Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 注射自体肌源干细胞在接近喉返神经的帮助下, 神经刺激器。这项新的技术可能会有助于治疗马复发性喉神经病变。
Abstract
喉返神经病 (RLN) 通常影响马匹, 其特点是异常的呼吸声音和运动不耐受。喉返神经表现为脱髓鞘病变。在各种动物模型中, 应用干细胞脱髓鞘神经的好处已经得到了证明。本研究的目的是通过使用电神经刺激器, 测试在健康马匹的左喉返神经的周围神经元注射自体肌间充质干细胞的可行性和安全性。
肌肉衍生的茎细胞是从五健康的 Standardbred 马, 通过取样20毫克的肌肉组织与半自动 14 G 活检针从三头肌。通过上呼吸道视频内窥镜监测喉部的运动。左侧喉返神经与绝缘神经阻滞针接触。神经刺激被应用, 从 2 mA 开始, 并且成功的绑架左杓被监视。刺激强度逐渐降低。当 0.5 mA 观察到马达反应丢失时, 注射 107自体肌肉源干细胞。两名考官, 谁是失明的时间点, 得分的喉功能的马匹治疗之前和1天, 7 天, 28 天后, 注射细胞。在第六匹马, 注射1毫升2% 利多卡因进一步确认正确的定位针。这导致左杓软骨暂时麻痹。
这项研究证明, 喉返神经可以在电神经刺激器的帮助下接近, 而这种神经的电刺激很好地被马匹所耐受。在任何马匹注射干细胞后, 均未观察到喉功能的改变。应进行进一步的研究, 以描述周围神经元注射自体肌间充质干细胞对 RLN 的马匹的影响。
Introduction
RLN 是马上呼吸道的常见病理表现为不同程度的杓麻痹。喉的左侧是最常见的影响。在某些马种群中, 这种疾病的患病率可达35%。虽然有几个假说试图解释这种疾病的病因和发病机制, 但 RLN 的确切原因仍然不确定。病理被描述为喉返神经的远端 axonopathy 与脱髓鞘病变, 但也有一定程度的 remyelination。这 axonopathy 导致固有喉部肌肉的神经支配和伴随萎缩1,2。这种病理学往往缓慢进步, 并可能导致完全丧失杓绑架的受影响的一侧3。
受影响的马匹在运动期间发出异常的呼吸声音, 有时在更严重的情况下表现出运动不耐受。明确诊断是由内镜检查的非镇静站立马, 其中部分或全部损失的喉部诱拐观察1,2,4。目前, 最常见的治疗方法是会厌 (也称为 "栓背"), 有时与脑室声带切除术。虽然这些手术的整体成功率被认为是好到优秀5, 手术后并发症是非常常见的。最常见的并发症是逐渐失去诱拐。巴奈特等。6报告说, 至少在76% 匹马的手术后的前六周内, 至少有一级诱拐发生。其他并发症, 如假肢失败, 咳嗽和呼吸道污染, 也报告5。
骨髓间充质干细胞 (MSCs) 在研究和实践中一直是马医学的一部分, 在过去的十年中, 尽管对其效率的证明性研究仍然缺乏。最常见的两种来源的成人骨髓间充质干细胞的马匹是骨髓和脂肪组织7。两种取样技术都是相对侵入性的, 并不总能导致足够数量的细胞。最近, Ceusters等。7描述了由一种微创 microbiopsy 技术获得的横纹肌组织产生的干细胞培养。
MSCs 具有自我更新、自生成、多向分化潜能和分化7、8的能力。他们的能力分化成所有胚层血统的脂肪, 骨骼, 肌肉和软骨现在已经建立9。然而, 在特定的环境条件下, 它们可以分化为非间质血统, 如神经元、星形胶质细胞、周围神经系统的 myelinating 和脊髓9、10。MSCs 已经被用于一些神经病模型10,11。他们的能力迁移到退化的神经组织地区和再生神经细胞已经证明了在系统和地方管理11。此外, 从 MSCs 中提取的许旺样细胞可以招募巨细胞来去除细胞碎片, 分泌神经营养因子促进轴突生长和 remyelination9。
