Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

تقييم وظيفي لمسارات حاسة الشم في المعيشة النمو الضفادع الصغيرة

doi: 10.3791/58028 Published: December 11, 2018
* These authors contributed equally

Summary

النمو الضفادع الصغيرة توفر منبرا فريداً للتحقيق في وظيفة المجراة في الجهاز العصبي. يمكننا وصف منهجيات لتقييم معالجة المعلومات حاسة الشم في معيشة يرقات النمو في ظروف تربية عادية أو بعد الإصابة.

Abstract

النمو الضفادع الصغيرة توفر محفلاً فريداً للتحقيق في وظيفة النظام العصبي. أنها توفر مزايا تجريبية متعددة، مثل إمكانية الوصول إلى العديد من النهج التصوير والتقنيات الكهربية وفحوصات السلوكية. يعتبر نظام حاسة الشم شرغوف النمو وبشكل خاص يناسب للتحقيق في وظيفة نهايات المنشأة خلال التطور الطبيعي أو إصلاحه بعد الإصابة. هنا، يمكننا وصف منهجيات لتقييم معالجة المعلومات حاسة الشم في معيشة يرقات النمو . أننا مخطط مجموعة من القياسات المجراة في الاستجابات بريسينابتيك الكالسيوم في جلوميرولي لمبة شمي مع فحوصات السلوك الموجهة بحاسة الشم. يمكن الجمع بين الأساليب مع ترانسيكشن للأعصاب شمي لدراسة تجديد أسلاك التوصيل متشابك. وتعرض تجارب استخدام الحيوانات المحورة وراثيا والبرية من نوع التعبير عن الصحفيين بروتينات فلورية خضراء في خلايا الجهاز العصبي المركزي. تطبيق النهج المبين للضفادع الصغيرة المعدلة وراثيا يمكن أن تكون مفيدة لكشف الأسس الجزيئية التي تحدد سلوك الفقاريات.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

النمو الضفادع الصغيرة تشكل نموذجا حيوانية ممتازة لدراسة وظيفة طبيعية للجهاز العصبي. الشفافية والجينوم الكامل التسلسل1،2، وإمكانية الوصول إلى التقنيات الجراحية والكهربية والتصوير من خصائص فريدة اليرقات النمو التي تسمح للتحقيق في وظائف الخلايا العصبية المجراة في3 . بعض الاحتمالات التجريبية متعددة من هذا الطراز الحيوانية موضحة بدراسات دقيقة أجريت على شرغوف النظم الحسية والحركية4،،من56. دارة العصبية خاصة مناسبة تماما لدراسة جوانب كثيرة لتجهيز على مستوى نهايات المعلومات هو نظام حاسة الشم شرغوف النمو 7. أولاً، الاتصال به متشابك يعرف جيدا: مستقبلات الشم الخلايا العصبية (أورنس) مشروع للمبة شمي وإقامة اتصالات متشابك مع dendrites التاجي/معنقدة الخلايا داخل glomeruli لتوليد خرائط رائحة. ثانيا، ما أورنس باستمرار تولدها الخلايا طوال الحياة للحفاظ على الأداء الوظيفي لمسارات حاسة الشم8. وثالثاً، لأن يظهر نظام حاسة الشم قدرة على التجدد عظيم، النمو الضفادع الصغيرة قادرة تماما إصلاح لمبة شمي بهم بعد التذرية9.

في هذه الورقة، ويصف لنا النهج التي تجمع بين التصوير glomeruli حاسة الشم في معيشة الضفادع الصغيرة مع التجارب السلوكية لدراسة الأداء الوظيفي لمسارات حاسة الشم. واستخدمت أساليب مفصلة هنا للدراسة الفنية استعادة الاتصال الكبيبي في لمبة شمي بعد عصب شمي ترانسيكشن10. البيانات التي تم الحصول عليها في النمو الضفادع الصغيرة ممثل الفقاريات نظراً لتجهيز حاسة الشم التطوري المصانة.

تتمثل الأساليب الموصوفة باستخدام X. tropicalis ولكن يمكن تنفيذها بسهولة في العاشر. ليفيس. وعلى الرغم من حجم أكبر من الكبار X. laevis، كلا من الأنواع تتشابه خلال مراحل شرغوف. تكمن الاختلافات الرئيسية الموجودة على مستوى الجينوم. يعرض X. laevis الفقيرة الصوبة الوراثية، تحدد معظمها بالجينوم اللوتيترابلويد وجيل طويل الوقت (حوالي 1 سنة). وفي المقابل، عاشرا- تروبيكاليس أكثر قابلية للتعديلات الوراثية نظراً للوقت جيل أقصر (5-8 أشهر) والجينوم مثنوية. يتم توضيح التجارب التمثيلية للحيوانات البرية من نوع وثلاثة خطوط مختلفة وراثيا: Hb9:GFP (X. tropicalis)، NBT:GFP (X. tropicalis) و tubb2:GFP (X. laevis).

