Summary
यहाँ, हम एक बिजली के तंत्रिका उत्तेजक की मदद से आवर्तक स्वरयंत्र तंत्रिका निकटता में ऑटोलॉगस मांसपेशी व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद. इस उपंयास तकनीक घोड़े आवर्तक स्वरयंत्र न्यूरोपैथी के उपचार के लिए उपयोगी हो सकता है ।
Abstract
आवर्तक स्वरयंत्र न्यूरोपैथी (RLN) सामान्यतः घोड़ों को प्रभावित करता है और असामान्य श्वसन ध्वनियों और व्यायाम असहिष्णुता की विशेषता है. आवर्तक स्वरयंत्र तंत्रिका ग्रासलेल्या के घावों से पता चलता है । demyelinated नसों में स्टेम सेल लगाने का लाभ विभिन्न पशु मॉडलों में प्रदर्शित किया गया है । अध्ययन का उद्देश्य व्यवहार्यता और ऑटोलॉगस मांसपेशी के एक पेरि-ंयूरॉन इंजेक्शन की सुरक्षा का परीक्षण किया गया mesenchymal स्टेम कोशिकाओं स्वस्थ घोड़ों में बाईं आवर्तक स्वरयंत्र तंत्रिका को एक विद्युत तंत्रिका उत्तेजित करता है का उपयोग करके ।
मांसपेशी-व्युत्पंन कोशिका स्टेम triceps मांसपेशी से एक अर्द्ध स्वचालित 14 ग्राम बायोप्सी सुई के साथ मांसपेशी ऊतक के 20 मिलीग्राम नमूना द्वारा पांच स्वस्थ Standardbred घोड़ों से प्राप्त कर रहे हैं । गला के आंदोलनों ऊपरी airway वीडियो एंडोस्कोपी के माध्यम से निगरानी कर रहे हैं । बाईं आवर्तक स्वरयंत्र तंत्रिका एक अछूता तंत्रिका ब्लॉक सुई के साथ संपर्क किया है । तंत्रिका उत्तेजना लागू किया जाता है, 2 mA में शुरू, और बाईं arytenoid के सफल अपहरण पर नजर रखी है । उत्तेजना की तीव्रता उत्तरोत्तर कम होती जाती है. जब मोटर प्रतिक्रिया का एक नुकसान ०.५ mA पर मनाया जाता है, 107 ऑटोलॉगस मांसपेशी व्युत्पंन स्टेम कोशिकाओं इंजेक्ट कर रहे हैं । दो परीक्षकों, जो समय बिंदु पर अंधा कर रहे हैं, स्कोर घोड़ों के स्वरयंत्र समारोह के उपचार से पहले और 1 दिन, 7 दिन, और 28 दिन कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद । एक छठे घोड़े में, 2% lidocaine के 1 मिलीलीटर आगे सुई की सही स्थिति की पुष्टि करने के लिए इंजेक्शन है । इससे वामपंथी arytenoid उपास्थि का अस्थायी पक्षाघात हो जाता है.
इस अध्ययन से साबित होता है कि आवर्तक स्वरयंत्र तंत्रिका एक विद्युत तंत्रिका उत्तेजितकर्ता की मदद से संपर्क किया जा सकता है और कि तंत्रिका की बिजली की उत्तेजना अच्छी तरह से घोड़ों द्वारा सहन कर रहा है । स्वरयंत्र समारोह का कोई संशोधन स्टेम सेल के इंजेक्शन के बाद घोड़ों में से किसी में मनाया गया । इसके अलावा अध्ययन एक पेरि के प्रभाव का वर्णन करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए-ऑटोलॉगस मांसपेशी के ंयूरॉन इंजेक्शन व्युत्पंन mesenchymal RLN से पीड़ित घोड़ों को स्टेम कोशिकाओं ।
Introduction
RLN arytenoid पक्षाघात की डिग्री बदलती द्वारा विशेषता घोड़ों में ऊपरी airway की एक आम विकृति है । गला के बाईं ओर सबसे अधिक प्रभावित है । रोग के प्रसार के कुछ घोड़े की आबादी में ३५% तक पहुंच सकते हैं । यद्यपि कई परिकल्पनाओं ने इस रोग के एटियलजि और रोगजनन को समझाने की कोशिश की, पर RLN का सही कारण अनिश्चित बना रहता है. विकृति ग्रासलेल्या के घावों के साथ आवर्तक स्वरयंत्र तंत्रिका की एक बाहर axonopathy के रूप में वर्णित है, लेकिन यह भी remyelination के कुछ डिग्री । इस axonopathy आंतरिक स्वरयंत्र मांसपेशियों और सहवर्ती शोष1,2के वितंत्रीभवन की ओर जाता है । इस विकृति अक्सर धीरे प्रगतिशील है और प्रभावित पक्ष3के arytenoid अपहरण की कुल हानि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
प्रभावित घोड़े व्यायाम के दौरान असामान्य श्वसन ध्वनियों का उत्सर्जन करते हैं और कभी-कभार, अधिक गंभीर मामलों में व्यायाम असहिष्णुता दिखाते हैं । निश्चित निदान एक गैर बेहोश खड़े घोड़े पर इंडोस्कोपिक परीक्षा द्वारा किया जाता है, जहां स्वरयंत्र अपहरण का एक आंशिक या कुल नुकसान मनाया1,2,4है । वर्तमान में, सबसे आम उपचार laryngoplasty (भी "टाई-बैक" के रूप में जाना जाता है), जो कभी-कभार एक ventriculo-cordectomy के साथ जुड़ा होता है । हालांकि इन सर्जरी की समग्र सफलता दर उत्कृष्ट5को अच्छा माना जाता है, के बाद ऑपरेटिव जटिलताओं बहुत आम हैं । सबसे आम जटिलता अपहरण की एक क्रमिक नुकसान है । बार्नेट एट अल. 6 पहले छह सप्ताह के भीतर कम से कम ७६% घोड़ों की सर्जरी के बाद अपहरण के एक ग्रेड का नुकसान की सूचना दी । अन्य जटिलताओं, जैसे कृत्रिम अंग अंग विफलता, खाँसी, और airway संदूषण, भी सूचित कर रहे हैं5.
Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) अनुसंधान और अभ्यास में एक दशक से अधिक के लिए घोड़े की दवा का एक हिस्सा रहा है, हालांकि उनकी दक्षता पर सिद्ध अध्ययन अभी भी दुर्लभ हैं । दो सबसे अधिक वयस्क mesenchymal के शोषित सूत्रों के घोड़ों में स्टेम सेल अस्थि मज्जा और वसा ऊतक7हैं । दोनों नमूना तकनीक अपेक्षाकृत आक्रामक है और हमेशा कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या के लिए नेतृत्व नहीं है । हाल ही में, Ceusters एट अल । 7 धारीदार मांसपेशी ऊतक, जो एक कम इनवेसिव microbiopsy तकनीक द्वारा प्राप्त की है से व्युत्पंन स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति का वर्णन किया ।
MSCs स्व-नवीकरण, स्व-सृजन, multipotency, और विभेद७,८में सक्षम हैं. उनकी क्षमता वसा, हड्डी, मांसपेशियों के सभी मध्य त्वक स्तर वंश में अंतर करने के लिए, और उपास्थि अब अच्छी तरह से9की स्थापना की है. हालांकि, विशिष्ट पर्यावरणीय परिस्थितियों में, वे गैर-mesenchymal वंश जैसे न्यूरॉन्स, astrocytes, और परिधीय तंत्रिका तंत्र के myelinating कोशिकाओं और रीढ़ की हड्डी9,10में अंतर कर सकते हैं । MSCs पहले से ही कई न्यूरोपैथी मॉडल में इस्तेमाल किया गया है10,11. अपने को पुनर्जीवित तंत्रिका ऊतक के क्षेत्रों में विस्थापित और तंत्रिका कोशिकाओं को पुनर्जीवित करने की क्षमता एक प्रणालीगत और स्थानीय प्रशासन11के बाद प्रदर्शन किया गया है । इसके अलावा, Schwann की तरह MSCs से व्युत्पंन कोशिकाओं मैक्रोफेज भर्ती करने के लिए सेलुलर मलबे को हटाने और neurotrophic axonal विकास और9remyelination को बढ़ावा देने के कारकों स्रावित कर सकते हैं ।
इस अध्ययन का उद्देश्य एक तंत्रिका उत्तेजित करने की तकनीक का वर्णन है-मांसपेशी की निर्देशित इंजेक्शन-व्युत्पंन ऑटोलॉगस स्वस्थ घोड़ों में बाईं आवर्तक स्वरयंत्र तंत्रिका के पास स्टेम कोशिकाओं । आमतौर पर, एक तंत्रिका उत्तेजित करने के लिए एक इंजेक्शन सुई से जुड़ा है कि क्षेत्र के लिए स्थानीय निश्चेतक लागू करने के क्रम में परिधीय नसों के इलेक्ट्रो स्थानीयकरण के लिए प्रयोग किया जाता है12. एक कमजोर प्रत्यक्ष वर्तमान आवेग एक मोटर प्रतिक्रिया पैदा करने के लिए तंत्रिका को निकटता में आपूर्ति की है. इस मोटर प्रतिक्रिया का उत्पादन करने की क्षमता कई मापदंडों पर निर्भर करता है, जैसे सुई के प्रवाहकीय क्षेत्र, ऊतक के किसी भी प्रतिबाधा, वर्तमान लागू, पल्स अवधि, और सुई से तंत्रिका को दूरी. सुई के बाकी अछूता है, जबकि तंत्रिका उत्तेजित सुई सुई की नोक पर एक बहुत ही सीमित प्रवाहकीय क्षेत्र के लिए तैयार कर रहे हैं । इस डिजाइन को ठीक तंत्रिका स्थानीयकरण में मदद करता है । आधुनिक तंत्रिका उत्तेजितताओं ऊतक impedances अलग करने के लिए अनुकूल है और मशीन पर लगातार amperage सेट उद्धार । इसके अलावा, सबसे मशीनों ०.१ एस की एक पल्स अवधि का उपयोग करें, ताकि समाप्त मापदंडों वर्तमान लागू कर रहे हैं और सुई के लिए दूरी. सुई के बीच संबंध-तंत्रिका दूरी और वर्तमान के लिए एक मोटर प्रतिक्रिया उत्पादन आवश्यक है Coulomb कानून द्वारा वर्णित है: ई = kQ/ जहां ई आवश्यक उत्तेजना प्रभारी है, कश्मीर है Coulomb निरंतर, क्ष ंयूनतम आवश्यक उत्तेजना प्रभारी है, और आर दो इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी है । तंत्रिकाओं के इलेक्ट्रो-स्थानीयकरण में, दो इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी के लिए सुई-तंत्रिका दूरी12माना जाता है. विद्युत प्रभारी सुई के व्युत्क्रम वर्ग के नियम के बाद फैलने वाली तंत्रिका दूरी13। नैदानिक अभ्यास से पता चला है कि मोटर तंत्रिका उत्तेजना ०.५ मा अत्यधिक सफल तंत्रिका ब्लॉक करने के लिए संबंधित है और कम धाराओं में मोटर संकेत का नुकसान है कि आकस्मिक intraneuronal इंजेक्शन प्रशासन से उपयोगकर्ता को रोकने जाएगा. इस अध्ययन का उद्देश्य घोड़ों की सीमित संख्या में इस तकनीक की व्यवहार्यता और सुरक्षा का परीक्षण करना है । यदि व्यवहार्यता और इस तकनीक की सुरक्षा की पुष्टि कर रहे हैं, यह आसानी से प्रभावित घोड़ों को हस्तांतरित किया जा सकता है । इसके अलावा, घोड़े RLN परिधीय अपक्षयी न्यूरोपैथी के लिए एक मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
Protocol
यूनिवर्सिटी ऑफ Liege के एथिकल फीमेल एनिमल्स के लिए आयोग ने स्टडी प्रोटोकॉल को मंजूरी दी ।
1. बलवान Microbiopsy
- दृश्य निरीक्षण और टटोलने का कार्य द्वारा नमूना साइट की पहचान, triceps मांसपेशी के लंबे सिर में, कोहनी और कंधे की बात के बीच लगभग midline.
