدارة العلاج مسكن مناسب.

2-معاملة الخلايا

ملاحظة: تم إعداد الخلايا الجذعية المستخدمة في هذه الدراسة وفقا للطريقة الموضحة من سيوستيرس et al. ⁷-هذه المقالة أيضا توصيف الخلايا.

1. ابدأ بإعداد متوسطة ثقافة معينة، DF20، بإضافة 20% من إبطال الحرارة الجنيني البقري المصل، 5 مل بنسلين (1000 وحدة دولية/مل)-ستربتوميسين (10,000 ميكروغرام/مل)، و 2.5 مل من الامفوتريسين ب (250 ميكروغرام/مل) باستخدام زجاجة من 500 مل من المتاحة تجارياً الثقافة المتوسطة مع الجلوتامين والفينول الحمراء.
2. صب 150 ميليلتر من مستنبت DF20 في كل من الآبار 16 الداخلية صحن 24-multi-جيدا. صب 1 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) [كلوريد البوتاسيوم (200 مغ/لتر) والبوتاسيوم فوسفات أحادية الطور (200 مغ/لتر)، وكلوريد الصوديوم (8,000 مغ/لتر) والبوتاسيوم الفوسفات ديفاسيك (2,160 مغ/لتر)] في الآبار الخارجي المتبقية.
3. شطف عضلة صغيرة قطعة x 2 في برنامج تلفزيوني. تفصل بينهما إلى قطع صغيرة جداً مع المساعدة من مشرط وملقط وقطعة صغيرة (من حجم غيض شفرة المبضع) في كل الداخلية 16 جيدا للطبق جيدا متعددة.
4. ضع الطبق جيدا متعددة في حاضنة الإبقاء على الشروط التالية: 37 درجة مئوية و 21% O₂و 5% CO₂. رصد الآبار يوميا تحت مجهر مقلوب وإضافة 50 ميليلتر من DF20 إذا لزم الأمر لمنع الخلايا من الجفاف.
   ملاحظة: بعد ما يقرب من 10 د، سيكون هناك ما يكفي من خلايا نمت من اكسبلانت للسماح بعزل الخلايا الجذعية. يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
5. عندما هالة خلايا مرئياً حول العضلات اكسبلانتس، وتجاهل explant أنسجة العضلات. فصل الخلايا باستخدام 150 ميليلتر محلول التربسين المحتوية على يدتا في كل بئر: تجاهل المتوسطة الثقافة وشطف الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، وتجاهل برنامج تلفزيوني، وإضافة الحل التربسين لمدة أقصاها 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. إضافة الثقافة المتوسطة التوقف عن العمل التربسين وحصاد تعليق خلية، وثم الطرد المركزي بتعليق خلية في 200 x غ لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. تجاهل المادة طافية وتعليق بيليه في محلول ملح متوازن.
6. نقل تعليق خلية في تدرج كثافة متقطع من 3 طبقات (15% و 25% و 35%). الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على تعليق خلية والحل متقطع الكثافة المتدرجة في س 1,250 ز لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية. يجب عدم استخدام الفرامل النابذة. ملاحظة كسور الخلية ذات الكثافة المختلفة التي ستظهر بين طبقات مختلفة من كثافة متقطع الحل التدرج بعد الطرد المركزي.