本研究的目的是描述神经刺激器引导注射的肌肉衍生自体干细胞附近的左喉返神经的健康马。通常, 与注射针连接的神经刺激器用于周围神经的电定位, 以便将局部麻醉药应用到该区域12。微弱的直流脉冲供应在接近神经附近导致马达反应。产生这种马达反应的能力取决于几个参数, 如针的导电面积, 组织的任何阻抗, 电流的应用, 脉搏持续时间, 以及从针到神经的距离。神经刺激针被设计成有一个非常限制性的传导区域在针的尖端, 而其余的针是绝缘的。这种设计有助于精确定位神经。现代神经刺激适应不同的组织阻抗和交付恒定的安培量设置在机器上。此外, 大多数机器使用的脉冲持续时间为0.1 秒, 因此决定参数是电流的应用和距离的针。用库仑定律描述了针-神经距离与产生电机响应所需电流之间的关系: E = kQ/r;当 E 是所需的刺激电荷时, k 是库仑常数, Q 是所需的最小激励电荷, r 是两个电极之间的距离。在神经的电定位中, 两个电极之间的距离被认为是针到神经距离的12。电荷在针到神经距离的逆平方的规则下消散13。临床实践表明, 0.5 mA 的运动神经刺激与成功的神经阻滞密切相关, 而在较低电流下的电机信号丢失将阻止用户进行意外 intraneuronal 注射。本研究的目的是在数量有限的马匹中测试这种技术的可行性和安全性。如果这项技术的可行性和安全性得到确认, 可以很容易地转移到受影响的马匹。此外, 马 RLN 可作为周围变性神经病变的模型。
Protocol
君主大学动物伦理使用委员会批准了这项研究议定书。
1. 肌肉 Microbiopsy
- 通过目视检查和触诊, 在肱三头肌的长头部, 大约在肘点和肩部点之间的中线, 确定样品部位。
- 夹子一个区域大约 2 x 2 cm2与电子剪。应用由 polyiodide 液皂和酒精压缩的外科磨砂, 在修剪过的区域1分钟。注射1毫升2% 利多卡因溶液与25克针在修剪和消毒区的中心。
- 用抗菌洗手皂擦洗手。戴上无菌手套。使用一次性无菌悬垂作为无菌表面放置活检针和套管针。
- 手臂的半自动14克活检针通过拉弹簧机构, 如图 1b和1c所示。释放活检针, 以了解其机制。将武装活检针放在不育的表面上。熟悉套管针, 包括套管和闭孔, 如图 1所示。
图 1: 活检针设置.活检针组由 (a) 套管及其闭孔和活检针 (从上到下) 组成。其他面板显示活检针在其 (b) 中性和 (c) 武装位置。请单击此处查看此图的较大版本.
- 通过组装套管和闭孔来准备套管, 并将其保持在锁定位置。通过以前的麻木区, 垂直地向皮肤介绍套管针。把套管提前到一个位置, 其中套管的尖端是大约1.5 厘米深的肌肉。取出套管, 将套管与其闭孔分离, 将闭孔放在不育的表面上。
- 通过插管介绍武装活检针。介绍针和套管通过皮肤切口进入肌肉。将针头向前推进到一个位置, 针的尖端位于三头肌的长头部中间。
- 释放活检针, 然后拔出活检针与套管一起。把活检针从套管里。把套管放在不育的表面上。
- 用一只手拉动弹簧, 并将其与另一只手握在一起, 打开活检针。
注: 标本在活检针尖端可见。 - 在第二个人的帮助下, 打开包含样品介质的样品管。用19克皮下注射针从活检针上取出小肌肉块。将肌肉样本放在取样介质中。用螺钉盖合管, 轻轻倾斜2x 以确保样品在介质中浮动。
- 手臂活检针。从不育的表面采取套管, 重新组装武装活检针和套管。介绍武装针和套管通过皮肤切口如前所述。重复样品过程2–3x 直到大约20毫克肌肉组织被取样。关闭取样管。轻轻地转动管子 2x, 将肌肉碎片与取样介质混合。
