Summary
Hier presenteren we een protocol om te injecteren van autologe spier-afgeleide cellen van de stam in de nabijheid van de terugkerende laryngeal zenuw met behulp van een elektrische zenuw stimulator. Deze nieuwe techniek wellicht nuttig is voor de behandeling van paardachtigen terugkerende laryngeal neuropathie.
Abstract
Terugkerende laryngeal neuropathie (RLN) vaak invloed op paarden en wordt gekenmerkt door abnormale respiratoire geluiden en oefening intolerantie. De terugkerende laryngeal zenuw toont laesies van demyelinisatie. Het voordeel van het toepassen van stamcellen op demyelinated zenuwen is aangetoond in verschillende diermodellen. Het doel van de studie was om te testen de haalbaarheid en de veiligheid van een peri-neuronale injectie van autologe spier afkomstige mesenchymale stamcellen aan de linker terugkerende laryngeal zenuw in gezonde paarden met behulp van een elektrische zenuw stimulator.
Spier-afgeleide stengels cel worden vijf gezonde Standardbred paarden verkregen door bemonstering van 20 mg spierweefsel met een semi-automatische 14 G biopsie naald uit de Musculus triceps. Bewegingen van het strottenhoofd zijn gecontroleerde via Opper-airway video endoscopie. De linker terugkerende laryngeal zenuw wordt benaderd met een geïsoleerde zenuw blok naald. Zenuwstimulatie is toegepast, basisgewicht van 2 mA, en de succesvolle ontvoering van de linker arytenoid wordt gecontroleerd. De intensiteit van de stimulatie is geleidelijk verminderd. Wanneer een verlies van de motorische reactie is waargenomen bij 0,5 mA, 107 autologe spier afkomstige stam cellen worden geïnjecteerd. Twee onderzoekers, die op het punt van de tijd zijn verblind, scoren de laryngeal functie van de paarden voorafgaand aan de behandeling en op dag 1, dag 7 en dag 28 na de injectie van de cellen. In een zesde paard, wordt 1 mL 2% lidocaïne geïnjecteerd om verder te bevestigen de juiste positionering van de naald. Dit leidt tot een tijdelijke verlamming van de linker arytenoid kraakbeen.
Deze studie bewijst dat de terugkerende laryngeal zenuw kan worden benaderd met behulp van een elektrische zenuw stimulator en dat de elektrische stimulatie van de zenuw goed wordt verdragen door de paarden. Geen wijziging van de laryngeal functie werd waargenomen in een van de paarden na de injectie van de cellen van de stam. Verdere studies moeten worden uitgevoerd om te beschrijven de effecten van een peri-neuronale injectie van autologe spier afkomstige mesenchymale stamcellen voor paarden lijden aan RLN.
Introduction
RLN is een gemeenschappelijk pathologie van de bovenste luchtwegen bij paarden gekenmerkt door wisselend arytenoid verlamming. De linkerkant van het strottenhoofd wordt meestal beïnvloed. De prevalentie van de ziekte kan bereiken tot 35% in bepaalde bevolkingsgroepen paard. Hoewel verschillende hypothesen probeerde uit te leggen van de etiologie en pathogenese van de ziekte, blijft de precieze oorzaak van RLN onzeker. De pathologie wordt beschreven als een distale axonopathy van de terugkerende laryngeal zenuw met laesies van demyelinisatie maar ook een zekere mate van remyelination. Deze axonopathy leidt tot de denervation van de intrinsieke laryngeal spieren en atrofie van de daarmee gepaard gaande1,2. Deze pathologie is vaak langzaam progressief en kan leiden tot een totaal verlies van de arytenoid ontvoering van de aangedane zijde3.
Getroffen paarden abnormale respiratoire geluiden uitstoten tijdens de training en oefening intolerantie soms vertonen in meer ernstige gevallen. De definitieve diagnose wordt gesteld door de endoscopische behandeling op een niet-verdoofd staande paard waar een gedeeltelijke of totale verlies van laryngeal ontvoering1,2,4wordt waargenomen. Momenteel is de meest voorkomende behandeling laryngoplasty (ook bekend als "tie-back"), die wordt soms geassocieerd met een ventriculo-cordectomy. Hoewel het algehele slagingspercentage van deze operaties is beschouwd als goed tot uitstekend5, komen postoperatieve complicaties zeer vaak. De meest voorkomende complicatie is een geleidelijk verlies van ontvoering. Barnett et al. 6 rapporteerde een verlies van ten minste één graad van ontvoering binnen de eerste zes weken na de operatie in ten minste 76% van de paarden. Andere complicaties, zoals het falen van de prothese, hoesten en airway besmetting, zijn ook gemeld5.
Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn een deel van de paarden geneeskunde in onderzoek en praktijk geweest voor meer dan een decennium, hoewel bewezen studies over hun efficiëntie nog schaars zijn. De twee meest uitgebuite bronnen van volwassen mesenchymale stamcellen in paarden zijn beenmerg en vetweefsel7. Beide bemonsteringstechnieken zijn relatief invasief en niet altijd leiden tot een voldoende aantal cellen. Onlangs, Ceusters et al. 7 beschreven de cultuur van de stamcellen afgeleid van dwarsgestreept spierweefsel, die wordt verkregen door een minder invasieve techniek van de microbiopsy.
MSCs zijn geschikt voor zelf-vernieuwing, zelf-generatie multipotent en differentiatie7,8. Hun vermogen om te onderscheiden in alle mesoderm lineages van vet-, bot-, spier- en kraakbeen wordt nu gevestigde9. Echter in bepaalde milieuomstandigheden, kunnen ze onderscheiden in niet-mesenchymale lineages zoals neuronen, astrocyten en myelinating cellen van het perifere zenuwstelsel en het ruggenmerg9,10. MSCs zijn al gebruikt in verschillende neuropathie modellen-10,11. Hun vermogen om te migreren naar gebieden van ontaarde zenuwweefsel en te regenereren neurale cellen is gebleken na een systemische en lokale administratie11. Bovendien kunnen cellen van Schwann-achtige afgeleid van MSCs macrofagen afscheiden neurotrophic factoren bevorderen van axonale groei en remyelination9te verwijderen van cellulaire puin rekruteren.
Het doel van deze studie is om te beschrijven van de techniek van een zenuw stimulator geleide injectie van autologe stamcellen in de buurt van de linker terugkerende laryngeal zenuw in gezonde paarden spier-afgeleide. Typisch, een stimulator van de zenuw verbonden met een injectie naald wordt gebruikt om de electro-lokalisatie van perifere zenuwen toepassing van lokale verdoving op dat gebied12. Een zwakke gelijkstroom impuls wordt geleverd in de nabijheid van de zenuw voor het opwekken van een motorische reactie. Het vermogen te produceren deze motor reactie is afhankelijk van diverse parameters, zoals de geleidende gebied van de naald, een impedantie van het weefsel, de huidige toegepast, de impulstijd en de afstand van de naald tot de zenuw. Zenuw stimulator naalden zijn ontworpen om een zeer restrictieve geleidende gebied op het puntje van de naald, terwijl de rest van de naald is geïsoleerd. Dit ontwerp helpt om de zenuw nauwkeurig te lokaliseren. Moderne zenuw stimulatoren aan te passen aan wisselende weefsel impedances en leveren de constante stroomsterkte ingesteld op de machine. Bovendien, de meeste machines gebruik maken van een impulstijd van 0,1 s, zodat de bepalende parameters zijn de huidige toegepast en de afstand tot de naald. De relatie tussen de naald-naar-zenuw afstand en de huidige noodzakelijk zijn voor het produceren van een motorische reactie wordt beschreven door de wet van Coulomb: E = kQ/r; waar E is de lading van de vereiste stimulatie, k is de constante van Coulomb, Q is de lading van de minimaal vereiste stimulatie en r is de afstand tussen de twee elektroden. In de elektro-lokalisatie van zenuwen, de afstand tussen de twee elektroden wordt beschouwd als de naald-naar-zenuw afstand12. Elektrische lading verdwijnt na de regel van het omgekeerde kwadraat van de afstand van de naald-naar-zenuw13. Klinische praktijk heeft aangetoond dat de motor zenuwen stimulatie op 0,5 mA is sterk gecorreleerd aan het succesvolle zenuw blok en dat een verlies van signaal van de motor op lagere stromingen belet de gebruiker beheer van accidentele intraneuronal injecties. Het doel van deze studie is om te testen de haalbaarheid en de veiligheid van deze techniek in een beperkt aantal paarden. Als de haalbaarheid en de veiligheid van deze techniek worden bevestigd, kan het gemakkelijk worden overgedragen aan getroffen paarden. Verdere, paarden RLN kan dienen als een model voor perifere degeneratieve neuropathie.
Protocol
De Commissie voor de ethische gebruik van dieren voor de Universiteit van Luik goedgekeurd de studie protocol.
1. spieren Microbiopsy
- Identificeer de voorbeeldsite door visueel onderzoek en palpatie, in de lange kop van de triceps spier, ongeveer midden tussen het punt van de elleboog en de punt van de schouder.
- Illustraties van een zone van ongeveer 2 x 2 cm2 met een elektrische clipper. Toepassen van chirurgische scrub bestaande uit polyiodide vloeibare zeep en alcohol comprimeert voor 1 min over het uitgeknipte gebied. Injecteren subcutaan 1 mL 2% lidocaïne-oplossing met een 25 G naald in het midden van de geknipte en ontsmet zone.