- क्लिप लगभग 2 x 2 cm2 के एक विद्युत क्लिपर के साथ एक क्षेत्र । लागू सर्जिकल polyiodide तरल साबुन और शराब से मिलकर 1 मिनट के लिए कतरनी क्षेत्र में संपीड़ित । कतरनी और संक्रमित क्षेत्र के केंद्र में एक 25 ग्राम सुई के साथ 2% lidocaine समाधान के चमड़े के नीचे 1 मिलीलीटर इंजेक्षन ।
- जीवाणुरोधी हाथ साबुन के साथ हाथ धोने । बाँझ दस्ताने पर रखो । एक बाँझ सतह के रूप में एक डिस्पोजेबल बाँझ कपड़ा बायोप्सी सुई और trocar पर जगह के लिए उपयोग करें ।
- हाथ अर्द्ध स्वत: 14 जी बायोप्सी सुई वसंत तंत्र खींच द्वारा के रूप में आंकड़े 1b और 1cमें दिखाया गया है । अपने तंत्र से परिचित पाने के लिए बायोप्सी सुई छोड़ें । बाँझ सतह पर सशस्त्र बायोप्सी सुई रखें । trocar के साथ परिचित हो जाओ, जो एक प्रवेशनी और एक obturator के रूप में चित्र 1aमें दिखाया के होते हैं ।
चित्रा 1 : बायोप्सी सुई सेट । बायोप्सी सुई सेट (एक) प्रवेशनी और उसके obturator और बायोप्सी सुई (ऊपर से नीचे तक) के होते हैं । अंय पैनलों इसके (ख) तटस्थ और (ग) सशस्त्र स्थिति में बायोप्सी सुई दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
- प्रवेशनी और obturator कोडांतरण और उंहें एक बंद की स्थिति में रखने के द्वारा trocar तैयार करते हैं । पूर्व में संवेदनशील क्षेत्र के माध्यम से त्वचा के लिए सीधा trocar परिचय । एक स्थिति है जहां trocar की नोक लगभग १.५ सेमी मांसपेशी में गहरी है trocar अग्रिम । trocar को बाहर निकाल लें, उसके obturator से प्रवेशनी को अलग कर देना, और बाँझ सतह पर obturator को लगाएं ।
- प्रवेशनी के माध्यम से सशस्त्र बायोप्सी सुई परिचय । मांसपेशी में त्वचा चीरा के माध्यम से सुई और प्रवेशनी परिचय । एक स्थिति है जहां सुई की नोक triceps मांसपेशी के लंबे सिर के बीच में है करने के लिए सुई अग्रिम ।
- बायोप्सी सुई रिहाई और फिर प्रवेशनी के साथ एक साथ बायोप्सी सुई बाहर खींच । प्रवेशनी से बाहर बायोप्सी सुई खींचो । बाँझ सतह पर प्रवेशनी छोड़ दें ।
- एक हाथ से वसंत खींच और यह दूसरे के साथ पकड़े द्वारा बायोप्सी सुई खोलें ।
नोट: नमूना बायोप्सी सुई की नोक पर दिखाई देता है । - एक दूसरे व्यक्ति की मदद के साथ, नमूना माध्यम शामिल है कि नमूना ट्यूब खोलें. एक 19 जी hypodermic सुई बायोप्सी सुई से छोटे मांसपेशी टुकड़ा हटाने के लिए उपयोग करें । नमूना माध्यम में मांसपेशी का नमूना रखें । पेंच टोपी के साथ ट्यूब बंद करो और धीरे से यह सुनिश्चित करें कि नमूना माध्यम में तैर रही है 2x झुकाव ।
- हाथ बायोप्सी सुई । बाँझ सतह से प्रवेशनी ले लो और सशस्त्र बायोप्सी सुई और प्रवेशनी फिर से इकट्ठा । पहले वर्णित के रूप में त्वचा चीरा के माध्यम से सशस्त्र सुई और प्रवेशनी परिचय । दोहराएं नमूना प्रक्रिया 2 – 3x जब तक लगभग 20 मांसपेशी ऊतक के मिलीग्राम नमूना है । नमूना ट्यूब बंद करें । धीरे नमूना मध्यम के साथ मांसपेशियों के टुकड़े मिश्रण करने के लिए ट्यूब 2x बारी.