- 将样品运送到实验室在恒定的温度在4到8°c 之间。
注: 实验室将处理样品。协议可以在这里暂停。 - 该程序是良好的耐受性和疼痛的取样方没有观察到。在取样部位出现肌肉酸痛的可能性不大, 应进行适当的镇痛治疗。
2. 细胞的治疗
注: 本研究所用的干细胞是根据 Ceusters等方法制备的。7. 他们的文章还描述了细胞的特性。
- 从准备特定的培养基开始 DF20, 通过加入20% 的热灭活胎牛血清, 5 毫升青霉素 (1000)-链霉素 (1万µg/毫升), 和2.5 毫升的两性霉素 B (250 µg/毫升) 到一瓶500毫升的商业可用培养基与谷氨酰胺和苯酚红色。
- 将150µL 的 DF20 培养基倒入24多井菜的内16口。将1毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) [氯化钾 (200 毫克/升), 磷酸钾单相 (200 毫克/升), 氯化钠 (8000 毫克/升), 磷酸钾双相 (2160 毫克/升)] 倒入剩余的外水井中。
- 在 PBS 中冲洗小肌肉片2x。在手术刀和镊子的帮助下将它们分成非常小的片断, 在多井菜的每个 inner-16 井中放置一个小块 (刀刃的尖端大小)。
- 将多井菜放在保持在以下条件的孵化器中:37 °c, 21% O2, 5% CO2。每天在倒置显微镜下对水井进行监测, 必要时添加50µL DF20, 以防止细胞干燥。
注: 大约10维后, 将有足够的细胞从外植体中生长, 以允许干细胞分离。协议可以在这里暂停。 - 当细胞的光晕在肌肉外植体周围可见时, 丢弃肌肉组织的外植。在每个井中使用含 EDTA 的胰蛋白酶溶液的150µL 分离细胞: 丢弃培养基, 用1毫升 pbs 冲洗细胞, 丢弃 pbs, 并在37摄氏度的最大10分钟内加入胰蛋白酶溶液。添加培养基以停止胰蛋白酶的作用, 收获细胞悬浮, 然后, 离心细胞悬浮在 200 x g 10 分钟37摄氏度。丢弃上清液, 在平衡的盐溶液中悬浮颗粒。
- 在3层 (15%、25% 和 35%) 的不连续密度梯度上转移细胞悬浮。离心管包含细胞悬浮和不连续密度梯度溶液在 1250 x g 20 分钟在25°c。不要使用离心机的刹车。观察离心后不连续密度梯度溶液不同层间出现的不同密度的细胞分数。
- 继续文化以分数在15和25% 之间。把它转移到管子里, 用平衡的盐溶液冲洗。离心机细胞悬浮在 200 x g 10 分钟在37°c。放弃上清。继续在1毫升的 DF20 中悬浮颗粒。预先填充细胞培养瓶, 具有25厘米2的表面, 6 毫升的 DF20。将细胞转移到预先填入细胞培养瓶中, 并将其培养成具有以下条件的孵化器: 37°c, 21% O2, 5% CO2。
注意: 协议可以在这里暂停。 - 每天在倒置显微镜下监测细胞。必要时改变培养基 (丢弃旧培养基, 加入6毫升新培养基)。通过在预定的放大器上使用光学显微镜观察培养皿中的细胞层, 确定细胞汇流。估计被细胞占据的盘子的表面。在一个固定的微观放大倍数为每个观察能够评估汇流。当细胞占据盘子表面的85% 时, 进行细胞的通道。
- 当细胞汇合时, 用含有 EDTA 的胰蛋白酶溶液将它们分离, 并与步骤2.4 中所述相同的协议。然后, 离心机的细胞悬浮在 200 x g 10 分钟37摄氏度。放弃上清, 并进行泥沙的细胞在5毫升的 DF20。将它们放入175厘米2预先填入的细胞培养瓶中, DF20 25 毫升。将烧瓶放在孵化器中, 条件如下: 37°c, 21% O2, 5% CO2。
