Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur autologen Muskel-Stammzellen in der Nähe zu den wiederkehrenden laryngeal Nerv mit Hilfe eines elektrischen Nervenstimulator zu injizieren. Diese neuartige Technik kann nützlich für die Behandlung von equine rezidivierende Kehlkopf Neuropathie werden.
Abstract
Häufig wiederkehrende Kehlkopf Neuropathie (RLN) betrifft Pferde und zeichnet sich durch abnorme Atemwege Sounds und Übung Intoleranz. Der wiederkehrende laryngeal Nerv zeigt Läsionen der Demyelinisierung. Der Vorteil der Anwendung von Stammzellen demyelinated Nerven wurde in verschiedenen Tiermodellen nachgewiesen. Das Ziel der Studie war es, die Machbarkeit und Sicherheit eine Peri-neuronale Injektion von autologem Muskel abgeleitet mesenchymalen Stammzellen auf den linken wiederkehrende laryngeal Nerv bei gesunden Pferden zu testen, mithilfe eines elektrischen Nervenstimulator.
Muskel-abgeleitete Stämme Zelle stammen aus fünf gesunde Traber Pferde durch Stichproben 20 mg von Muskelgewebe mit einer halbautomatischen 14 G-Biopsie-Nadel aus dem Trizeps-Muskel. Bewegungen des Kehlkopfes sind überwachte über oberen Atemwege Videoendoskopie. Der linken wiederkehrende laryngeal Nerv wird mit einer Nadel isolierte Nervenblockade angeflogen. Nervenstimulation gilt, ab 2 mA und die erfolgreiche Entführung von der linken Arytenoid wird überwacht. Die Reizintensität wird schrittweise reduziert. Wenn ein Verlust der motorischen Reaktion beobachtet wird, bei 0,5 mA, 107 autologe Muskel-derived Stem Zellen injiziert. Zwei Prüfern, die zu dem Zeitpunkt geblendet sind, erzielen die laryngeal Funktion der Pferde vor der Behandlung und am Tag 1, Tag 7 und 28. Tag nach der Injektion der Zellen. In einem sechsten Pferd wird 1 mL 2 % Lidocain zur weiteren Bestätigung der korrekten Positionierung der Nadel injiziert. Dies führt zu eine vorübergehende Lähmung des linken Arytenoid Knorpel.
Diese Studie beweist, dass die wiederkehrende laryngeal Nerv mit Hilfe einer elektrischen Nervenstimulator angefahren werden kann und, dass die elektrische Stimulation des Nervus gut von den Pferden toleriert. Keine Änderung der laryngeal Funktion wurde in keinem der Pferde nach der Injektion von Stammzellen beobachtet. Weitere Studien sollten durchgeführt werden, um die Auswirkungen der eine Peri-neuronale Injektion von autologem Muskel abgeleitet mesenchymalen Stammzellen zu Pferde leiden RLN zu beschreiben.
Introduction
RLN ist eine allgemeine Pathologie der oberen Atemwege bei Pferden, die durch unterschiedliche Grade der Arytenoid Lähmung gekennzeichnet. Die linke Seite des Kehlkopfes ist am häufigsten betroffen. Die Prävalenz der Erkrankung kann bis zu 35 % in bestimmten Populationen Pferd erreichen. Obwohl mehrere Hypothesen versuchten, die Ätiologie und Pathogenese dieser Krankheit erklären, bleibt die genaue Ursache der RLN ungewiss. Die Pathologie wird beschrieben als eine distale Axonopathy des Nervs wiederkehrende Kehlkopf mit Läsionen der Demyelinisierung aber auch ein gewisses Maß an remyelinisierung. Diese Axonopathy führt zu der Denervation des inneren Kehlkopf Muskeln und damit einhergehende Atrophie1,2. Diese Pathologie ist oft langsam progredient und führt zum Totalverlust der Arytenoid Entführung der betroffenen Seite3.
Betroffene Pferde emittieren abnorme Lungenauskultation während des Trainings und manchmal zeigen Übungsintoleranz in schwereren Fällen. Die definitive Diagnose erfolgt durch die endoskopische Untersuchung auf einem Pferd nicht sediert stehen, wo ein teilweiser oder vollständiger Verlust der Kehlkopf Entführung1,2,4beobachtet wird. Derzeit ist die häufigste Therapie Laryngoplasty (auch bekannt als "Tie-Back"), die manchmal eine Ventriculo-Cordectomy zugeordnet ist. Obwohl die Erfolgsquote dieser Operationen als gut bis ausgezeichnet5gilt, sind postoperative Komplikationen sehr häufig. Die häufigste Komplikation ist einen allmählichen Verlust der Entführung. Barnett Et al. 6 wies einen Verlust von mindestens einer Sorte Kindesentführungen innerhalb der ersten sechs Wochen nach der Operation bei mindestens 76 % der Pferde. Andere Komplikationen wie Prothese Versagen, Husten und Atemwege Kontamination sind auch gemeldeten5.
Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) sind ein Teil der pferdemedizin in Forschung und Praxis seit mehr als einem Jahrzehnt gewesen, obwohl bewiesen ist, dass Studien über die Effizienz noch knapp sind. Die beiden am häufigsten genutzten Quellen von adulten mesenchymalen Stammzellen bei Pferden sind Knochenmark und Fettgewebe7. Beide Sampling-Techniken sind relativ invasiv und nicht immer auf eine ausreichende Anzahl von Zellen führen. Vor kurzem Ceusters Et al. 7 beschrieben die Kultur der Stammzellen aus quergestreiften Muskelgewebe, welches durch eine weniger invasive Technik Microbiopsy anfällt.
MSCs sind in der Lage, selbst-Erneuerung, Eigenstromerzeugung und Multipotenz Differenzierung7,8. Ihre Fähigkeit, in allen Mesoderm Linien von Fett, Knochen, Muskeln und Knorpel zu differenzieren ist jetzt gut etablierte9. Jedoch unter bestimmten Umweltbedingungen, können sie in nicht-Mesenchymale Linien wie Neuronen und Astrozyten Myelinating Zellen des peripheren Nervensystem und das Rückenmark9,10zu differenzieren. MSCs haben bereits in mehreren Neuropathie Modelle10,11verwendet. Ihre Fähigkeit, in Bereiche des degenerierten Nervengewebe zu migrieren und neuronalen Zellen regenerieren wurde nach einer systemischen und lokalen Verwaltungen11nachgewiesen. Darüber hinaus können Schwann-wie Zellen aus MSCs rekrutieren Makrophagen zu entfernen zelltrümmer und sezernieren neurotrophen Faktoren axonale Wachstum und remyelinisierung9zu fördern.
Das Ziel dieser Studie ist, die Technik der ein Nerv Stimulator-geführte Injektion von Muskel-autologe Stammzellen in der Nähe der linken wiederkehrende laryngeal Nerv bei gesunden Pferden zu beschreiben. In der Regel wird ein Nervenstimulator verbunden mit einer Injektionsnadel für die Elektro-Lokalisierung von peripheren Nerven eingesetzt, um Lokalanästhetika auf diesem Gebiet12anwenden. Ein schwacher Gleichstrom Impuls ist in der Nähe des Nervs induzieren eine motorische Reaktion geliefert. Die Fähigkeit, diese motorische Reaktion produzieren hängt von mehreren Parametern, wie der leitende Bereich der Nadel, jede Impedanz des Gewebes, die aktuelle angewendet, die Impulsdauer und die Entfernung der Nadel des Nervs. Nerv Stimulator Nadeln sollen haben eine sehr restriktive leitfähige Fläche an der Spitze der Nadel, während der Rest der Nadel isoliert ist. Dieses Design hilft, um genau den Nerv zu lokalisieren. Moderne Nerv Stimulatoren passen sich unterschiedlichen Gewebe Impedanzen und liefern die konstante Stromstärke an der Maschine eingestellt. Darüber hinaus verwenden die meisten Maschinen eine Impulsdauer von 0,1 s, so dass die bestimmende Parameter der aktuellen angewendet und der Abstand zur Nadel sind. Die Beziehung zwischen der Nadel-Nerv-Abstand und die aktuellen notwendig, um eine motorische Reaktion produzieren wird durch Coulomb'schen Gesetz beschrieben: E = kQ/R; wo E ist die erforderliche Stimulation Ladung, k ist die Coulomb-Konstante Q ist die minimal erforderliche Stimulation Ladung und r ist der Abstand zwischen den beiden Elektroden. In der Elektro-Lokalisierung der Nerven der Abstand zwischen den beiden Elektroden gilt die Nadel-Nerv Entfernung12. Elektrischer Ladung verflüchtigt sich nach der Regel des Platzes inverse der Nadel-Nerv Abstand13. Klinischen Praxis hat gezeigt, dass der Motor nerve Stimulation bei 0,5, die mA stark an die erfolgreiche Nervenblockade korreliert und ein Verlust der motorischen Signal bei geringeren strömen den Benutzer verhindert versehentliche intraneuronal Injektionen Verwaltung. Das Ziel dieser Studie ist es, die Machbarkeit und Sicherheit dieser Technik in einer begrenzten Anzahl von Pferden zu testen. Wenn die Machbarkeit und Sicherheit dieser Technik bestätigt werden, kann es leicht zu betroffenen Pferden übertragen werden. Weitere, equine RLN dient als ein Modell für degenerative Neuropathie.
Protocol
Die Kommission für die ethische Nutzung von Tieren von der Universität Lüttich genehmigt das Studienprotokoll.