7. ما زالت الثقافة مع الكسر بين 15 و 25 في المائة. أنه نقل إلى أنبوب وتغسل بمحلول الملح متوازنة. الطرد المركزي من تعليق خلية في x 200 غ لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. تجاهل المادة طافية. المضي في تعليق بيليه في 1 مل DF20. بريفيل قارورة ثقافة الخليوي، بمساحة 25 سم²، مع 6 مل DF20. نقل الخلايا إلى قارورة ثقافة الخلية المعبأة والثقافة لهم في حاضنة بالشروط التالية: 37 درجة مئوية و 21% O₂و 5% CO₂.
   ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
8. رصد كل يوم تحت مجهر مقلوب الخلايا. تغيير الثقافة المتوسطة إذا لزم الأمر (تجاهل المتوسطة القديمة وإضافة 6 مل من جديد الثقافة المتوسطة). تحديد التقاء الخلوية عن طريق مراقبة طبقات الخلية في أطباق الثقافة، استخدام مجهر ضوئي في تكبير المعرفة مسبقاً. تقدير سطح الطبق الذي تحتله الخلايا. ويعمل في تكبير المجهري ثابتة لكل ملاحظة ليتمكن من تقييم الالتقاء. عندما تشغل الخلايا 85% سطح الطبق، المضي قدما في ممر من الخلايا.
9. عندما تكون الخلايا المتلاقية، فصل لهم استخدام حل التربسين المحتوية على يدتا مع البروتوكول نفسه كما هو موضح في الخطوة 2، 4. ثم الطرد المركزي بتعليق خلية في x 200 غ لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. تجاهل المادة طافية والمضي قدما في استثارة الخلايا في 5 مل DF20. مكان لهم في قارورة ثقافة الخليوي 175 سم² المعبأة مع 25 مل DF20. وضع في قارورة في حاضنة بالشروط التالية: 37 درجة مئوية و 21% O₂و 5% CO₂.
   ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
10. رصد كل يوم تحت مجهر مقلوب الخلايا. تغيير الوسط إذا لزم الأمر (تجاهل المتوسطة القديمة وإضافة 30 مل متوسطة الجديدة). عندما تكون الخلايا المتلاقية، فصل عليها باستخدام يدتا التربسين كما هو موضح في الخطوة 2، 4. ثم الطرد المركزي بتعليق خلية في x 200 غ لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. تجاهل المادة طافية وتعليق الخلايا في 6 مل DF20. 1 مكان مل من تعليق خلية في ستة 175 سم² قوارير، كل المعبأة مع 25 مل DF20، والثقافة لهم عند 37 درجة مئوية في حاضنة₂ CO (مع 21% O₂ و 5% CO₂).
11. رصد كل يوم تحت مجهر مقلوب الخلايا. تغيير الوسط إذا لزم الأمر (تجاهل المتوسطة القديمة وإضافة 30 مل متوسطة الجديدة في كل قارورة). عندما تكون الخلايا المتلاقية، فصل عليها باستخدام يدتا التربسين كما هو موضح في الخطوة 2، 5. الطرد المركزي منهم 3 x في x 200 غ لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية وتجاهل المادة طافية في كل خطوة.
12. عد الخلايا بمساعدة Bürker عد الدائرة ومجهر ضوء. إعداد تعليق خلوية لخلايا/مل 10 مليون من وسيلة للواسمات محددة.
13. التجميد العميق الجرعات العلاجية 1 × 10⁷ خلايا في 1 مل من تجميد المتوسطة وتخزينها في مرحلة البخار للنتروجين السائل حتى استخدامها.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
14. شحن الخلايا في القنينة في الثلج الجاف للاستخدام النهائي.