注意: 协议可以在这里暂停。 - 每天在倒置显微镜下监测细胞。必要时改变培养基 (丢弃旧介质, 加入30毫升新培养基)。当细胞汇合时, 用胰蛋白酶-EDTA 分离它们, 如步骤2.4 所述。然后, 离心机的细胞悬浮在 200 x g 10 分钟37摄氏度。丢弃上清, 并在6毫升的 DF20 中悬浮细胞。安置1毫升细胞悬浮入六 175 cm2个烧瓶, 每预先填入与25毫升 DF20 和文化他们在37°c 在 CO2孵化器 (与 21% O2和 5% CO2)。
- 每天在倒置显微镜下监测细胞。必要时改变培养基 (丢弃旧介质, 并在每个烧瓶中添加30毫升新培养基)。当细胞汇合时, 用胰蛋白酶-EDTA 分离它们, 如步骤2.5 所述。离心他们3x 在 200 x g 10 分钟在37°c 并且放弃上清在每个步。
- 在 Bürker 计数室和光显微镜的帮助下计数细胞。准备一个细胞悬浮1000万细胞/毫升的特定冷冻保存培养基。
- 深度冷冻 1 x 107细胞在1毫升冷冻保存培养基中的治疗剂量, 并将其贮存在液氮的蒸气相中, 直至使用。
注意: 协议可以在这里暂停。 - 把瓶子里的细胞放在干冰上最后使用。
3. 注射细胞
注: 两个人需要执行注射干细胞。
- 将细胞悬浮温度逐渐升高至室温。将悬浮液吸入2毫升注射器。
- 用19克皮下注射针将 detomidine 10 µg/千克注入颈静脉, 使马镇静。等待5分钟, 以观察镇静的充分的作用, 由马的特征的顶头向下位置变得可看见。
- 剪辑一个区域 20 x 10 厘米2在马的左喉区与一把剪刀, 如图 2所示。然后, 将 polyiodide 肥皂和酒精的外科擦洗用在修剪过的区域。
- 放置一个灵活的标准视频内窥镜通过左鼻孔的马和推进它向鼻咽。调整内窥镜的位置, 直到得到杓软骨和会厌的完整视图。在手术过程中将内窥镜保持在这个位置, 并将视频内窥镜的屏幕转向操作者。
- 将刺激/注射针连接到神经刺激器的负极。保持针的不育条件。将神经刺激器的正电极连接到电极贴片上, 粘在被修剪过的皮肤区域。
- 将含有细胞悬浮液的注射器连接到注射线上, 预先填充管以追赶系统的空气。记住系统的体积, 并准备一个注射器与无菌盐水溶液的数量相同。
- 如果不熟悉这一技术, 使用消毒5至7兆赫线性超声传感器, 以可视化的解剖结构在该地区的兴趣。使用无菌超声耦合凝胶提高图像质量。可视化喉部和在喉背区运行的血管。
- 一旦熟悉该地区的解剖学, 介绍刺激/注射针向侧方面的喉。当接近喉的侧方面时, 在1赫兹刺激模式下启动神经刺激器, 电流为2毫安。
- 在观察屏幕上的内窥镜视图时, 轻轻地将针头移向喉返神经的位置。一旦左杓软骨的绑架运动在视频屏幕上可见, 减少电流, 直到运动消失, 同时保持针到位。
- 确定针的理想位置。考虑到 0.5 mA 的电机响应损失, 作为理想的距离神经。当杓软骨运动持续在低于 0.4 mA 的电流, 不要注入细胞, 因为这可能导致 intraneuronal 注射。
- 当观察到 0.5 mA 的马达反应损失时, 注射含有 107自体干细胞的细胞悬浮液, 并用步骤3.6 中制备的盐水溶液冲洗注射线。这将注入其余的细胞悬浮液留在注射管。
- 注射后的细胞, 取出针和内窥镜。
- 让马从镇静中恢复过来。活检现场不需要进一步治疗。
Representative Results