- Handen met antibacteriële hand zeep te schrobben. Steriele handschoenen zetten. Gebruik een wegwerp steriele draperen als een steriele oppervlak om de biopsie-naalden en de trocar.
- De semi-automatische 14 G biopsie naald arm door te trekken van het veermechanisme, zoals in figuren 1b en 1 c. Laat de naald biopsie om vertrouwd te raken met haar mechanisme. Plaats de naald biopsie gewapende op het steriele ondergrond. Raak vertrouwd met de trocar, die uit een canule en een obturator bestaat zoals aangegeven in Figuur 1een.
Figuur 1 : De set van de naald biopsie. De biopsie naald set bestaat uit (een) de canule en haar obturator en de biopsie naald (van boven naar beneden). De andere deelvensters tonen de biopsie naald in haar (b) neutraal en (c) gewapend positie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- De trocar voorbereiden door de canule en de obturator assemblage en bewaar ze in een vergrendelde positie. Kennismaken met de trocar loodrecht de huid door de voorheen gedesensibiliseerde zone. Verder de trocar naar een positie waar het puntje van de trocar ongeveer 1,5 cm wordt diep in de spier. Nemen de trocar, distantiëren van de canule uit haar obturator en het obturator op het steriele oppervlak te plaatsen.
- Het introduceren van de gewapende biopsie naald via de canule. Invoering van de naald en de canule via de huid incisie in de spier. De naald verder naar een positie waar de punt van de naald in het midden van de lange kop van de triceps spier is.
- Laat de naald biopsie en trek dan de naald biopsie samen met de canule. Trek de naald biopsie uit de canule. Laat de canule op het steriele oppervlak.
- Open de biopsie naald door de lente met één hand trekken en te houden met de andere.
Opmerking: Het specimen zichtbaar op het topje van de biopsie naald. - Met de hulp van een tweede persoon, open het monsterbuisje met het monster medium. Gebruik een 19 G hypodermische naald om de kleine spier-stuk van de naald biopsie. Leg het monster van de spier in het medium van de bemonstering. Sluit de tube met de schroefdop en zachtjes kantelen 2 x om ervoor te zorgen dat het monster is drijvend in het medium.
- Wapen van de naald biopsie. Neem de canule van het steriele oppervlak en monteer de gewapende biopsie-naalden en canule. Invoering van de gewapende naald en de canule via de huid incisie zoals hiervoor is beschreven. Herhaal de procedure monster 2 – 3 x ongeveer 20 mg spierweefsel wordt bemonsterd. Sluit de bemonstering buis. Voorzichtig zet de buis 2 x te mengen van de stukken van de spier met het medium van de bemonstering.
- Schip van de monsters naar het laboratorium bij een constante temperatuur tussen de 4 tot 8 ° C.
Opmerking: Het laboratorium verwerkt dan het monster. Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - De procedure wordt goed verdragen en pijn aan de zijkant van de bemonstering wordt niet waargenomen. In het onwaarschijnlijke geval van spierpijn op de site van bemonstering in acht genomen, passende pijnstillende behandelingen te beheren.
2. behandeling van de cellen
Opmerking: De stamcellen gebruikt in deze studie zijn opgesteld volgens de methode beschreven door Ceusters et al. 7. hun artikel beschrijft ook de karakterisering van de cellen.
- Beginnen met de voorbereiding van het specifieke kweekmedium, DF20, door 20% van de warmte-geïnactiveerd foetale runderserum, 5 mL penicilline (1000 IU/mL) toe te voegen-streptomycine (10.000 µg/mL) en 2,5 mL amfotericine B (250 µg/mL) op een fles van 500 mL een verkrijgbare kweekmedium met glutamine en fenol rood.
- Giet 150 µL van het kweekmedium DF20 in elk van de innerlijke 16 putten van een 24-multi-well schotel. Giet 1 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) [kaliumchloride (200 mg/L), kalium fosfaat monofasische (200 mg/L), natriumchloride (8000 mg/L) en kalium fosfaat diphasic (2,160 mg/L)] in de resterende buitenste wells.
- Spoel de kleine spier stukken 2 x in PBS. Ze scheiden in zeer kleine stukjes met behulp van een scalpel en pincet en plaats een klein stukje (de grootte van de punt van het scalpel blad) in elke inner-16 goed van de multi goed schotel.
- Plaats de multi goed schotel in een incubator gehandhaafd bij de volgende omstandigheden: 37 ° C, 21% O2en 5% CO2. Controleren van de putten dagelijks onder een omgekeerde Microscoop en voeg 50 µL van DF20 indien nodig om te voorkomen dat de cellen uitdrogen.