- 4 से 8 डिग्री सेल्सियस के बीच लगातार तापमान पर नमूनों को प्रयोगशाला में शिप करें ।
नोट: प्रयोगशाला में फिर नमूने की प्रक्रिया होगी । प्रोटोकॉल यहां ठहर सकता है । - प्रक्रिया अच्छी तरह से सहन और नमूना पक्ष में व्यथा है मनाया नहीं है । मांसपेशी व्यथा की संभावना नहीं घटना में नमूना साइट पर मनाया, उचित एनाल्जेसिक उपचार प्रशासन ।
2. कोशिकाओं का उपचार
नोट: इस स्टडी में इस्तेमाल होने वाली स्टेम सेल को Ceusters एट अल द्वारा बताई गई विधि के अनुसार तैयार किया गया है । 7. उनके लेख भी कोशिकाओं के लक्षण वर्णन ।
- विशिष्ट संस्कृति माध्यम तैयार करके प्रारंभ करें, DF20, गर्मी के 20% को जोड़कर निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, पेनिसिलिन की 5 मिलीलीटर (१,००० IU/एमएल)-streptomycin (१०,००० µ g/एमएल), और २.५ एमएल amphotericin बी (२५० µ g/एमएल) की एक बोतल के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध की ५०० मिलीलीटर कल्चरल मीडियम विथ glutamine एंड phenol रेड.
- DF20 संस्कृति माध्यम के १५० µ एल डालो एक 24-बहु अच्छी तरह से पकवान के भीतरी 16 कुओं में से प्रत्येक में । फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 1 मिलीलीटर डालना [पोटेशियम क्लोराइड (२०० मिलीग्राम/एल), पोटेशियम फॉस्फेट monophasic (२०० mg/l), सोडियम क्लोराइड (८,००० mg/l), और पोटेशियम फॉस्फेट diphasic (२,१६० mg/l)] शेष बाहरी कुओं में.
- छोटे पंजाबियों में मांसपेशियों के टुकड़े 2x कुल्ला । उंहें एक स्केलपेल और संदंश की मदद से बहुत छोटे टुकड़ों में अलग और एक छोटा सा टुकड़ा (स्केलपेल ब्लेड की नोक के आकार के) के प्रत्येक भीतर-16 अच्छी तरह से बहु अच्छी तरह से पकवान की जगह ।
- एक मशीन में मल्टी-अच्छी तरह से पकवान प्लेस निंनलिखित शर्तों पर बनाए रखा: ३७ ° c, 21% हे2, और 5% सह2। एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत हर दिन कुओं की निगरानी और अगर बाहर सुखाने से कोशिकाओं को रोकने के लिए आवश्यक DF20 के ५० µ एल जोड़ें ।
नोट: लगभग 10 डी के बाद, वहां पर्याप्त explant से हो कोशिकाओं को स्टेम सेल अलगाव की अनुमति होगी । प्रोटोकॉल यहां ठहर सकता है । - जब कोशिकाओं के एक प्रभामंडल मांसपेशी explants के आसपास दिखाई दे रहा है, मांसपेशी ऊतक के explant त्यागें । प्रत्येक कुआं में एक EDTA-युक्त trypsin समाधान के १५० µ l का उपयोग करके कक्षों को अलग करें: संस्कृति माध्यम को त्यागें, पंजाबियों की 1 मिलीलीटर वाली कोशिकाओं को कुल्ला करें, पंजाबियों को त्यागें, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट की अधिकतम के लिए trypsin समाधान जोड़ें । trypsin की कार्रवाई को रोकने के लिए संस्कृति माध्यम जोड़ें, सेल निलंबन फसल, और फिर, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए २०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और एक संतुलित नमक समाधान में गोली निलंबित ।
- 3 परतों की एक सतत घनत्व ढाल पर सेल निलंबन स्थानांतरण (15%, 25%, और ३५%) । सेल निलंबन और 20 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर १,२५० x g पर सतत घनत्व ढाल समाधान युक्त ट्यूब केंद्रापसारक । केंद्रापसारक के ब्रेक का उपयोग न करें । विभिंन घनत्व है कि इस केंद्रापसारक के बाद निरंतर घनत्व ढाल समाधान के विभिंन परतों के बीच दिखाई देगा के साथ सेल भागों का निरीक्षण ।
- 15 और 25% के बीच के अंश के साथ संस्कृति जारी रखें । यह एक ट्यूब के लिए स्थानांतरण और संतुलित नमक समाधान के साथ धो लो । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए २०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें । DF20 के 1 मिलीलीटर में गोली सस्पैंड के साथ आगे बढ़ें । एक सेल संस्कृति कुप्पी, 25 सेमी2की एक सतह के साथ, DF20 के 6 मिलीलीटर के साथ भरें । भरण सेल संस्कृति कुप्पी और संस्कृति में उंहें निंनलिखित शर्तों के साथ एक मशीन में स्थानांतरण कोशिकाओं: 37 ° c, 21% O2, और 5% सह2।
नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । - एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत हर दिन कोशिकाओं की निगरानी. यदि आवश्यक हो तो संस्कृति माध्यम को बदलें (पुराने माध्यम को त्याग दें और नए संस्कृति माध्यम के 6 मिलीलीटर जोड़ें) । संस्कृति व्यंजन में सेल परतों को देख कर, एक पूर्वनिर्धारित आवर्धन पर एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेलुलर संगम का निर्धारण । डिश है कि कोशिकाओं के कब्जे में है की सतह का अनुमान है । हर प्रेक्षण के लिए एक निश्चित सूक्ष्म आवर्धन पर काम करने के लिए संगम का मूल्यांकन कर सकता है । जब कोशिकाओं पकवान की सतह के ८५% पर कब्जा, कोशिकाओं के एक मार्ग के साथ आगे बढ़ना ।
