Functionele evaluatie van olfactorische trajecten in levende Xenopus kikkervisjes
Summary
Xenopus kikkervisjes bieden een uniek platform voor het onderzoek naar de functie van het zenuwstelsel in vivo. We beschrijven methodologieën voor evaluatie van de verwerking van olfactorische informatie in levende Xenopus larven bij fokken normaal of na blessure.
Abstract
Xenopus kikkervisjes bieden een uniek platform voor het onderzoek naar de functie van het zenuwstelsel. Zij bieden meerdere experimentele voordelen, zoals toegankelijkheid van talrijke imaging benaderingen, elektrofysiologische technieken en gedrags testen. Het Xenopus tadpole olfactorische systeem is bijzonder goed geschikt voor onderzoeken van de functie van synapsen gevestigd tijdens normale ontwikkeling of hervormd na blessure. Hier beschrijven we methodologieën voor evaluatie van de verwerking van olfactorische informatie in levende Xenopus larven. We schetsen een combinatie van in vivo metingen van exocytose calcium reacties in de glomeruli van de bulbus olfactorius met olfactorische geleide gedrag testen. Methoden kunnen worden gecombineerd met het transect van bulbus zenuwen te bestuderen de bedrading van synaptic connectiviteit. Experimenten zijn gepresenteerd met behulp van zowel wild-type en genetisch gemodificeerde dieren uiten GFP verslaggevers in cellen van het centrale zenuwstelsel. Toepassing van de methoden beschreven om genetisch gemodificeerde kikkervisjes kan nuttig zijn voor het ontrafelen van de moleculaire grondslagen die gewervelde gedrag definiëren.
Introduction
Xenopus kikkervisjes vormen een uitstekende diermodel om te bestuderen van de normale functie van het zenuwstelsel. Transparantie, een volledig gesequenceerd genoom1,2, en de toegankelijkheid van chirurgische, elektrofysiologische en imaging technieken zijn unieke eigenschappen van Xenopus larven waarmee onderzoeken neuronale functies in vivo3 . Enkele van de meerdere experimentele mogelijkheden van deze diermodel worden geïllustreerd door de grondige studies uitgevoerd op tadpole sensorische en motorische systemen4,5,6. Een bijzonder geschikt neuronale circuit te bestuderen van vele aspecten van informatie verwerking op het niveau van synapsen is de Xenopus tadpole olfactorische systeem7. In de eerste plaats de synaptische verbinding is goed gedefinieerd: olfactorische receptor neuronen (ORNs) naar de bulbus olfactorius project en synaptische contacten leggen met dendrites van mitralisklep/getuft cellen binnen de glomeruli geur kaarten. Ten tweede, zijn ORNs worden voortdurend gegenereerd door neurogenese gedurende het hele leven te handhaven van de functionaliteit van olfactorische trajecten8. En ten derde omdat de olfactorische systeem een groot regeneratieve vermogen blijkt, Xenopus kikkervisjes kunnen hun bulbus olfactorius na ablatie9volledig te hervormen.
In deze paper beschrijven we benaderingen die beeldvorming van olfactorische glomeruli in levende kikkervisjes met gedrags experimenten combineren te bestuderen van de functionaliteit van olfactorische trajecten. De hier gedetailleerde methoden werden gebruikt om de studie van het functionele herstel van de glomerulaire connectiviteit in de bulbus olfactorius na bulbus zenuw transect10. Gegevens die zijn verkregen in Xenopus kikkervisjes representatief zijn voor gewervelden omdat olfactorische verwerking evolutionaire is bewaard.
De beschreven methoden zijn geïllustreerd met behulp van X. tropicalis , maar ze kunnen eenvoudig worden geïmplementeerd in X. laevis. Ondanks de grotere omvang van de volwassen X. laeviszijn beide soorten opvallend vergelijkbaar tijdens tadpole stadia. De belangrijkste verschillen bevinden zich op het genomisch niveau. X. laevis geeft arme genetische werkwillig, meestal bepaald door haar allotetraploid genoom en de lange generatietijd (ongeveer 1 jaar). Is daarentegen meer vatbaar voor genetische modificaties vanwege de kortere generatietijd (5 tot 8 maanden) en diploïde genoom X. tropicalis . De representatieve experimenten worden geïllustreerd voor wild-type dieren en drie verschillende transgene lijnen: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) en tubb2:GFP (X. laevis).
De methoden die worden beschreven in de lopende werkzaamheden moeten naast de genetische vordert in het veld Xenopus worden beschouwd. De eenvoud en de eenvoudige implementatie van de technieken gepresenteerd maakt ze bijzonder nuttig voor de evaluatie van de reeds beschreven mutanten11, evenals Xenopus regels gegenereerd door CRISPR-Cas9 technologie12. Ook beschrijven we een chirurgische ingreep gewend transect bulbus zenuwen die kunnen worden uitgevoerd in een laboratorium dat die toegang hebben tot Xenopus kikkervisjes. De benaderingen gebruikt voor de evaluatie van de reacties van de presynaptische calcium en olfactorische geleide gedrag vereisen specifieke apparatuur, zij beschikbaar op een matige kosten. Methoden worden gepresenteerd in een eenvoudig formulier ter bevordering van het gebruik ervan in de onderzoeksgroepen en de grondslagen van meer complexe tests kon instellen door het implementeren van verbeteringen of door de associatie met andere technieken, dat wil zeggen, histologische of genetische benaderingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit witboek beschrijft technieken die nuttig zijn voor het onderzoeken van de functionaliteit van olfactorische trajecten in levende Xenopus kikkervisjes. Het huidige protocol is vooral handig voor laboratoria die werken, of toegang hebben tot Xenopus; het is echter ook interessant voor deze onderzoekers bestuderen de cellulaire en moleculaire grondslagen van neuronale regeneratie en reparatie. Resultaten van Xenopus kunnen worden gecombineerd met gegevens die zijn verzameld in andere gewerveld…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) door het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling (EFRO), gefinancierd door concurrentieonderzoek awards van de M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, de Stephen W. Kuffeler Fellowship Fonds, Laura en Arthur Colwin begiftigd zomer Fellowship onderzoeksfonds , de Fischbach Fellowship, en het grote fonds van de generatie van de mariene biologische laboratorium en de nationale Xenopus Resource RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) waar een deel van dit werk werd uitgevoerd. Wij danken ook CERCA programma / Generalitat de Catalunya voor institutionele ondersteuning. A.L. is een fellow van de Serra Húnter.
Materials
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
References
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
- Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
- Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, 2453-2469 (2012).
- Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
- Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).
- Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
- Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
- Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).
- Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1956).
- Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).
- Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
- Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14 (2016).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
- McDiarmid, R., Altig, R. . Tadpoles: The biology of anuran larvae. , 149-169 (1999).
- Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
- Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
- Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).