Opmerking: Na ongeveer 10 d, zal er genoeg cellen gegroeid uit de explant om de isolatie van de cel van de stam. Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Wanneer een halo van cellen zichtbaar rond de spier is explants, negeren de explant van spierweefsel. Loskoppelen van de cellen met behulp van 150 µL van een trypsine bevattende EDTA oplossing in elk putje: negeren van het kweekmedium, spoel de cellen met 1 mL PBS, negeren de PBS en toevoegen van de trypsine-oplossing voor een maximum van 10 minuten bij 37 ° C. Toevoegen van gestolde voedingsbodem om te stoppen met het optreden van de trypsine, oogsten van de celsuspensie en, vervolgens, centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Verwijder het supernatant en Suspendeer de pellet in een evenwichtige zoutoplossing.
- Spoel de celsuspensie op een helling van de discontinue dichtheid van 3 lagen (15%, 25% en 35%). Centrifugeer de buis met de celsuspensie en de discontinue dichtheid kleurovergang oplossing bij 1250 x g gedurende 20 min bij 25 ° C. Gebruik niet de rem van de centrifuge. Observeer de cel breuken met verschillende dichtheden die wordt weergegeven tussen de verschillende lagen van de discontinue dichtheid kleurovergang oplossing na het centrifugeren.
- Blijven de cultuur met de breuk tussen de 15 en 25%. Het overbrengen van een buis en wassen met de evenwichtige zoutoplossing. Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Verwijder het supernatant. Ga verder met het opschorten van de pellet in 1 mL DF20. Een cel cultuur kolf, met een oppervlakte van 25 cm2, met 6 mL DF20 Prefill. Breng de cellen in de maatkolf van de ingevulde cel-cultuur en cultuur hen in een broedmachine met de volgende voorwaarden: 37° C, 21% O2en 5% CO2.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Controleer de cellen dagelijks onder een omgekeerde Microscoop. Het kweekmedium indien nodig wijzigen (verwijderen van het oude medium en toevoegen van 6 mL nieuwe kweekmedium). De cellulaire samenvloeiing bepalen door het observeren van de lagen van de cel in de cultuur-gerechten, met behulp van een optische Microscoop op een vooraf gedefinieerde vergroting. Schatting van het oppervlak van de schotel die is bezet door de cellen. Werken bij een vaste microscopische vergroting voor elke waarneming te kunnen evalueren de samenvloeiing. Wanneer de cellen 85% van het oppervlak van de schotel bezetten, gaat u verder met een passage van de cellen.
- Wanneer de cellen confluente worden, loskoppelen met behulp van een trypsine bevattende EDTA oplossing met hetzelfde protocol, zoals beschreven in stap 2.4. Vervolgens het centrifugeren van de celsuspensie bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Verwijder het supernatant en ga verder met de resuspensie van de cellen in 5 mL DF20. Plaats ze in een maatkolf van cel cultuur van 175 cm2 gevuld met 25 mL DF20. Plaats de kolf in een broedmachine met de volgende voorwaarden: 37° C, 21% O2en 5% CO2.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Controleer de cellen dagelijks onder een omgekeerde Microscoop. Indien nodig wijzigen van het medium (verwijderen van het oude medium en Voeg 30 mL nieuwe medium). Wanneer de cellen confluente worden, loskoppelen met behulp van trypsine-EDTA, zoals beschreven in stap 2.4. Vervolgens het centrifugeren van de celsuspensie bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Verwijder het supernatant en de cellen in 6 mL DF20 op te schorten. Plaats 1 mL van de celsuspensie in zes 175 cm2 flacons, elk gevuld met 25 mL DF20 en cultuur hen bij 37 ° C in een broedstoof2 CO (met 21% O2 en 5% CO2).
- Controleer de cellen dagelijks onder een omgekeerde Microscoop. Indien nodig wijzigen van het medium (verwijderen van het oude medium en Voeg 30 mL nieuwe medium in elke kolf). Wanneer de cellen confluente worden, loskoppelen met behulp van trypsine-EDTA, zoals beschreven in stap 2.5. Centrifugeer ze 3 x bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 37 ° C en negeren het supernatant bij elke stap.
- De cellen met de hulp van een Bürker tellen kamer en een lichte Microscoop te tellen. Maak een cellulaire suspensie van 10 miljoen cellen/mL van een specifieke cryopreservatie medium.
- De therapeutische doses van 1 x 107 cellen in 1 mL cryopreservatie voedingsbodem diepvries en hen bewaren in de fase van de damp van vloeibare stikstof tot hun gebruik.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Het schip van de cellen in het flesje op droog ijs voor eindgebruik.
3. de injectie van de cellen
Opmerking: Twee personen zijn nodig voor het uitvoeren van de injectie van de cellen van de stam.
- Warm de celsuspensie geleidelijk tot kamertemperatuur. De schorsing gecombineerd in een 2 mL spuit.
- Verdoven het paard door het injecteren van detomidine 10 µg/kg in de halsslagader met een 19 G hypodermische naald. Wacht 5 minuten om te zien van de volle werking van de sedatie, die zichtbaar door de karakteristieke hoofd-down-positie van het paard wordt.