- जब कक्ष धाराप्रवाह होते हैं, तो उन्हें चरण २.४ में वर्णित समान प्रोटोकॉल के साथ एक EDTA-युक्त trypsin समाधान का उपयोग करके अलग करें. फिर, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए २०० x g पर सेल निलंबन की शुरुआत । supernatant को त्यागें और DF20 के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं के पुनर्निलंबन के साथ आगे बढ़ें । उंहें १७५ सेमी2 DF20 के 25 मिलीलीटर के साथ भर के एक सेल संस्कृति कुप्पी में रखें । निंनलिखित शर्तों के साथ एक मशीन में कुप्पी प्लेस: 37 ° c, 21% O2, और 5% सह2।
नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । - एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत हर दिन कोशिकाओं की निगरानी. यदि आवश्यक हो तो मध्यम बदलें (पुराने माध्यम को त्याग दें और 30 मिलीलीटर नए माध्यम से जोड़ें) । जब कोशिकाओं को धाराप्रवाह हैं, उंहें अलग trypsin-EDTA चरण २.४ में वर्णित के रूप में का उपयोग कर । फिर, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए २०० x g पर सेल निलंबन की शुरुआत । supernatant को छोड़ें और DF20 के 6 मिलीलीटर में कक्षों को निलंबित करें । प्लेस ६ १७५ में सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर-सेमी2 कुप्पी, प्रत्येक DF20 के 25 मिलीलीटर के साथ भरा हुआ है, और उंहें एक सह2 मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति (21% O2 और 5% सह2के साथ) ।
- एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत हर दिन कोशिकाओं की निगरानी. यदि आवश्यक हो तो मध्यम को बदलें (पुराने मध्यम को त्यागें और प्रत्येक कुप्पी में नए माध्यम के ३० मिलीलीटर जोड़ें). जब कोशिकाओं को धाराप्रवाह हैं, उंहें अलग trypsin-EDTA चरण २.५ में वर्णित के रूप में का उपयोग कर । उंहें २०० x जी में 3x ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए और हर कदम पर supernatant त्यागना ।
- एक Bürker गिनती कक्ष और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप की मदद से कोशिकाओं गिनती । एक सेलुलर निलंबन की तैयारी १०,०००,००० कोशिकाओं के एक विशिष्ट cryopreservation माध्यम के एमएल/
- डीप-cryopreservation मध्यम के 1 मिलीलीटर में 1 x 107 कोशिकाओं के चिकित्सीय खुराक फ्रीज और उंहें तरल नाइट्रोजन की वाष्प चरण में उनके उपयोग तक की दुकान ।
नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । - अंतिम उपयोग के लिए सूखी बर्फ पर शीशी में कोशिकाओं जहाज ।
3. कोशिकाओं के इंजेक्शन
नोट: दो लोगों को स्टेम कोशिकाओं के इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हैं ।
- कमरे के तापमान को उत्तरोत्तर सेल निलंबन गर्म । एक 2 मिलीलीटर सिरिंज में निलंबन महाप्राण ।
- एक 19 ग्राम hypodermic सुई के साथ jugular नस में detomidine 10 µ G/kg इंजेक्शन द्वारा घोड़े को बेहोश । 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए बेहोशी की स्थिति है, जो की विशेषता सिर नीचे घोड़े के स्थान से दिखाई बन जाता है का पूरा प्रभाव देखने के लिए ।
- एक क्लिपर के साथ घोड़े के बाएं स्वरयंत्र क्षेत्र पर 20 x 10 सेमी2 के एक जोन क्लिप, जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है । फिर, कतरनी क्षेत्र के लिए polyiodide साबुन और शराब की एक शल्य सफ़ाई लागू होते हैं ।
- घोड़े की बाईं नाक के माध्यम से एक लचीला मानक वीडियो एंडोस्कोप प्लेस और nasopharynx की ओर अग्रिम । दोनों arytenoid उपास्थि और उपकंठ की एक पूर्ण दृश्य प्राप्त किया है जब तक एंडोस्कोप की स्थिति को समायोजित करें । प्रक्रिया के दौरान इस स्थिति में एंडोस्कोप पकड़ो और ऑपरेटरों की ओर वीडियो एंडोस्कोप की स्क्रीन बारी है ।
- तंत्रिका उत्तेजित करता है नकारात्मक इलेक्ट्रोड के लिए उत्तेजना/ सुई की बाँझ शर्तों को बनाए रखने. एक इलेक्ट्रोड पैच है, जो काटा हुआ त्वचा के क्षेत्र में फंस गया है करने के लिए तंत्रिका उत्तेजितकर्ता के सकारात्मक इलेक्ट्रोड कनेक्ट.
- इंजेक्शन लाइन के लिए सेल निलंबन युक्त सिरिंज से कनेक्ट करें और सिस्टम की हवा का पीछा करने के लिए ट्यूब को भरने । प्रणाली की मात्रा याद रखें और बाँझ खारा समाधान की एक ही मात्रा के साथ एक सिरिंज तैयार करते हैं ।
- इस तकनीक से परिचित नहीं हैं, तो ब्याज के क्षेत्र में संरचनात्मक संरचनाओं कल्पना करने के लिए एक संक्रमित 5 से 7 मेगाहर्ट्ज रैखिक अल्ट्रासाउंड transducer का उपयोग करें । एक बाँझ अल्ट्रासाउंड युग्मन जेल का उपयोग करने के लिए छवि गुणवत्ता में वृद्धि. गला और वाहिकाओं कि गला के पृष्ठीय क्षेत्र में चलाने कल्पना ।
- एक बार इस क्षेत्र के एनाटॉमी के साथ परिचित, उत्तेजना परिचय/गला के dorsolateral पहलू की ओर इंजेक्शन सुई । जब गला के dorsolateral पहलू आ, 1 हर्ट्ज उत्तेजना मोड में 2 mA के वर्तमान के साथ तंत्रिका उत्तेजित करना शुरू करते हैं ।
- धीरे आवर्तक स्वरयंत्र तंत्रिका की स्थिति की ओर सुई चाल जबकि स्क्रीन पर इंडोस्कोपिक देखने के अवलोकन । जैसे ही वाम arytenoid उपास्थि का अपहरण आंदोलन वीडियो स्क्रीन पर दिखाई देता है, तब तक करंट कम हो जाता है जब तक कि जगह में सुई रखते हुए आंदोलन गायब हो जाता है.