1. Muskel Microbiopsy
- Identifizieren Sie die Beispiel-Site durch visuelle Inspektion und Palpation, in den langen Kopf des Trizeps Muskels, etwa Mittellinie zwischen Ellbogen und Schulter.
- Eine Zone von ca. 2 x 2 cm2 mit einem elektrischen Haarschneider Clip. Gelten Sie chirurgische Peeling bestehend aus Polyiodide flüssige Seife und Alkohol Kompressen für 1 min über der abgeschnittene Bereich. Injizieren Sie subkutan 1 mL 2 % Lidocain-Lösung mit einer 25 G Nadel in der Mitte der Zone abgeschnitten und desinfiziert.
- Schrubben Sie Hände mit antibakterieller Seife. Sterile Handschuhe anziehen. Verwenden Sie ein Einweg-steriles Tuch als sterile Oberfläche um die Biopsie-Nadel und den Trokar auf platzieren.
- Rüsten Sie die halbautomatische Biopsie-Nadel 14 G durch Ziehen des Federmechanismus, wie in den Figuren 1 b und 1 cgezeigt. Lassen Sie die Biopsie-Nadel mit seinen Mechanismus vertraut machen. Legen Sie die bewaffneten Biopsie-Nadel auf die sterile Oberfläche. Machen Sie sich vertraut mit den Trokar, bestehend aus einer Kanüle und ein Schieber wie in Abbildung 1ein.
Abbildung 1 : Das Biopsie-Nadel-Set. Die Biopsie-Nadel-Set besteht aus (einem) Kanüle und seinen Obturator und die Biopsie Nadel (von oben nach unten). Die anderen Platten zeigen die Biopsie-Nadel in seiner (b) neutral und (c) bewaffneten Stellung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- Bereiten Sie den Trokar durch Montage der Kanüle und der Obturator und halten sie in eine verriegelte Position. Stellen Sie den Trokar senkrecht auf die Haut durch die ehemals desensibilisiert Zone. Vorab den Trokar an eine Position, wo die Spitze des den Trokar ca. 1,5 cm ist, tief in den Muskel. Herausnehmen Sie den Trokar, distanzieren Sie die Kanüle aus der Obturator und legen Sie den Obturator auf die sterile Oberfläche.
- Die bewaffneten Biopsie-Nadel durch die Kanüle einführen. Einführen der Nadel und die Kanüle durch den Hautschnitt in den Muskel. Fördern Sie die Nadel an eine Position, wo die Spitze der Nadel in der Mitte der lange Kopf des Trizeps-Muskel ist.
- Die Biopsie-Nadel lösen und dann die Biopsie-Nadel zusammen mit der Kanüle herausziehen. Ziehen Sie die Biopsie-Nadel aus der Kanüle. Lassen Sie die Kanüle auf die sterile Oberfläche.
- Öffnen Sie die Biopsie-Nadel durch die Feder mit einer Hand ziehen und halten es mit den anderen.
Hinweis: Die Probe wird sichtbar an der Spitze der Biopsie-Nadel. - Öffnen Sie mit Hilfe einer zweiten Person das Probenröhrchen, das die Probe-Medium enthält. Verwenden einer Injektionsnadel 19 G, um das winzige Muskel-Stück von der Biopsie-Nadel zu entfernen. Legen Sie die Muskel-Probe in das Sampling-Medium. Das Röhrchen mit der Schraubkappe verschließen und neigen Sie ihn sanft 2 X um sicherzustellen, dass die Probe in das Medium schwimmt.
- Die Biopsie-Nadel zu bewaffnen. Nehmen Sie die Kanüle aus der sterile Oberfläche zu und wieder zusammenbauen Sie, bewaffneten Biopsie-Nadel und Kanüle. Stellen Sie die bewaffneten Nadel und die Kanüle durch den Hautschnitt, wie zuvor beschrieben. Wiederholen Sie der Beispielprozedur 2 – 3 X, bis ca. 20 mg des Muskelgewebes gesampelt wird. In der Nähe der Messgasleitung. Drehen Sie das Rohr 2 X, die Muskel-Stücke mit dem Sampling-Medium zu mischen.
- Versand der Proben an das Labor bei einer konstanten Temperatur zwischen 4 bis 8 ° C.
Hinweis: Im Labor wird die Probe dann verarbeiten. Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Das Verfahren ist gut verträglich und Schmerzen an der Probenahme-Seite wird nicht beobachtet. Verwalten Sie in dem unwahrscheinlichen Fall von Muskelkater bei der Probenahme Website beobachtet analgetische Behandlung.
2. die Behandlung der Zellen
Hinweis: Die Stammzellen, die in dieser Studie wurden nach der Methode von Ceusters Et Al. beschrieben vorbereitet 7. ihre Artikel beschreibt auch die Charakterisierung der Zellen.