3-حقن الخلايا

ملاحظة: يلزم شخصين القيام بحقن الخلايا الجذعية.

1. الحارة بتعليق خلية تدريجيا إلى درجة حرارة الغرفة. نضح التعليق في محقن 2 مل.
2. رصانة الحصان عن طريق حقن ديتوميديني 10 ميكروغرام/كغ في حبل الوريد بإبرة حقن ز 19. انتظر لمدة 5 دقائق لمعرفة التأثير الكامل للتخدير، الذي يصبح مرئياً بوضع الرأس إلى أسفل مميزة الحصان.
3. مقطع منطقة 20 × 10 سم² على المنطقة اليسرى حنجري الحصان مع المقص، كما هو مبين في الشكل 2. ثم قم بتطبيق فرك جراحية بولييوديدي الصابون والكحول في المنطقة المقطوعة.
4. مكان المنظار فيديو قياسية مرنة عن طريق الآنف الأيسر الحصان ودفع نحو البلعوم الأنفي. ضبط موضع المنظار حتى يتم الحصول على مرأى ومسمع من غضاريف طرجهالي وابيجلوتيس. عقد المنظار في هذا الموقف أثناء الإجراء وتشغيل شاشة المنظار الفيديو تجاه المشغلين.
5. قم بتوصيل إبرة تحفيز/حقن القطب مشجعا العصب السلبي. المحافظة على ظروف معقمة الإبرة. قم بتوصيل القطب إيجابية من مشجعا العصب على تصحيح قطب، الذي هو تمسك إلى المنطقة الجلد المقطوعة.
6. الاتصال المحاقن التي تحتوي على تعليق خلية إلى خط الحقن وبريفيل على أنبوب لمطاردة هواء النظام. تذكر أن حجم النظام وإعداد حقنه بنفس الحجم من المحلول الملحي المعقم.
7. إذا لم تكن مألوفة مع هذا الأسلوب، استخدام محول الموجات فوق الصوتية خطي ميغاهرتز 5 إلى 7 تطهيرها لتصور الهياكل التشريحية في منطقة اهتمام. استخدام الموجات فوق الصوتية عقيمة اقتران جل لزيادة جودة الصورة. تصور الحنجرة والسفن التي تعمل في المنطقة الظهرية الحنجرة.
8. وبمجرد دراية بتشريح للمنطقة، إدخال إبرة حقن التحفيز/تجاه الجانب dorsolateral الحنجرة. عندما تقترب من الجانب دورسولاتيرال الحنجرة، بدء مشجعا العصب في وضع التحفيز 1 هرتز مع تيار 2 اماه.
9. تحرك الإبرة تجاه موقف عصب حنجري المتكررة مع مراعاة رأي المنظار على الشاشة بلطف. حالما يتم اختطاف حركة الغضروف طرجهالي اليسرى تظهر على شاشة الفيديو، الحد الحالي حتى تختفي الحركة مع إبقاء الإبرة في المكان.
10. تحديد موقف مثالي من الإبرة. النظر في فقدان الاستجابة الحركية في 0.5 mA كمسافة مثالية من العصب. عندما تستمر تحركات غضروف طرجهالي في تيارات أقل من 0.4 mA، لا حقن الخلايا، كما أنه قد ينتج عن حقن إينترانيورونال.
11. عند فقدان الاستجابة الحركية في 0.5 mA الملاحظ، حقن تعليق الخلية التي تحتوي على الخلايا الجذعية الذاتي 10⁷ ومسح خط الحقن مع المحلول الملحي الذي أعد في الخطوة 3، 6. وهذا سوف تضخ بقية تعليق الخلية التي بقيت في الأنبوب الحقن.
12. بعد حقن الخلايا، إخراج الإبرة و المنظار.
13. واسمحوا الحصان التعافي من التخدير. لا مزيد من العلاج المسبق لموقع خزعة.

Representative Results

وافقت اللجنة للاستعمال الأخلاقي للحيوانات من جامعة لييج في بروتوكول الدراسة. وأدرجت ستة خيول من قطيع الخيول البحوث في مركز أبحاث الخيول مونت-لو-سوى في هذه الدراسة. في أول حصان، كان المترجمة عصب حنجري المتكررة التي اليكتروستيمولاتيون. ويبين الشكل 2 الإعداد المستخدمة، مع إبرة تحفيز تدخل في الجانب الأيسر dorsolateral الحنجرة الحصان في مشجعا العصب. ويلاحظ عند فقدان حركة الغضروف طرجهالي في 0.5 mA، 1 مل يدوكائين 2% يتم حقن. وادي ذلك إلى عدم وجود حركة في تيارات أعلى وشلل مؤقت من أريتينويد اليسرى. مراقبة التنظير، 24 ساعة في وقت لاحق، كشف انتعاش كامل من الدالة طرجهالي. وكرر البروتوكول بالكامل بنجاح في الخيول الخمس. لم يظهر أي من الخيول إلى رد فعل سلبي على ميكروبيوبسي العضلات. في جميع الخيول، كانت تزرع عدد كاف من الخلايا في الوقت المحدد. وأجرى التنظير مجرى الهواء العلوي في جميع الخيول الخمسة وعشرات الدالة حنجري الأول أو الثاني-1 طبقاً لروبنسون et al. تم تحديد ¹⁴ . جميع الخيول التسامح تحفيز العصب العصب حنجري المتكررة جيدا جداً. لا رد فعل سلبي ولوحظ أثناء أو بعد التنشيط أو حقن الخلايا الجذعية.