- सुई की आदर्श स्थिति की पहचान करें । तंत्रिका से आदर्श दूरी के रूप में ०.५ mA में मोटर प्रतिक्रिया के नुकसान पर विचार करें । जब arytenoid उपास्थि आंदोलनों ०.४ mA से कम धाराओं पर बनी रहती है, एक intraneuronal इंजेक्शन में परिणाम हो सकता है के रूप में कोशिकाओं, सुई नहीं.
- जब ०.५ mA में मोटर प्रतिक्रिया की हानि मनाया जाता है, तो सेल निलंबन 107 ऑटोलॉगस स्टेम कोशिकाओं युक्त इंजेक्शन और खारा चरण ३.६ में तैयार समाधान के साथ इंजेक्शन लाइन फ्लश । यह सेल निलंबन है कि इंजेक्शन ट्यूब में रह के बाकी इंजेक्षन होगा ।
- कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद, सुई और एंडोस्कोप बाहर ले ।
- घोड़े को बेहोशी से ठीक होने दें । कोई आगे उपचार बायोप्सी साइट के लिए आवश्यक है ।
Representative Results
यूनिवर्सिटी ऑफ Liege के एथिकल फीमेल एनिमल्स के लिए आयोग ने स्टडी प्रोटोकॉल को मंजूरी दी । मोंट-le-सोइए घोड़े अनुसंधान केंद्र में अनुसंधान घोड़ों के झुंड से छह घोड़ों को इस अध्ययन में शामिल किया गया । पहले घोड़े में आवर्तक स्वरयंत्र तंत्रिका electrostimulation द्वारा स्थानीयकृत किया गया था । चित्रा 2 , उत्तेजना सुई तंत्रिका उत्तेजक में घोड़े की गला के बाईं dorsolateral पहलू में डाला के साथ इस्तेमाल किया सेटिंग से पता चलता है । जब arytenoid उपास्थि के आंदोलन की हानि ०.५ मा मनाया जाता है, 2% lidocaine के 1 मिलीलीटर इंजेक्शन है । यह उच्च धाराओं और बाईं arytenoid के एक क्षणभंगुर पक्षाघात में आंदोलन के अभाव में हुई । नियंत्रण एंडोस्कोपी, 24 एच बाद में, arytenoid समारोह की एक पूरी वसूली का पता चला । पूर्ण प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक पांच घोड़ों में दोहराया गया था । घोड़ों में से कोई भी मांसपेशी microbiopsy के लिए एक नकारात्मक प्रतिक्रिया दिखाई । सभी घोड़ों में निर्धारित समय में पर्याप्त संख्या में कोशिकाएं उगाई जाती थीं । ऊपरी airway एंडोस्कोपी सभी पांच घोड़ों और मैं या II .1 के स्वरयंत्र समारोह स्कोर रॉबिंसन एट अल के अनुसार में किया गया था । 14 का निर्धारण किया गया । सभी घोड़ों आवर्तक स्वरयंत्र तंत्रिका की तंत्रिका उत्तेजना बहुत अच्छी तरह से सहन । कोई प्रतिकूल प्रतिक्रिया के दौरान या उत्तेजना या स्टेम सेल के इंजेक्शन के बाद मनाया गया ।
सभी एंडोस्कोपी दर्ज की गई और दो अंधा चिकित्सकों द्वारा बनाए गए । स्वरयंत्र कार्यों के पूर्व इंजेक्शन स्कोर के बीच कोई अंतर नहीं था और स्टेम सेल इंजेक्शन के बाद दिन 1, 7, और 28 पर प्राप्त स्कोर, के रूप में Wilcoxon रैंक विश्लेषण द्वारा परीक्षण15. तालिका 1 अलग समय बिंदुओं पर सभी घोड़ों के स्वरयंत्र स्कोर का सार है, साथ ही सुई की प्रविष्टि से स्टेम कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए समय और वर्तमान है कि arytenoid आंदोलन उकसाया जब कोशिकाओं को जहां इंजेक्शन ।
वर्तमान अध्ययन में जिन कोशिकाओं का उपयोग किया गया है, उनमें से7पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किए गए थे । सभी अंशों से कोशिकाओं को trilineage विभेद करने में सक्षम थे, CD90 और CD44 व्यक्त, CD45 और MHC द्वितीय व्यक्त नहीं किया, और clonogenic क्षमता थी । 15-25% अंश की कोशिकाओं को आगे प्रसंस्करण के लिए चुना गया है क्योंकि वे CD90 की सबसे बड़ी अभिव्यक्ति और सबसे बड़ी प्रफलन क्षमता दिखाई ।
वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य स्टेम सेल आवेदन की क्षमता का परीक्षण करने के लिए एक क्षतिग्रस्त परिधीय तंत्रिका पुनर्जंम लेकिन केवल प्रक्रिया की व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए और एक smal में आवर्तक स्वरयंत्र तंत्रिका को स्टेम सेल इंजेक्शन की सुरक्षा का आकलन करने के लिए नहीं था एल स्वस्थ घोड़ों की संख्या । पांच घोड़ों में इंडोस्कोपिक इमेजिंग पर किसी भी कार्यात्मक परिवर्तन की अनुपस्थिति 28 दिनों के लिए इंजेक्शन और पांच घोड़ों में से चार में किसी भी नैदानिक संकेत के एक अनुपस्थिति के बाद इंजेक्शन के बाद व्यवहार्यता और प्रक्रिया की सुरक्षा की पुष्टि की । एक घोड़े को अध्ययन के लिए असंबंधित कारणों के लिए अनुवर्ती अवधि में euthanized होना था । हालांकि तकनीक घोड़ों की एक छोटी संख्या में सुरक्षित साबित होता है, वर्तमान अध्ययन में शामिल घोड़ों की संख्या बहुत दुर्लभ घटनाओं की अनुपस्थिति प्रदर्शित कम है ।