君主大学动物伦理使用委员会批准了这项研究议定书。本研究包括六匹马, 来自 Soie 马研究中心的研究马匹群。在第一匹马, 喉返神经被刺激的局部化。图 2显示了使用的设置, 刺激针插入到马的喉的左侧方面在神经刺激器。当杓软骨的运动损失被观察在 0.5 mA, 1 毫升2% 利多卡因被注射。这导致了在更高的潮流没有运动和左杓的暂时的麻痹。控制内窥镜, 24 小时后, 显示完全恢复的杓功能。五匹马成功地重复了完整的协议。没有一匹马表现出对肌肉 microbiopsy 的消极反应。在所有马匹中, 有足够数量的细胞在设定的时间内生长。根据罗宾逊等五匹马和1的喉功能评分, 对上呼吸道内镜进行了分析。14是坚定的。所有马匹都耐受了喉返神经的神经刺激非常好。无不良反应在刺激或注射后观察到干细胞。
所有的内窥镜都被两个失明的临床医生记录和得分。在1、7和28天, 在干细胞注射后, 魏氏等级分析15的测试中, 喉功能的预注射分数与获得的分数没有差别。表 1总结了在不同时间点的所有马匹的喉分, 以及从插入针到干细胞注入的时间, 以及当细胞注射时引发杓运动的电流。
在本研究中使用的细胞是根据以前发表的7协议编写的。所有分数的细胞都能 trilineage 分化, 表达 CD90 和 CD44, 没有表达 CD45 和 MHC II, 并具有克隆能力。15–25% 分数的细胞已被选择进行进一步的处理, 因为它们显示了最大的表达 CD90 和最大的增殖能力。
本研究的目的不是测试干细胞应用的效率, 以再生受损的周围神经, 但只是为了测试程序的可行性和评估干细胞注射到喉返神经小的安全性l 健康的马匹数量。在注射后28天内, 五匹马的内镜成像没有任何功能改变, 在注射后的四年内没有任何临床症状, 五匹马中有1岁的患者证实了该程序的可行性和安全性。一匹马必须在随访期间被安乐死, 原因与研究无关。虽然这些技术在少数马匹中证明是安全的, 但目前研究中包含的马匹数量太低, 无法证明缺少罕见的事件。
| 注射前评分 | 注射时间 (分钟) | 注射电流 (mA) | 评分在1天后注射 | 评分在7天后注射 | 评分在28天后注射 | |
| 马 1 (Standardbred, 母马, 16 岁) | 二、1 | 12 | 0。5 | 我 | 二、1 | 二、1 |
| 马 2 (Standardbred, 母马, 22 岁) | 我 | 3 | 0。7 | 我 | 我 | 我 |
| 马 3 (Standardbred, 母马, 11 岁) | 二、1 | 4 | 0。5 | 二、2 | 二、1 | 二、1 |
| 马 4 (Standardbred, 母马, 12 岁) | 我 | 7 | 0。5 | 我 | 二、1 | 我 |
| 马 5 (Standardbred, 母马, 10 岁) | 我 | 3 | 0。7 | 二、1 | 我 |
表 1: Signalment 和喉功能评分的马匹.这张表显示注射时间, 最低电流挑衅任何杓运动前注射, 和五健康马的喉分在 1, 7 和 28, 在注射自体肌源性骨髓间充质干细胞靠近左喉复发神经。在注射后28天, 由于与本研究无关的原因, 马 #5 无法用于控制。分数是指罗宾逊所描述的分数. 14. 在这里, 评分我的意思是, 两个杓软骨的运动是同步和对称的, 并完全诱拐两个杓软骨可以得到和维持。评分 ii. 1 意味着杓软骨的运动是异步的或可能是不对称的在某些时候;然而, 可以获得和维持两个杓软骨的完全诱拐。
图 2: 在注射干细胞的过程中设置.神经刺激针被引入到喉左侧, 定向向左侧喉返神经。神经刺激器设置在 0.8 mA。请单击此处查看此图的较大版本.