- Illustraties een zone van 20 x 10 cm,2 over de linker laryngeal regio van het paard met een clipper, zoals weergegeven in Figuur 2. Vervolgens een chirurgische scrub van polyiodide zeep en alcohol om de geknipte regio passen.
- Plaats een flexibele standaard video endoscoop via de linker neusgat van het paard en het verder naar de Nasofarynx. Pas de positie van de endoscoop tot een volledige weergave van beide arytenoid kraakbeen en het strotklepje wordt verkregen. De endoscoop Houd in deze positie tijdens de procedure en zet het scherm van de video endoscoop richting de exploitanten.
- Sluit de stimulatie/injectie naald aan de zenuw stimulator van negatieve elektrode. Het handhaven van de steriele omstandigheden van de naald. De positieve elektrode van de zenuw stimulator verbinden met een elektrode patch, die aan het gebied van geknipte huid vastzit.
- Sluit de spuit met de celsuspensie aan de lijn injectie en prefill van de buis om te jagen van de lucht van het systeem. Vergeet niet het volume van het systeem en een spuit met hetzelfde volume van steriele zoutoplossing bereiden.
- Als niet vertrouwd zijn met deze techniek, gebruikt u een ontsmet 5 tot en met 7 MHz echografie van de lineaire transducer te visualiseren de anatomische structuren in de regio van belang. Gebruik een steriele echografie koppeling gel het verhogen van de beeldkwaliteit. Visualiseer het strottenhoofd en de schepen die worden uitgevoerd in de dorsale regio van het strottenhoofd.
- Zodra bekend met de anatomie van de regio, voeren de stimulatie/injectie naald richting het dorsolateral aspect van het strottenhoofd. Bij het naderen van het dorsolateral aspect van het strottenhoofd, start de stimulator van de zenuw in de modus van de stimulatie 1 Hz met een stroom van 2 mA.
- Zachtjes gaan de naald naar de positie van de terugkerende laryngeal zenuw met inachtneming van de Endoscopische weergave op het scherm. Zodra het verkeer van de ontvoering van de linker arytenoid kraakbeen zichtbaar op het videoscherm is, verminderen de huidige totdat de beweging verdwijnt terwijl de naald op plaats.
- Bepaal de ideale positie van de naald. Overwegen een verlies van motorische reactie op 0,5 mA als de ideale afstand van de zenuw. Wanneer arytenoid kraakbeen bewegingen aanhouden op stromingen lager is dan 0,4 mA, doen niet injecteren de cellen, zoals die kunnen leiden tot een intraneuronal injectie.
- Wanneer het verlies van motorische reactie op 0,5 mA wordt waargenomen, injecteren van de celsuspensie met 107 autologe stamcellen en spoel de injectie-lijn met de zoutoplossing bereid stap in 3.6. Dit zal de rest van de celsuspensie die bleef in de buis injectie injecteren.
- Na de injectie van de cellen, nemen de naald en de endoscoop.
- Laat het paard herstellen van de sedatie. Geen verdere behandeling nodig is voor de site van de biopsie.
Representative Results
De Commissie voor de ethische gebruik van dieren voor de Universiteit van Luik goedgekeurd de studie protocol. Zes paarden uit de kudde van onderzoek paarden op het Equine onderzoekscentrum van Mont-le-Soie werden opgenomen in deze studie. In het eerste paard, was de terugkerende laryngeal zenuw gelokaliseerd door elektrostimulatie. Figuur 2 toont de instelling gebruikt, met de naald van de stimulatie ingevoegd in de linker dorsolateral aspect van het strottenhoofd van het paard in de zenuw stimulator. Wanneer het verlies van beweging van het arytenoid kraakbeen is waargenomen bij 0,5 mA, 1 mL 2% Lidocaïne wordt geïnjecteerd. Dit resulteerde in een gebrek aan beweging bij hogere stromen en een tijdelijke verlamming van de linker arytenoid. De controle-endoscopie, 24 h later bleek een volledig herstel van de arytenoid functie. Het volledige protocol werd met succes herhaald in vijf paarden. Geen van de paarden toonden een negatieve reactie op de microbiopsy van de spier. In alle paarden, waren een voldoende aantal cellen gegroeid in de ingestelde tijd. De endoscopie van de bovenste luchtwegen werd uitgevoerd in alle vijf paarden en de scores laryngeal functie of ik II.1 volgens Robinson et al. 14 werden vastgesteld. Alle paarden getolereerd de zenuwstimulatie van de terugkerende laryngeal zenuw erg goed. Geen bijwerking werd waargenomen tijdens of na de stimulatie of de injectie van de cellen van de stam.