| इंजेक्शन से पहले स्कोर | समय इंजेक्शन के लिए (मिनट) | इंजेक्शन पर वर्तमान (एमए) | दिन में स्कोर 1 पोस्ट इंजेक्शन | दिन में स्कोर 7 पोस्ट इंजेक्शन | दिन में स्कोर 28 पोस्ट इंजेक्शन | |
| घोड़ा 1 (Standardbred, घोड़ी, 16 साल की उम्र) | II .1 | 12 | ०.५ | मैं | II .1 | II .1 |
| घोड़ा 2 (Standardbred, घोड़ी, 22 साल की उम्र) | मैं | 3 | ०.७ | मैं | मैं | मैं |
| घोड़ा 3 (Standardbred, घोड़ी, 11 साल की उम्र) | II .1 | 4 | ०.५ | II. 2 | II .1 | II .1 |
| घोड़ा 4 (Standardbred, घोड़ी, 12 साल की उम्र) | मैं | 7 | ०.५ | मैं | II .1 | मैं |
| घोड़ा 5 (Standardbred, घोड़ी, 10 साल की उम्र) | मैं | 3 | ०.७ | II .1 | मैं |
तालिका 1: संकेत और घोड़ों के स्वरयंत्र समारोह स्कोर । इस तालिका इंजेक्शन के समय, इंजेक्शन से पहले किसी भी arytenoid आंदोलन उत्तेजक कम वर्तमान से पता चलता है, और पांच स्वस्थ घोड़ों के स्वरयंत्र स्कोर से पहले और दिन में 1, 7, और 28 ऑटोलॉगस मांसपेशी के इंजेक्शन के बाद व्युत्पंन mesenchymal स्टेम कोशिकाओं में बाईं स्वरयंत्र आवर्तक तंत्रिका निकटता । हार्स #5 के लिए इस अध्ययन से असंबंधित कारणों के लिए इंजेक्शन के बाद 28 दिन में नियंत्रण के लिए उपलब्ध नहीं था । स्कोर रॉबिंसन एट अल द्वारा वर्णित स्कोर को देखें । 14. यहां, स्कोर मेरा मतलब है कि दोनों arytenoid उपास्थि के आंदोलनों तुल्यकालिक और सममित थे, और दोनों arytenoid उपास्थि का एक पूरा अपहरण प्राप्त किया और बनाए रखा जा सकता है । स्कोर II .1 का अर्थ है कि arytenoid उपास्थि के आंदोलनों अतुल्यकालिक थे या कुछ समय असममित हो सकता है; तथापि, दोनों arytenoid उपास्थियों का एक पूर्ण अपहरण प्राप्त किया जा सकता है और बनाए रखा.
चित्रा 2 : स्टेम कोशिकाओं के इंजेक्शन के दौरान सेटिंग. तंत्रिका उत्तेजना सुई गला के बाईं ओर पर शुरू की है और बाईं आवर्तक स्वरयंत्र तंत्रिका की ओर निर्देशित । तंत्रिका उत्तेजक ०.८ मा पर सेट है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
इस प्रोटोकॉल मांसपेशी के सफल आवेदन-व्युत्पंन ऑटोलॉगस एक तंत्रिका उत्तेजित करता है-निर्देशित दृष्टिकोण का उपयोग घोड़ों में आवर्तक स्वरयंत्र नसों को स्टेम कोशिकाओं का वर्णन । मांसपेशी microbiopsy नमूना की फसल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अलगाव, संस्कृति, और स्टेम कोशिकाओं के लक्षण वर्णन, से पहले विस्तार से वर्णित किया गया है, जबकि एक परिधीय तंत्रिका को निकटता में इन कोशिकाओं के इंजेक्शन मूल है । एक विद्युत तंत्रिका उत्तेजितकर्ता के साथ तंत्रिका के विद्युत स्थानीयकरण वर्तमान अध्ययन के लिए सेवा की है और आवर्तक स्वरयंत्र तंत्रिका को सीधे निकटता में mesenchymal स्टेम कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । मोटर रिस्पांस nasopharynx के माध्यम से वीडियो एंडोस्कोपी द्वारा निगरानी की गई । सुई की पोजीशनिंग प्रक्रिया के दौरान, अन्य नसों उत्तेजित थे, इसी आंदोलन एंडोस्कोपी स्क्रीन पर दिखाई दे रहा था । आवर्तक स्वरयंत्र तंत्रिका की एक सफल उत्तेजना arytenoid उपास्थि की ठेठ अपहरण की विशेषता थी. एक घोड़ा में, स्थानीय संवेदनाहारी arytenoid मांसपेशी के एक क्षणिक पक्षाघात प्रेरित करने के लिए इंजेक्शन था । हालांकि तंत्रिका को निकटता में कोशिकाओं के सफल आरोपण वर्तमान अध्ययन में विशेष रूप से परीक्षण नहीं किया गया है, एक कम वर्तमान में तंत्रिका और इंजेक्शन के इलेक्ट्रो स्थानीयकरण साबित कर दिया कि स्टेम सेल तंत्रिका के पास लागू किया गया । तंत्रिका को injectate की निकटता आगे एक सफल मोटर एक स्थानीय संवेदनाहारी के एक इंजेक्शन द्वारा प्रेरित ब्लॉक द्वारा प्रदर्शन किया गया था ।
शेष पांच घोड़ों में, पहली उत्तेजना से समय तक सफल स्टेम सेल 3 से 12 मिनट के विभिंन इंजेक्शन से अलग किया गया है, जो बिजली की उत्तेजना के साथ उनके अनुपालन में वृद्धि हुई प्रक्रिया के दौरान थोड़ा बेहोश थे । घोड़ों में से कोई भी एक समय में प्रतिकूल प्रतिक्रिया नहीं दिखाया, यह दर्शाता है कि उत्तेजना की अवधि के लिए अगर अच्छा सुई स्थिति प्राप्त करने के लिए आवश्यक लंबे समय तक किया जा सकता है । एक खड़ी सीखने की अवस्था अगर ऑपरेटर नियमित रूप से इस तकनीक का उपयोग कर रहा है और अलग शरीर रचना विज्ञान के साथ घोड़ों की एक बड़ी संख्या में मनाया जाने की उंमीद है ।