سجلت كل تنظير وسجل الأطباء أعمى اثنين. لم يكن هناك فرق بين الحقن قبل العشرات من وظائف الحنجرة والدرجات التي تم الحصول عليها في اليوم 1 و 7 و 28 بعد حقن الخلايا الجذعية، كما تم اختبارها ب تحليل رتبة الرتبي¹⁵. ويلخص الجدول 1 عشرات حنجري جميع الخيول في نقاط زمنية مختلفة، فضلا عن الوقت الذي من إدخال الإبرة حقن الخلايا الجذعية والحالية التي أثارت حركة طرجهالي عند الخلايا حيث حقن.

الخلايا التي استخدمت في هذه الدراسة قد أعدت وفقا لبروتوكول نشر سابقا⁷. الخلايا من جميع الكسور كانت قادرة على التمايز تريلينيجي، وأعرب عن CD90 و CD44، لم يبد CD45 والثاني MHC، وكان كلونوجينيك القدرات. تم اختيار خلايا كسر 15 – 25% لمزيد من المعالجة لأنها أظهرت تعبيراً أكبر عن CD90 وقدرات التكاثري أكبر.

وكان الهدف من هذه الدراسة لا لاختبار كفاءة تطبيق الخلايا الجذعية لتجديد الأعصاب طرفية تالفة ولكن فقط لاختبار جدوى الإجراء وتقييم سلامة حقن الخلايا الجذعية للعصب حنجري المتكررة في smal l عدد الخيول صحية. عدم وجود أية تغييرات وظيفية في التصوير بالمنظار في الخمس الخيول تصل إلى 28 يوما بعد الحقن وعدم وجود أي علامات سريرية في أربع من الدول الخمس أحصنة تصل إلى 1 سنة بعد الحقن تؤكد الجدوى وسلامة الإجراءات. حصان واحد قد يكون euthanized في فترة المتابعة لأسباب لا علاقة لها بالدراسة. على الرغم من أن التقنيات التي تثبت أن تكون آمنة في عدد صغير من الخيول، عدد الخيول المدرجة في هذه الدراسة منخفض جداً لإثبات عدم وجود الأحداث النادرة.

	نقاط قبل الحقن	الوقت لحقن (دقيقة)	الحالي في حقن (mA)	نقاط في اليوم الأول بعد حقن	نقاط في اليوم السابع بعد الحقن	نقاط في يوم 28 وظيفة حقن
الحصان 1 (ستانداردبريد، ماري، 16 سنة)	ثانيا-1	12	0.5	أنا	ثانيا-1	ثانيا-1
حصان 2 (ستانداردبريد، ماري، 22 سنة)	أنا	3	0.7	أنا	أنا	أنا
الحصان 3 (ستانداردبريد، ماري، 11 سنة)	ثانيا-1	4	0.5	ثانيا-2	ثانيا-1	ثانيا-1
حصان 4 (ستانداردبريد، ماري، 12 سنة)	أنا	7	0.5	أنا	ثانيا-1	أنا
حصان 5 (ستانداردبريد، ماري، 10 سنوات من العمر)	أنا	3	0.7	ثانيا-1	أنا