Alle endoscopies waren opgenomen en scoorde door twee geblindeerde clinici. Was er geen verschil tussen de pre injectie-scores van de laryngeal functies en de scores verkregen op dag 1, 7 en 28 na de injectie van stamcel, zoals getest door Wilcoxon rangschikking analyse15. Tabel 1 geeft een overzicht van de laryngeal scores van alle paarden op verschillende tijdstippen, evenals de tijd tussen het inbrengen van de naald de injectie van de cellen van de stam en de stroom die leidde het arytenoid verkeer tot wanneer de cellen waar geïnjecteerd.
De cellen die zijn gebruikt in de huidige studie werden opgesteld volgens een protocol gepubliceerd eerder7. De cellen van alle fracties konden trilineage differentiatie, uitgedrukt CD90 en CD44, deed niet express CD45 en MHC II en had clonogenic capaciteiten. De cellen van de 15 – 25% breuk werden gekozen voor verdere verwerking omdat ze de grootste uitdrukking van CD90 en de grootste proliferatieve capaciteiten toonde.
Het doel van de huidige studie was niet te testen van de efficiëntie van de toepassing van de cel van de stam voor de regeneratie van een beschadigde perifere zenuw maar alleen de haalbaarheid van de procedure en beoordelen van de veiligheid van de injectie van stamcel aan de terugkerende laryngeal zenuw in een smal l aantal gezonde paarden. Een gebrek aan functionele wijzigingen op de Endoscopische beeldvorming in de vijf paarden tot 28 dagen na de injectie en een gebrek aan geen klinische symptomen in vier van de vijf paarden tot 1 jaar na de injectie de haalbaarheid en de veiligheid van de procedure bevestigt. Één paard moest worden euthanized in de follow-up periode om redenen die niets met de studie. Hoewel de technieken blijken te zijn veilig in een klein aantal paarden, is het aantal paarden die in de huidige studie te laag om een afwezigheid van zeldzame gebeurtenissen te tonen.
| Score vóór injectie | Tijd voor injectie (min) | Stroom bij injectie (mA) | Score bij dag 1 post injectie | Score bij dag 7 post injectie | Score bij dag 28 post injectie | |
| Paard 1 (Standardbred, mare, 16 jaar oud) | II.1 | 12 | 0,5 | Ik | II.1 | II.1 |
| Paard 2 (Standardbred, mare, 22 jaar oud) | Ik | 3 | 0,7 | Ik | Ik | Ik |
| Paard 3 (Standardbred, mare, 11 jaar oud) | II.1 | 4 | 0,5 | II.2 | II.1 | II.1 |
| Paard 4 (Standardbred, mare, 12 jaar oud) | Ik | 7 | 0,5 | Ik | II.1 | Ik |
| Paard 5 (Standardbred, mare, 10 jaar oud) | Ik | 3 | 0,7 | II.1 | Ik |
Tabel 1: Signalment en laryngeal functioneren scores van de paarden. Deze tabel toont de tijd van injectie, de laagste huidige provoceren van elke arytenoid beweging voordat de injectie en de laryngeal scores van vijf gezonde paarden vóór en op dag 1, 7 en 28 na de injectie van autologe spier afkomstige mesenchymale stamcellen in nabijheid van de linker laryngeal terugkerende zenuw. Paard #5 was niet beschikbaar voor de controle op dag 28 na de injectie om redenen die niets met deze studie. De scores verwijzen naar de scores beschreven door Robinson et al. 14. score hier, ik betekent dat de bewegingen van beide arytenoid kraakbeen synchrone en symmetrisch waren, en een volledige ontvoering van beide arytenoid kraakbeen kan worden verkregen en kan worden gehandhaafd. Score II.1 betekent dat de bewegingen van de arytenoid kraakbeen asynchrone of asymmetrische op bepaalde tijden worden kunnen; echter, een volledige ontvoering van beide arytenoid kraakbeen kan worden verkregen en onderhouden.
Figuur 2 : Instellen tijdens de injectie van de stamcellen. De zenuw stimulatie naald is geïntroduceerd op de linkerkant van het strottenhoofd en gericht op de linker terugkerende laryngeal zenuw. De zenuw stimulator is ingesteld op 0,8 mA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Dit protocol beschrijft de succesvolle toepassing van autologe stamcellen spier-afgeleid naar de terugkerende laryngeal zenuwen bij paarden met behulp van een zenuw stimulator geleide aanpak. De oogst van de spier microbiopsy specimen, alsmede de isolatie, cultuur en karakterisering van de stamcellen, zijn beschreven in detail voor, terwijl de injectie van deze cellen in de nabijheid een perifere zenuw is origineel. De electro-lokalisatie van de zenuw met een elektrische zenuw stimulator heeft gediend voor de huidige studie en werd gebruikt om te injecteren mesenchymale stamcellen in de onmiddellijke nabijheid van de terugkerende laryngeal zenuw. De motorische reactie werd gecontroleerd door video endoscopie via de Nasofarynx. Indien tijdens de positionering van de naald andere zenuwen werden gestimuleerd, was de bijbehorende beweging zichtbaar op het scherm van de endoscopie. Een succesvolle stimulatie van de terugkerende laryngeal zenuw werd gekenmerkt door de typische ontvoering van de arytenoid kraakbeen. In één paard, werd lokale verdoving geïnjecteerd om een tijdelijke verlamming van de arytenoid spier. Alhoewel de succesvolle inplanting van de cellen in de nabijheid van de zenuw niet specifiek in de huidige studie is getest, bleek de electro-lokalisatie van de zenuw en de injectie bij een lage stroom dat de stamcellen werden toegepast in de buurt van de zenuw. De nabijheid van de injectate naar de zenuw werd verder aangetoond door een succesvolle motor blok geïnduceerd door een injectie van een plaatselijke verdoving.