घोड़ों को आमतौर पर RLN, जो छोड़ दिया arytenoid उपास्थि असामान्य श्वसन ध्वनियों और व्यायाम असहिष्णुता के लिए अग्रणी के पक्षाघात की डिग्री बदलती द्वारा विशेषता है से पीड़ित हैं । प्रभावित नसों के एक प्रोटोकॉल परिधीय न्यूरोपैथी के विशिष्ट घावों से पता चलता है16. परिधीय न्यूरोपैथी के परिधीय तंत्रिका क्षति बिगड़ा उत्तेजना, आंदोलनों, या अंग कार्यों के लिए अग्रणी के विभिन्न प्रकार का वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया शब्द है । कारण अत्यधिक चर रहे है और मधुमेह शामिल हो सकते हैं, पोषक तत्वों की कमी, विशिष्ट दवाओं के साथ एक इलाज, एक दर्दनाक चोट, ischemia, या एक संक्रमण, या वे अज्ञातहेतुक हो सकता है । कारण से स्वतंत्र, परिधीय न्यूरोपैथी शेयर आम histopathological संकेत, जैसे Wallerian अध..., बाहर का axonopathy, या फॉल्ट ग्रासलेल्या. यह दिखाया गया है कि mesenchymal के प्रशासन स्टेम कोशिकाओं क्षतिग्रस्त परिधीय नसों के लिए उनके उत्थान के लिए फायदेमंद हो सकता है; हालांकि, अंतर्निहित तंत्र अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं । परंपरागत रूप से, हम मानते है कि mesenchymal स्टेम सेल केवल वसा, मांसपेशियों, उपास्थि, और अस्थि ऊतक के progenitors में अंतर होगा, लेकिन विशिष्ट शर्तों के तहत, वे myocytes में अंतर करने के लिए दिखाया गया है17, astrocytes18 , और परिधीय19 और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र19के myelinating कोशिकाओं । के दौरान एक इन विट्रो संस्कृति में , neuropeptides के लिए एक जोखिम mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के अंतर न्यूरॉन्स21,22को व्यक्त कोशिकाओं में भेदभाव एहसान होगा. vivo अध्ययन में कई तंत्रिका पुनर्जनन और sciatic तंत्रिका चोट10,23के चूहे मॉडल में एक कार्यात्मक वसूली पर mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के लाभकारी प्रभाव का प्रदर्शन किया है । यह शायद अनुकूल पर्यावरणीय परिस्थितियों के कारण होता है जो ऊतक-विशिष्ट कोशिकाओं के24में स्टेम कोशिकाओं के विभेद में योगदान करते हैं । भविष्य के अध्ययन भी RLN-प्रभावित घोड़ों में पूर्व विभेदित कोशिकाओं के प्रशासन के लिए इस तकनीक की जांच करनी चाहिए ।
हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, यह पहली रिपोर्ट है कि एक तंत्रिका उत्तेजक के उपयोग के लिए एक परिधीय तंत्रिका स्थानीयकरण के लिए यह में एक विशिष्ट उपचार सुई का वर्णन है । विभिन्न प्रजातियों में अन्य परिधीय तंत्रिका विकृतियों, जैसे neuropathic दर्द, तंत्रिका25,26के लिए निकटता में स्टेम सेल के प्रशासन द्वारा इलाज किया जा सकता है । भविष्य के अध्ययन नैदानिक रोगियों में इस तकनीक के प्रभाव का परीक्षण और माइग्रेशन के जोखिम और इंजेक्शन कोशिकाओं के भेदभाव की क्षमता की जांच करनी चाहिए ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
अध्ययन में मोंट-le-सोइए घोड़े अनुसंधान केंद्र द्वारा वित्त पोषित किया गया है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Detomidine (Domidine) | Dechra | sold through pharmacy | |
| Lidocaine (Xylocaine) | Movianto | sold through pharmacy | |
| TOF Watch S (Nerve stimulator) | Alsevia | 79950161 | |
| TSK Starcut (Biopsy needle) | STSK laboratory | SAG - 14090C | |
| Electrostimulation needle | Pajunk | 001185-79 | |
| DMEM - F12 (culture medium) | Lonza | LO BE12-719F | |
| Heat inactivated FBS | Life technologies | 10500 | |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
| Phospate buffered saline | Lonza | LO BE17-512F | |
| 24-multiwell dish | Corning | 3524 | |
| Trypsin | Life technologies | 12604 | |
| HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
| NaCl | Sigma | S8776 | |
| T-25 cm² flasks | Nunclon | 136196 | |
| T-175 cm² flasks | Nunclon | 178883 | |
| Cryostore CS5 | Biolife solutions | 205373 |
References
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