الجدول 1: سيجنالمينت وسرطانات يعمل عشرات الخيول. يظهر هذا الجدول وقت الحقن، الحالي أدنى إثارة أي حركة طرجهالي قبل الحقن، وعشرات حنجري خمسة الخيول صحية قبل وفي يوم 1 و 7 و 28 بعد الحقن ذاتي المستمدة من العضلات الخلايا الجذعية الوسيطة في قربها من العصب المتكررة حنجري الأيسر. الحصان #5 لم تكن متاحة لعنصر التحكم في يوم 28 بعد الحقن لأسباب لا علاقة لها بهذه الدراسة. العشرات تشير إلى عشرات وصف روبنسون et al. ¹⁴-وهنا نقاط أنا يعني أن تحركات كلا غضاريف طرجهالي كانت متناظرة وغير المتزامن، ويمكن الحصول عليها اختطاف كلا غضاريف طرجهالي كاملة والحفاظ على. نقاط ثانيا-1 يعني أن تحركات غضاريف طرجهالي غير متزامن أو قد تكون غير متماثلة في أوقات معينة؛ ومع ذلك، يمكن الحصول على اختطاف كاملة لكلا غضاريف طرجهالي والإبقاء على.

الشكل 2 : إعداد خلال حقن الخلايا الجذعية. وعرض على الجانب الأيسر من الحنجرة إبرة تحفيز الأعصاب وتوجه نحو اليسار عصب حنجري المتكررة. يتم تعيين مشجعا العصب في 0.8 اماه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

ويصف هذا البروتوكول التطبيق الناجح للخلايا الجذعية الذاتي المستمدة من العضلات للأعصاب حنجري المتكررة في الخيول باستخدام نهج استرشادا مشجعا عصب. وقد وصف الحصاد العينة ميكروبيوبسي العضلات، فضلا عن العزلة والثقافة، وتوصيف الخلايا الجذعية، بالتفصيل من قبل، بينما حقن هذه الخلايا بالقرب من الأعصاب طرفية الأصلي. الكهربائية-إضفاء الطابع المحلي على العصب مع مشجعا عصب كهربائية خدم لهذه الدراسة، وكان يستخدم لحقن الخلايا الجذعية الوسيطة في الجوار المباشر للعصب حنجري المتكررة. وراقب التنظير الفيديو عن طريق البلعوم الأنفي الاستجابة الحركية. إذا، أثناء عملية تحديد المواقع من الإبرة، حفز أعصاب أخرى، كانت الحركة المقابلة مرئياً على الشاشة التنظير. حفز نجاح العصب حنجري المتكررة اتسمت باختطاف الغضروف طرجهالي نموذجية. في حصان واحد، تم حقن مخدر موضعي للحث على شل العضلات طرجهالي عابرة. على الرغم من أن لم يتم اختباره نجاح زرع الخلايا بالقرب من العصب على وجه التحديد في هذه الدراسة، أثبتت الكهربائية-إضفاء الطابع المحلي على الأعصاب وحقن الحالية منخفضة أن الخلايا الجذعية طبقت قرب العصب. وتجلى بقرب إينجيكتاتي في العصب كذلك كتلة محرك ناجح الناجم عن حقن مخدر موضعي.

في الخيول الخمسة المتبقية، الوقت من التحفيز الأول حتى حقن الخلايا الجذعية النجاح تتباين من 3 إلى 12 دقيقة الخيول كانت طفيفة مخدراً أثناء الإجراء، الذي زاد من امتثالها للتحفيز الكهربائي. لم يظهر أي من الخيول ردود الفعل السلبية في أي وقت، مشيراً إلى أن مدة التنشيط يمكن إطالة إذا لزم الأمر للحصول على إبرة جيدة لتحديد المواقع. ومن المتوقع حاد منحنى التعلم التي سيحتفل بها إذا كان المشغل هو استخدام هذه التقنية بانتظام وفي عدد أكبر من الخيول مع تشريح متفاوتة.