- Starten Sie durch die Vorbereitung der spezifischen Kulturmedium, DF20, durch Zugabe von 20 % der Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum, 5 mL Penicillin (1.000 IU/mL)-Streptomycin (10.000 µg/mL) und 2,5 mL Amphotericin B (250 µg/mL), eine Flasche von 500 mL einer handelsüblichen Kulturmedium mit Glutamin und Phenol-rot.
- Gießen Sie 150 µL des Kulturmediums DF20 in jedes der inneren 16 Brunnen der 24-Multi-Well Platte. Gießen Sie 1 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) [Kaliumchlorid (200 mg/L), Kalium Phosphat monophasisch (200 mg/L), Natrium-Chlorid (8.000 mg/L) und Kalium Phosphat zweiphasig (2.160 mg/L)] in der restlichen äußeren Brunnen.
- Spülen der winzigen Muskel Stück 2 X mit PBS-Puffer. In sehr kleine Stücke mit Hilfe eines Skalpell und Pinzette zu trennen Sie und ein kleines Stück (von der Größe der Spitze der Skalpellklinge) in jeder inneren-16 gut der Multi-gut Schale.
- Legen Sie die Multi-gut Gericht im Brutkasten auf folgenden Bedingungen gehalten: 37 ° C, 21 % O2und 5 % CO2. Überwachen der Brunnen jeden Tag unter einem inversen Mikroskop und 50 µL DF20 hinzufügen, falls notwendig, die Zellen vor dem Austrocknen zu verhindern.
Hinweis: Nach ca. 10 d werden genügend Zellen gewachsen aus Explant ermöglicht die stammzellisolation. Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Explants wenn ein Lichthof der Zellen um den Muskel zu sehen ist, verwerfen die modellabhängigen von Muskelgewebe. Lösen Sie die Zellen mit 150 µL einer EDTA-haltigen Trypsin-Lösung in jede Vertiefung: entsorgen Sie das Kulturmedium, spülen Sie die Zellen mit 1 mL PBS verwerfen der PBS und ergänzen die Trypsin-Projektmappe für maximal 10 min bei 37 ° C. Fügen Sie Kulturmedium hält die Handlung von die Trypsin, ernten die Zellsuspension und anschließend Zentrifugieren der Zellsuspension bei 200 X g für 10 min bei 37 ° C. Überstand verwerfen und das Pellet in einer ausgeglichenen Salzlösung auszusetzen.
- Übertragen Sie die Zellsuspension auf einer diskontinuierlichen Dichtegradienten aus 3 Schichten (15 %, 25 % und 35 %). Zentrifugieren Sie das Rohr mit der Zellsuspension und die unterbrochene Dichte Gradienten Lösung bei 1.250 X g für 20 min bei 25 ° C. Verwenden Sie nicht die Bremse der Zentrifuge. Beobachten Sie die Zelle Fraktionen mit unterschiedlichen dichten, die zwischen den verschiedenen Schichten der diskontinuierlichen Dichte Gradienten Lösung nach der Zentrifugation erscheinen werden.
- Weiterhin die Kultur mit dem Bruch zwischen 15 und 25 %. Übertragen Sie es auf ein Rohr und waschen Sie ihn mit der ausgeglichenen Salzlösung. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 200 X g für 10 min bei 37 ° C. Verwerfen Sie den überstand. Fahren Sie mit der Aussetzung der Pellet in 1 mL DF20. Einen Zelle-Kultur-Kolben, mit einer Fläche von 25 cm2, mit 6 mL DF20 Vorausfüllen. Die Zellen in den vorgefüllten Zelle Kultur Kolben übertragen und Kultur sie im Brutkasten mit den folgenden Bedingungen: 37° C, 21 % O2und 5 % CO2.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Überwachen Sie die Zellen jeden Tag unter einem inversen Mikroskop. Das Kulturmedium zu ändern, wenn nötig (das alte Medium zu verwerfen und 6 mL neues Nährmedium). Bestimmen Sie die zellulären Zusammenfluss durch die Beobachtung der Zellschichten in der Kultur-Gerichte mit einem optischen Mikroskop bei einer vordefinierten Vergrößerung. Schätzen Sie die Oberfläche der Schale, die von den Zellen belegt ist. Arbeitest du für einen festen mikroskopischer Vergrößerung für jede Beobachtung an der Einmündung bewerten zu können. Wenn die Zellen 85 % der Oberfläche der Schale besetzen, fahren Sie fort mit einer Passage der Zellen.