Discussion
本协议描述了肌肉衍生自体干细胞在马喉返神经中的成功应用, 采用神经刺激引导的方法。肌肉 microbiopsy 标本的收获, 以及干细胞的分离、培养和表征, 已经被详细描述, 而这些细胞的注射接近周围神经是原始的。神经与电神经刺激器的电定位为目前的研究提供了服务, 并被用来注射与喉返神经直接接近的间充质干细胞。通过鼻咽部视频内窥镜对电机反应进行监测。如果在针的定位过程中, 其他神经受到刺激, 相应的运动在内窥镜屏幕上可见。一个成功的刺激复发喉神经的特点是典型的绑架杓软骨。在一匹马, 局部麻醉注射, 以诱发暂时性瘫痪的杓肌肉。虽然在本研究中, 细胞的成功植入在神经附近没有得到具体的测试, 但是神经的电定位和低电流的注射都证明了干细胞在神经附近的应用。injectate 到神经的接近度进一步证明由一个成功的马达块由地方麻醉剂的注射诱导。
在剩下的五匹马中, 从第一次刺激到成功的干细胞注射的时间从3到12分钟不等. 马匹在手术过程中略有镇静, 这增加了他们对电刺激的依从性。没有一匹马在任何时候都表现出不良反应, 这表明刺激的持续时间可以在必要时延长, 以获得良好的针定位。如果操作者经常使用这项技术, 并且在更大数量的马匹上有不同的解剖, 那么就会发现一个陡峭的学习曲线。
马通常患有 RLN, 其特点是不同程度的左杓软骨麻痹导致异常的呼吸声音和运动不耐受。受影响神经组织学显示典型的周围神经病变16。周围神经病变是用来描述各种类型的周围神经病变导致的感觉, 运动, 或器官功能受损。原因是高度可变的, 可能包括糖尿病, 营养缺乏, 治疗与特定药物, 外伤性损伤, 缺血, 或感染, 或他们可以是特发。与病因无关, 外周神经病共有常见的病理学征象, 如沃勒变性、远端 axonopathy 或节段脱髓鞘。结果表明, 骨髓间充质干细胞对周围神经损伤的管理可能有利于其再生;然而, 根本的机制还没有得到很好的理解。传统上, 我们认为间充质干细胞只会分化为脂肪、肌肉、软骨和骨组织的祖细胞, 但在特定的条件下, 它们已被证明可以分化为心肌细胞17, 星形胶质细胞18和 myelinating 细胞的外围19和中枢神经系统19。在体外培养中, 接触神经肽有利于将间充质干细胞分化为表达神经元标记物21、22的细胞。几项活体研究表明, 骨髓间充质干细胞对大鼠坐骨神经损伤模型的神经再生和功能恢复有有益的影响,10、23。这可能是由于有利的环境条件, 导致干细胞分化为组织特异细胞24。今后的研究还应探讨这一技术, 以管理的预分化细胞在 RLN 受影响的马匹。
据我们所知, 这是第一份报告, 描述了使用神经刺激器定位周围神经, 以便向它注入特定的治疗。其他的周围神经病理在不同的种类, 如神经病理性疼痛, 可以治疗的干细胞的管理接近神经25,26。今后的研究应测试该技术在临床患者中的作用, 并探讨移植的风险和注射细胞分化的可能性。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究由 Soie 马研究中心资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Detomidine (Domidine) | Dechra | sold through pharmacy | |
| Lidocaine (Xylocaine) | Movianto | sold through pharmacy | |
| TOF Watch S (Nerve stimulator) | Alsevia | 79950161 | |
| TSK Starcut (Biopsy needle) | STSK laboratory | SAG - 14090C | |
| Electrostimulation needle | Pajunk | 001185-79 | |
| DMEM - F12 (culture medium) | Lonza | LO BE12-719F | |
| Heat inactivated FBS | Life technologies | 10500 | |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
| Phospate buffered saline | Lonza | LO BE17-512F | |
| 24-multiwell dish | Corning | 3524 | |
| Trypsin | Life technologies | 12604 | |
| HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
| NaCl | Sigma | S8776 | |
| T-25 cm² flasks | Nunclon | 136196 | |
| T-175 cm² flasks | Nunclon | 178883 | |
| Cryostore CS5 | Biolife solutions | 205373 |
References
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