In de resterende vijf paarden, de tijd van de eerste stimulatie totdat de injectie van de cel van de stam van de succesvolle van 3 tot 12 min. varieerde paarden waren enigszins gedrogeerd tijdens de procedure, die hun naleving van de elektrische stimulatie verhoogd. Geen van de paarden toonden bijwerkingen op elk gewenst moment, waaruit blijkt dat de duur van de stimulatie kan worden verlengd indien nodig om de goede naald positionering. Een steile het leren kromme wordt verwacht te worden nageleefd als de exploitant is met behulp van deze techniek regelmatig en in een groter aantal paarden met verschillende anatomie.
Paarden vaak lijden aan RLN, dat wordt gekenmerkt door verschillende graden van verlamming van de linker arytenoid kraakbeen leiden tot abnormale respiratoire geluiden en de uitoefening van de intolerantie. Een histologie van de getroffen zenuwen onthult typische laesies van perifere neuropathie16. Perifere neuropathie is een term gebruikt om verschillende soorten letsels van de perifere zenuwen wat leidt tot verminderde sensaties, bewegingen of orgaanfuncties. De oorzaken zijn zeer variabel en eventueel diabetes, tekorten, een behandeling met specifieke geneesmiddelen, een traumatisch letsel, ischemie of een infectie, of ze kunnen idiopathische. Onafhankelijk van de oorzaak, perifere neuropathieën delen voorkomende histopathologisch symptomen, zoals Wallerian degeneratie, distale axonopathy of segmentale demyelinisatie. Het is aangetoond dat de administratie van mesenchymale stamcellen om beschadigde perifere zenuwen mogelijk gunstig voor hun rehabilitatie; de onderliggende mechanismen worden echter niet goed begrepen. Traditioneel, wij zijn van mening dat mesenchymale stamcellen zal alleen onderscheid in progenitorcellen van adipeus, spieren, kraakbeen en botweefsel, maar onder bepaalde voorwaarden, ze is gebleken om te differentiëren in myocytes17, astrocyten18 , en myelinating cellen van de perifere19 en centrale zenuwstelsel19. Tijdens een in vitro cultuur, een blootstelling aan neuropeptides zal het voordeel van de differentiatie van mesenchymale stamcellen in cellen uiten van neuronale markeringen21,22. Verschillende in vivo studies hebben aangetoond dat de gunstige invloed van mesenchymale stamcellen op zenuw regeneratie en een functionele herstel in rat modellen van10,23van de schade van de nervus ischiadicus. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door gunstige omgevingsfactoren die aan de differentiatie van stamcellen in weefsel-specifieke cellen24 bijdragen. Toekomstige studies moeten ook onderzoeken deze techniek voor het beheer van pre gedifferentieerde cellen in RLN getroffen paarden.
Voor het beste van onze kennis is dit het eerste verslag dat het gebruik van een stimulator van de zenuw beschrijft te lokaliseren een perifere zenuw te injecteren een specifieke behandeling erin. Andere pathologieën van de perifere zenuwen in verschillende soorten, zoals neuropatische pijn, kunnen worden behandeld door de administratie van stamcellen in de nabijheid van de zenuw25,26. Toekomstige studies moeten testen van het effect van deze techniek in klinische patiënten en onderzoeken van het risico van migratie en de mogelijkheden van differentiatie van de geïnjecteerde cellen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De studie is gefinancierd door het Equine onderzoekscentrum van Mont-le-Soie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Detomidine (Domidine) | Dechra | sold through pharmacy | |
| Lidocaine (Xylocaine) | Movianto | sold through pharmacy | |
| TOF Watch S (Nerve stimulator) | Alsevia | 79950161 | |
| TSK Starcut (Biopsy needle) | STSK laboratory | SAG - 14090C | |
| Electrostimulation needle | Pajunk | 001185-79 | |
| DMEM - F12 (culture medium) | Lonza | LO BE12-719F | |
| Heat inactivated FBS | Life technologies | 10500 | |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
| Phospate buffered saline | Lonza | LO BE17-512F | |
| 24-multiwell dish | Corning | 3524 | |
| Trypsin | Life technologies | 12604 | |
| HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
| NaCl | Sigma | S8776 | |
| T-25 cm² flasks | Nunclon | 136196 | |
| T-175 cm² flasks | Nunclon | 178883 | |
| Cryostore CS5 | Biolife solutions | 205373 |
References
- Duncan, I. D., Griffiths, I. R., Madrid, R. E. A light and electron microscopic study of the neuropathy of equine idiopathic laryngeal hemiplegia. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (6), 483-501 (1978).