- Wenn die Zellen konfluierende sind, lösen sie mit einer EDTA-haltigen Trypsin-Lösung mit dem gleichen Protokoll wie unter Punkt 2.4 beschrieben. Anschließend Zentrifugieren der Zellsuspension bei 200 X g für 10 min bei 37 ° C. Verwerfen Sie den überstand und fahren Sie mit der Wiederfreisetzung der Zellen in 5 mL DF20. Legen Sie sie in eine Zelle Kultur Flasche 175 cm2 mit 25 mL DF20 vorausgefüllt. Legen Sie die Flasche in einem Inkubator mit den folgenden Bedingungen: 37° C, 21 % O2und 5 % CO2.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Überwachen Sie die Zellen jeden Tag unter einem inversen Mikroskop. Ändern Sie ggf. das Medium (das alte Medium zu verwerfen und 30 mL neues Medium). Wenn die Zellen konfluierende sind, trennen sie mit Trypsin-EDTA, wie unter Punkt 2.4 beschrieben. Anschließend Zentrifugieren der Zellsuspension bei 200 X g für 10 min bei 37 ° C. Den überstand verwerfen und die Zellen in 6 mL DF20 aussetzen. Platz 1 mL Zellsuspension in sechs 175 cm2 Fläschchen, jeweils mit 25 mL DF20 vorausgefüllt und Kultur sie bei 37 ° C in einem CO-2 -Inkubator (mit 21 % O2 und 5 % CO2).
- Überwachen Sie die Zellen jeden Tag unter einem inversen Mikroskop. Ändern Sie ggf. das Medium (das alte Medium zu verwerfen und 30 mL neues Medium in jedem Kolben). Wenn die Zellen konfluierende sind, trennen sie mit Trypsin-EDTA, wie in Schritt 2.5 beschrieben. Zentrifugieren sie 3 X 200 X g für 10 min bei 37 ° C und entsorgen der Überstand bei jedem Schritt.
- Zählen Sie die Zellen mit Hilfe einer Bürker Kammer und einem Lichtmikroskop zu zählen. Bereiten Sie eine Zellsuspension 10 Millionen Zellen/mL eines bestimmten Kryokonservierung Mediums.
- Tiefkühl-therapeutischen Dosen von 1 x 107 Zellen in 1 mL der Kryokonservierung Medium und in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff bis zu ihrer Verwendung aufbewahren.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Versenden Sie die Zellen in der Durchstechflasche auf Trockeneis für den letzten Einsatz.
3. Injektion von Zellen
Hinweis: Zwei Menschen sind erforderlich, um die Injektion von Stammzellen durchzuführen.
- Erwärmen Sie die Zellsuspension schrittweise auf Raumtemperatur. Aspirieren Sie die Suspension in eine 2 mL Spritze.
- Beruhigen Sie das Pferd durch Einspritzen von Detomidine 10 µg/kg in die Halsschlagader mit einer Injektionsnadel 19 G. Warten Sie 5 Minuten, die volle Wirkung der Sedierung, zu sehen, die durch die charakteristischen kopfüber-Position des Pferdes sichtbar wird.
- Eine Zone von 20 x 10 cm2 über der linken Kehlkopf Region des Pferdes mit einer Haarschneidemaschine, Clip, wie in Abbildung 2dargestellt. Wenden Sie dann eine chirurgische Peeling Polyiodide Seife und Alkohol in die abgeschnittene Region.
- Legen Sie ein flexible standard-Videos-Endoskop durch das linke Nasenloch des Pferdes und in Richtung Nasopharynx voraus. Passen Sie die Position des Endoskops, bis eine vollständige Sicht auf Arytenoid Knorpel und der Kehldeckel erreicht ist. Während des Eingriffs halten Sie das Endoskop in dieser Position und drehen Sie den Bildschirm des video-Endoskop gegenüber den Betreibern.
- Schließen Sie die Stimulation/Injektionsnadel an der Nervenstimulator negative Elektrode. Aufrechterhaltung der Sterilität der Nadel. Verbinden Sie die positive Elektrode von der Nervenstimulator mit einer Elektrode-Patch, die zum Bereich der abgeschnittene Haut steckt.
- Schließen Sie die Spritze mit der Zellsuspension auf der Einspritzleitung und Vorausfüllen Sie das Rohr um die Luft des Systems zu jagen. Denken Sie daran, die Lautstärke des Systems und bereiten Sie eine Spritze mit dem gleichen Volumen von steriler Kochsalzlösung.
- Wenn nicht vertraut sind mit dieser Technik, verwenden Sie einen desinfizierten 5 bis 7 MHz linear Ultraschall-Wandler, um die anatomischen Strukturen in der Region von Interesse zu visualisieren. Verwenden Sie eine sterile Ultraschall Gel Kupplung, um die Bildqualität zu erhöhen. Visualisieren Sie den Kehlkopf und die Schiffe, die in der dorsalen Region des Kehlkopfes führen.