عادة الخيول تعاني من رلن، التي تتسم بدرجات متفاوتة من الشلل الذي أصاب الغضروف طرجهالي اليسرى مما أدى إلى أصوات تنفسية غير طبيعية وممارسة التعصب. الأنسجة الأعصاب المتأثرة يكشف آفات نموذجية من الاعتلال العصبي المحيطي¹⁶. اعتلال الأعصاب المحيطية مصطلح يستخدم لوصف أنواع مختلفة من آفات الأعصاب المحيطية مما يؤدي إلى ضعف الأحاسيس أو حركات أو وظائف الجهاز. وأسباب اختلافاً كبيرا ويمكن أن تشمل مرض السكري، والمغذيات، علاج بعقاقير معينة، إصابات الرضية، الاسكيمية، أو عدوى، أو أنها يمكن أن تكون مجهولة السبب. مستقلة عن السبب، اعتلالات الأعصاب المحيطية حصة علامات نسيجية الشائعة، مثل انحطاط واليريان أو axonopathy البعيدة demyelination المجزأ. وقد ثبت أن إدارة الخلايا الجذعية الوسيطة إلى تلف الأعصاب الطرفية قد تكون مفيدة لانتهاء التجديد؛ ومع ذلك، ليست مفهومة جيدا الآليات الكامنة. تقليديا، ونحن نعتقد أن الخلايا الجذعية الوسيطة سوف تفرق فقط في موروث من الدهنية والعضلات والغضاريف وأنسجة العظام، ولكن تحت شروط معينة، قد ثبت أن تفرق في ميوسيتيس¹⁷، أستروسيتيس¹⁸ ، والخلايا ميليناتينج الطرفية¹⁹ والجهاز العصبي المركزي¹⁹. أثناء وجود ثقافة في المختبر ، سوف يفضلون تعرض إلى neuropeptides التفريق بين الخلايا الجذعية الوسيطة في خلايا معربا عن علامات العصبية^21،22. أظهرت العديد من الدراسات في فيفو الآثار المفيدة للخلايا الجذعية الوسيطة في العصب التجدد وانتعاش وظيفية في نماذج الفئران للعصب الوركي إصابة^10،23. ربما يحدث هذا بسبب الظروف البيئية المواتية التي تسهم في التفريق بين الخلايا الجذعية إلى خلايا الأنسجة على حدة²⁴. وينبغي التحقيق الدراسات المستقبلية أيضا هذا الأسلوب لإدارة خلايا متمايزة مسبقاً في الخيول المتأثرة رلن.

على حد علمنا، هذا هو التقرير الأول الذي يصف استخدام مشجعا العصب لتعريب الأعصاب طرفية من أجل حقن علاج محدد في ذلك. أمراض الأعصاب المحيطية الأخرى في الأنواع المختلفة، مثل الأم الأعصاب، يمكن أن تعامل الإدارة للخلايا الجذعية بالقرب من^25،الأعصاب²⁶. ينبغي اختبار تأثير هذا الأسلوب في المرضى السريرية الدراسات المستقبلية والتحقيق خطر الهجرة والإمكانات للتفريق بين حقن الخلايا.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Detomidine (Domidine)	Dechra		sold through pharmacy
Lidocaine (Xylocaine)	Movianto		sold through pharmacy
TOF Watch S (Nerve stimulator)	Alsevia	79950161
TSK Starcut (Biopsy needle)	STSK laboratory	SAG - 14090C
Electrostimulation needle	Pajunk	001185-79
DMEM - F12 (culture medium)	Lonza	LO BE12-719F
Heat inactivated FBS	Life technologies	10500
Penicillin-streptomycin	Lonza	DE17-602E
Amphotericin B (Fungizone)	Lonza	17-836E
Phospate buffered saline	Lonza	LO BE17-512F
24-multiwell dish	Corning	3524
Trypsin	Life technologies	12604
HBSS	Lonza	LO BE10-508F
Percoll PLUS	GE Healthcare	17544502
NaCl	Sigma	S8776
T-25 cm² flasks	Nunclon	136196
T-175 cm² flasks	Nunclon	178883
Cryostore CS5	Biolife solutions	205373