- Cahill, J. I., Goulden, B. E. Equine laryngeal hemiplegia. IV. Muscle pathology. New Zealand Veterinary Journal. 34 (11), 186-190 (1986).
- Dixon, P. M., et al. Laryngeal paralysis: a study of 375 cases in a mixed-breed population of horses. Equine Veterinary Journal. 33 (5), 452-458 (2001).
- Dixon, P. M., Robinson, E., Wade, J. F. Review of the pathological changes in equine recurrent laryngeal neuropathy. Havemeyer Workshop on Equine Laryngeal Neuropathy. Havemeyer Monograph Series No. 11. , R&W Publications. Newmarket, UK. 9-11 (2003).
- Biasutti, S., Dart, A. J., Jeffcott, L. B. A review of recent developments in the clinical application of prosthetic laryngoplasty for recurrent laryngeal neuropathy: Indications, complications and outcome. Equine Veterinary Education. 29 (6), 337-345 (2016).
- Barnett, T. P., O'Leary, J. M., Parkin, T. D. H., Dixon, P. M., Barakzai, S. Z. Long-Term Maintenance of Arytenoid Cartilage Abduction and Stability During Exercise After Laryngoplasty in 33 Horses. Veterinary Surgery. 42 (3), 291-295 (2013).
- Ceusters, J., et al. From skeletal muscle to stem cells: an innovative and minimally-invasive process for multiple species. Scientific Reports. 7 (1), 696 (2017).
- Ding, D. C., Shyu, W. C., Lin, C. Z. Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 20 (1), 5-14 (2011).
- Jiang, L., Jones, S., Jia, X. Stem Cell Transplantation for Peripheral Nerve Regeneration: Current Options and Opportunities. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), 94 (2017).
- Tohill, M., Mantovani, C., Wiberg, M., Terenghi, G. Rat bone marrow mesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerve regeneration. Neuroscience Letters. 362 (3), 200-203 (2004).
- Ji, J. F., He, B. P., Dheen, S. T., Tay, S. S. W. Interactions of Chemokines and Chemokine Receptors Mediate the Migration of Mesenchymal Stem Cells to the Impaired Site in the Brain After Hypoglossal Nerve Injury. Stem Cells. 22 (3), 415-427 (2004).
- Urmey, W. F. Using the nerve stimulator for peripheral or plexus nerve blocks. Minerva Anesthesiologica. 72 (6), 467-471 (2006).
- De Andrés, J., Sala-Blanch, X. Peripheral nerve stimulation in the practice of brachial plexus anesthesia: a review. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 26 (5), 478 (2001).
- Robinson, N. E. Consensus statements on equine recurrent laryngeal neuropathy: conclusions of the Havemeyer Workshop. Equine Veterinary Education. 16 (6), 333-336 (2004).
- The BMJ: Rank Score Tests. , Available from: https://www.bmj.com/about-bmj/resources-readers/publications/statistics-square-one/10-rank-score-tests (2018).
- Hahn, C. N., et al. Histological and ultrastructural evidence that recurrent laryngeal neuropathy is a bilateral mononeuropathy limited to recurrent laryngeal nerves. Equine Veterinary Journal. 40 (7), 666-672 (2008).
- Orlic, D., et al. marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 410 (6829), 701-705 (2001).
- Kopen, G. C., Prockop, D. J., Phinney, D. G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. Proceedings of the National Academy of Science. 96 (19), 10711-10716 (1999).
- Dezawa, M., Takahashi, I., Esaki, M., Takano, M., Sawada, H. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone marrow stromal cells. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1771-1776 (2001).
- Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39 (3), 229-236 (2002).
- Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. Journal of Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
- Sanchez-Ramos, J., et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Experimental Neurology. 164 (2), 247-256 (2000).
- Farzamfar, S., et al. Sciatic nerve regeneration by transplantation of menstrual blood-derived stem cells. Molecular Biology Reports. 44 (5), 407-412 (2017).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Brini, A. T., et al. Therapeutic effect of human adipose-derived stem cells and their secretome in experimental diabetic pain. Scientific Reports. 7 (1), 9904 (2017).
- Liu, W., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Stem Cells for Treating Diabetic Neuropathy in Metabolic Syndrome. Biomed Research International. 2017, 8945310 (2017).