- Einmal mit der Anatomie der Region vertraut, einführen der Stimulation/Injektionsnadel in Richtung der dorsolateralen Aspekt des Kehlkopfes. Bei der Annäherung an den dorsolateralen Aspekt des Kehlkopfes, beginnen die Nervenstimulator in der 1 Hz stimulationsmodus mit einem Strom von 2 mA.
- Sanft bewegen die Nadel in Richtung der Position des wiederkehrenden laryngeal Nerven unter Beachtung der endoskopischen Sicht auf dem Bildschirm. Sobald die Entführung Bewegung des linken Arytenoid Knorpel auf dem Bildschirm sichtbar ist, reduziert den Strom, bis die Bewegung verschwindet, während die Nadel im Ort zu halten.
- Die ideale Position der Nadel zu identifizieren. Betrachten Sie einen Verlust von motorische Reaktion bei 0,5 mA als der ideale Abstand vom Nerv. Wenn Arytenoid Knorpel Bewegungen bestehen bei strömen niedriger als 0,4 mA, nicht injizieren die Zellen so, dass eine intraneuronal Injektion führen kann.
- Wenn der Verlust der motorische Reaktion bei 0,5 mA beobachtet wird, die Zellsuspension mit 107 autologe Stammzellen zu injizieren und Spülen der Einspritzleitung mit Salzlösung vorbereitet Schritt in 3.6. Dies wird den Rest der Zellsuspension injizieren, die in der Injektion Röhre blieb.
- Nehmen Sie nach der Injektion der Zellen die Nadel und das Endoskop.
- Lassen Sie das Pferd aus der Sedierung zu erholen. Für die Biopsie-Website ist keine weitere Behandlung erforderlich.
Representative Results
Die Kommission für die ethische Nutzung von Tieren von der Universität Lüttich genehmigt das Studienprotokoll. Sechs Pferde aus der Herde von Pferden Forschung am Mont-le-Soie Equine Research Centre wurden in diese Studie eingeschlossen. In das erste Pferd war der wiederkehrende laryngeal Nerv durch Elektrostimulation lokalisiert. Abbildung 2 zeigt die Einstellung mit der Stimulation Nadel in der linken dorsolateralen Aspekt des Kehlkopfes des Pferdes in der Nervenstimulator verwendet. Wenn der Verlust der Bewegung von Arytenoid Knorpel beobachtet wird, bei 0,5 mA, 1 mL 2 % Lidocain injiziert. Dies führte zu einer Abwesenheit von Bewegung bei höheren strömen und eine vorübergehende Lähmung des linken Arytenoid. Der Kontrolle Endoskopie, 24 h später, zeigte eine vollständige Wiederherstellung der Arytenoid Funktion. Das vollständige Protokoll wurde in fünf Pferde erfolgreich wiederholt. Keines der Pferde zeigte eine negative Reaktion auf die Muskel-Microbiopsy. Alle Pferde wurden eine ausreichende Anzahl von Zellen in der eingestellten Zeit angebaut. Die Endoskopie der oberen Atemwege wurde in alle fünf Pferde und der laryngeal Funktion Resultate von I oder II. 1 nach Robinson Et Al. durchgeführt. 14 wurden ermittelt. Alle Pferde vertragen die Nervenstimulation der wiederkehrenden laryngeal Nerv sehr gut. Keine Nebenwirkung beobachtet während oder nach der Stimulation oder die Injektion von Stammzellen.
Alle Endoskopien wurden aufgezeichnet und von zwei verblindeten Kliniker erzielt. Gab es keinen Unterschied zwischen der Voreinspritzung Partituren der Kehlkopf-Funktionen und die am Tag 1, 7 und 28 nach der Injektion von Stammzellen wird die Note von Wilcoxon Rang Analyse15getestet. Tabelle 1 fasst die Kehlkopf Noten aller Pferde an verschiedenen Zeitpunkten sowie die Zeit zwischen das Einsetzen der Nadel und die Injektion von Stammzellen und der Strom, der die Arytenoid Bewegung provoziert wenn die Zellen wo injiziert.
Die Zellen, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden waren bereit ein Protokoll vorher veröffentlicht7. Die Zellen von allen Fraktionen konnten Trilineage Differenzierung, CD90 und CD44 zum Ausdruck gebracht, nicht Ausdruck CD45 und MHC-II und klonogenen Kapazitäten hatte. Die Zellen des Bruches 15 – 25 % wurden ausgewählt, für die Weiterverarbeitung, weil sie die größte Ausdruck der CD90 und die größte proliferative Kapazität zeigte.
Ziel der vorliegenden Studie war es nicht zu testen, die Effizienz der Stammzell-Anwendung, einen Geschädigten peripheren Nerv zu regenerieren, sondern nur die Durchführbarkeit des Verfahrens und zur Beurteilung der Sicherheit der Stammzell-Injektion zu den wiederkehrenden laryngeal Nerv in eine kleine l-Anzahl der gesunde Pferde. Keine funktionalen Änderungen auf die endoskopische Bildgebung in den fünf Pferde bis zu 28 Tage nach der Injektion und die Abwesenheit von klinischen Anzeichen in vier der fünf Pferde bis zu 1 Jahr nach die Injektion die Machbarkeit und die Sicherheit des Verfahrens bestätigt. Ein Pferd musste in der Folgezeit aus Gründen, die in keinem Zusammenhang mit der Studie eingeschläfert werden. Obwohl die Techniken erweisen sich sicher in eine kleine Anzahl von Pferden, ist die Zahl der Pferde sind in der vorliegenden Studie zu gering, um eine Abwesenheit von seltenen Ereignissen zu demonstrieren.
| Gäste vor der Injektion | Zeit zur Injektion (min) | Strom bei Injektion (mA) | Gäste am 1. Tag post-Injektion | Gäste am 7. Tag post-Injektion | Gäste am 28. Tag post-Injektion | |
| Pferd 1 (Traber Stute, 16 Jahre alt) | II. 1 | 12 | 0,5 | Ich | II. 1 | II. 1 |
| Pferd 2 (Traber Stute, 22 Jahre alt) | Ich | 3 | 0,7 | Ich | Ich | Ich |
| Pferd 3 (Traber, Stute, 11 Jahre alt) | II. 1 | 4 | 0,5 | II. 2 | II. 1 | II. 1 |
| Pferd 4 (Traber Stute, 12 Jahre alt) | Ich | 7 | 0,5 | Ich | II. 1 | Ich |
| Pferd 5 (Traber Stute, 10 Jahre alt) | Ich | 3 | 0,7 | II. 1 | Ich |
Tabelle 1: Signalement und Larynx funktionieren Resultate von den Pferden. Diese Tabelle zeigt die Uhrzeit der Injektion, die niedrigsten aktuelle provozieren Arytenoid Bewegung vor der Injektion und der Kehlkopf Resultate von fünf gesunde Pferde vor und am Tag 1, 7 und 28 nach der Injektion von autologen Muskel mesenchymalen Stammzellen in die Nähe zu den linken Kehlkopf wiederkehrende Nerv. Pferd #5 war nicht am 28. Tag nach der Injektion Gründen in keinem Zusammenhang mit dieser Studie für die Kontrolle zur Verfügung. Die Werte beziehen sich auf die Resultate von Robinson Et Al. beschrieben 14. hier Punkten ich bedeutet, dass die Bewegungen der beiden Arytenoid Knorpel synchron und symmetrisch wurden, und eine komplette Entführung der beiden Arytenoid Knorpel erhalten und gewartet werden konnte. Partitur II. 1 bedeutet, dass die Bewegungen der Arytenoid Knorpel asynchrone wurden oder asymmetrische zu bestimmten Zeiten; Allerdings könnte eine komplette Entführung der beiden Arytenoid Knorpel erhalten und gepflegt werden.
Abbildung 2 : Einstellung während der Injektion von Stammzellen. Die Nerv-Stimulation-Nadel auf der linken Seite des Kehlkopfes eingeführt und in Richtung der linken wiederkehrende laryngeal Nerv. Der Nervenstimulator befindet sich bei 0,8 mA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die erfolgreiche Anwendung von Muskel-autologe Stammzellen, die wiederkehrende Kehlkopfnerven bei Pferden mit einem Nerv Stimulator-geführte Ansatz. Die Ernte der Muskel Microbiopsy Probe, sowie die Isolierung, die Kultur und die Charakterisierung der Stammzellen, haben vor, detailliert beschrieben worden, während die Injektion dieser Zellen in der Nähe einen peripheren Nerv ist ein original. Die Electro-Lokalisierung des Nervs mit einem elektrischen Nervenstimulator diente für die vorliegende Studie und diente der mesenchymalen Stammzellen in unmittelbarer Nähe zu den wiederkehrenden laryngeal Nerv zu injizieren. Die Reaktion wurde durch video-Endoskopie durch Nasopharynx überwacht. Wenn bei der Positionierung der Nadel, andere Nerven angeregt wurden, war die entsprechende Bewegung auf die Endoskopie-Bildschirm sichtbar. Eine erfolgreiche Stimulation des Nervus wiederkehrende Kehlkopf war geprägt von der typischen Entführung von Arytenoid Knorpel. In ein Pferd war Lokalanästhetikum eingespritzt, um eine vorübergehende Lähmung des Arytenoid Muskels zu induzieren. Obwohl die erfolgreiche Implantation der Zellen in der Nähe des Nervs nicht speziell in der vorliegenden Studie getestet wurde, erwies sich die Elektro-Lokalisierung von den Nerv und die Injektion mit einem geringen Strom, dass die Stammzellen in der Nähe der Nerven angewendet wurden. Die Nähe der Injectate des Nervs, zeigte weiter eine erfolgreiche Motorblock induziert durch eine Injektion eines lokalen Betäubungsmittels.
In den verbleibenden fünf Pferden waren die Zeit von der ersten Anregung bis die erfolgreiche Stammzell-Injektion von 3 bis 12 min. variiert Pferde leicht während des Eingriffs sediert, deren Einhaltung die elektrische Stimulation erhöht. Keines der Pferde zeigte Nebenwirkungen zu jeder Zeit kann darauf hinweist, dass die Dauer der Stimulation bei Bedarf zu guten Nadelpositionierung verlängert werden. Eine steile Lernkurve soll beobachtet werden, wenn der Bediener diese Technik regelmäßig und in einer größeren Zahl von Pferden mit unterschiedlichen Anatomie verwendet.
Pferde häufig leiden RLN, die sich durch unterschiedliche Grade der Lähmung des linken Arytenoid Knorpel führt zu abnormalen Lungenauskultation auszeichnet und Übung Intoleranz. Eine Histologie der betroffenen Nerven zeigt typische Läsionen des peripheren Neuropathie16. Peripherer Neuropathie ist eine Bezeichnung für verschiedene Arten von peripheren Nervenläsionen beeinträchtigte Empfindungen, Bewegungen oder Organfunktionen führt. Die Ursachen sind sehr variabel und können Diabetes, Nährstoffmangel, eine Behandlung mit bestimmten Medikamenten, einer traumatischen Verletzung, Ischämie oder einer Infektion, oder sie können idiopathische sein. Unabhängig von der Ursache, periphere Neuropathien teilen gemeinsame histopathologische Anzeichen, wie Wallersche Degeneration, distale Axonopathy oder segmentale Demyelinisierung. Es hat sich gezeigt, dass die Verwaltung von mesenchymalen Stammzellen Geschädigten peripheren Nerven von Vorteil für ihre Regeneration; die zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch nicht gut verstanden. Traditionell, glauben wir, dass die Stammväter von Fettgewebe, Muskeln, Knorpel und Knochengewebe wird nur mesenchymaler Stammzellen differenzieren, aber unter bestimmten Bedingungen haben sie gezeigt, dass in Myozyten17, Astrozyten18 zu differenzieren , und Myelinating Zellen der peripheren19 und zentralen Nervensystems19. Während einer in-vitro- Kultur wird eine Exposition gegenüber Neuropeptide die Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen in Zellen, die mit dem Ausdruck neuronalen Marker21,22begünstigen. Mehrere in Vivo Studien belegen die positive Wirkung von mesenchymalen Stammzellen auf Nervenregeneration und eine funktionelle Erholung in Ratte-Modellen der Ischias-Nerv Verletzung10,23. Dies wird wahrscheinlich durch günstige Umgebungsbedingungen verursacht, die die Differenzierung von Stammzellen in gewebespezifische Zellen24beitragen. Zukünftige Studien sollten auch diese Technik für die Verwaltung der bereits differenzierten Zellen in RLN betroffenen Pferde untersuchen.
Nach bestem Wissen und gewissen ist dies der erste Bericht, der beschreibt die Verwendung von ein Nervenstimulator, einen peripheren Nerv zu lokalisieren, um eine gezielte Behandlung hinein zu injizieren. Andere periphere Nerven Krankheiten in verschiedenen Arten, wie neuropathische Schmerzen können durch die Gabe von Stammzellen in der Nähe der Nerven25,26behandelt werden. Zukünftige Studien sollten testen, welche Auswirkungen dieser Technik in klinischen Patienten und das Risiko der Migration und das Potenzial der Differenzierung der injizierten Zellen zu untersuchen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Studie wurde vom Mont-le-Soie Equine Research Centre finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Detomidine (Domidine) | Dechra | sold through pharmacy | |
| Lidocaine (Xylocaine) | Movianto | sold through pharmacy | |
| TOF Watch S (Nerve stimulator) | Alsevia | 79950161 | |
| TSK Starcut (Biopsy needle) | STSK laboratory | SAG - 14090C | |
| Electrostimulation needle | Pajunk | 001185-79 | |
| DMEM - F12 (culture medium) | Lonza | LO BE12-719F | |
| Heat inactivated FBS | Life technologies | 10500 | |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
| Phospate buffered saline | Lonza | LO BE17-512F | |
| 24-multiwell dish | Corning | 3524 | |
| Trypsin | Life technologies | 12604 | |
| HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
| NaCl | Sigma | S8776 | |
| T-25 cm² flasks | Nunclon | 136196 | |
| T-175 cm² flasks | Nunclon | 178883 | |
| Cryostore CS5 | Biolife solutions | 205373 |
References
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