ينبغي النظر في المنهجيات المبينة في العمل الحالي جنبا إلى جنب مع تقدم الوراثية في مجال النمو . بالبساطة وسهولة تنفيذ التقنيات المعروضة يجعلها مفيدة بشكل خاص لتقييم طفرات سبق شرحه11، فضلا عن خطوط النمو المتولدة عن التكنولوجيا كريسبر-Cas912. كما يصف لنا إجراء العمليات جراحية المستخدمة في قطاع شمي الأعصاب التي يمكن أن تنفذ في أي مختبر وبعد الوصول إلى النمو الضفادع الصغيرة. النهج المستخدمة لتقييم استجابات الكالسيوم presynaptic والسلوك الموجهة بحاسة الشم تتطلب معدات محددة، وأن كانت متوفرة بمعتدلة التكلفة. ترد في نموذج بسيط لتشجيع استخدامها في مجموعات البحث منهجيات ويمكن أن تضع الأسس لفحوصات أكثر تعقيداً بتنفيذ التحسينات أو رابطة للتقنيات الأخرى، أي، نهج نسيجية أو الوراثية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

جميع الإجراءات بموافقة لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية في جامعة برشلونة.

ملاحظة: وتربى الضفادع الصغيرة X. tropicalis و X. laevis وفقا للطرق القياسية13،14. تعد المياه شرغوف إضافة الأملاح التجارية (انظر الجدول للمواد) للمياه التي تم الحصول عليها عن طريق التناضح العكسي. يتم ضبط الموصلية المايكروثانيه ∼700 و ∼1، المايكروثانيه 400 للضفادع الصغيرة X. tropicalis و X. laevis ، على التوالي. ويمكن الحصول على اليرقات أما عن طريق التزاوج الطبيعي أو الإخصاب في الأنابيب14. يتم ديجيليد الأجنة مع 2% لسيستين أعدت في قارعو الأجراس تعديل (MMR 0.1 x مارك). س 1 يحتوي على معدل وفيات الأمهات (في مم): 100 كلوريد الصوديوم، 2 بوكل، 1 MgSO4، 2 كاكل2، هيبيس 5، 0.1 يدتا، الأس الهيدروجيني 7.8. يتم نقل اليرقات بعد 2-3 أيام (مرحلة 25) إلى خزانات ل 2 مع المياه شرغوف. عندما تصل الضفادع الصغيرة إلى مرحلة 40 من المعايير نيووكوب--فابر (NF)15، أنها وضعت في خزانات ل 5 والإبقاء على كثافة 10 الحيوانات/L. درجة الحرارة تظل ثابتة في 23 – 25 درجة مئوية و 18-20 درجة مئوية ل X. tropicalis و X. laevis الضفادع الصغيرة، على التوالي. وتستخدم الحيوانات وجدت في مراحل 48-52 من معايير NF للتجارب.

1-ترانسيكشن للأعصاب شمي

  1. تعد حلاً أنيسثيتيزينج 0.02 في المائة MS-222 في 50 مل ماء شرغوف في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد خزان صغير (1-2 لتر) مع شرغوف المياه للسماح الاسترداد للحيوانات بعد الجراحة.
  3. قص قطعة مستطيلة من السليولوز ورق الترشيح النوعي (4 سم × 3 سم، انظر الجدول للمواد).
  4. ويت 2 قطعة من ورق الترشيح النوعي السليلوز في حل مرض التصلب العصبي المتعدد-222 0.02 في المائة، ووضعها تحت نطاق تشريح.
  5. اختيار شرغوف من الدبابة وتزج أنه في حل أنيسثيتيزينج. الحيوان توقف عن السباحة داخل دقيقة 2-4 ولا تستجيب للمنبهات الميكانيكية المطبقة على مستوى ذيل باستخدام الملقط.
  6. ضع شرغوف أنيسثيتيزيد على قطعة مستطيلة من ورق الترشيح. ضع الحيوان بجانبها الظهرية التي تواجه التصاعدي، حيث يمكن تصور هياكل الدماغ.
    1. باستخدام مقص فانس (انظر الجدول للمواد) قطع الأعصاب شمي أحدهما أو كليهما (اعتماداً على نوع الفحص القيام). قطاع عصب واحد للتجارب التي تتطلب رقابة داخلية لإصابة العصب.
    2. للتجارب السلوكية، قطاع الأعصاب على حد سواء من أجل قمع جميع المعلومات الرائحة قادمة إلى لمبة شمي. يمكن بسهولة ملاحظة كفاءة تقطيع الأعصاب شمي تحت نطاق تشريح؛ ومع ذلك، يمكن الحد موقف تصبغ أو الحيوان عوامل.
      ملاحظة: (اختياري) أن أفضل طريقة للتحقق من صحة الإجراء هو استخدام الضفادع الصغيرة المعدلة وراثيا التي تعبر عن الصحفيين الفلورسنت على الجهاز العصبي (انظر نتائج تمثيلية). لتحقيق هذا الهدف، من الضروري استخدام نطاق تشريح مجهزة بالأسفار (الشكل 1). إلا إذا كان الحيوانات البرية من نوع متوفرة، يمكن استخدام التتبع مع دي سم. اتبع البروتوكول 2 (انظر أدناه) لحقن حلاً 0.5 ملغ/مل من سم-دي أعدت في السكروز 0.3 متر في الكبسولة الآنف. انظر 16 للحصول على تفاصيل حول إعداد وتخزين دي سم. يجب تقليل تسرب صبغة خارج تجويف الرئيسية. لتحقيق هذا الهدف، من الضروري تعديل ضغط الحقن وفتح ميكروبيبيتيس. الأسفار على مستوى الطبقة الكبيبي اللمبة شمي يصبح واضح 24 ساعة بعد تطبيق دي سم. يستخدم هذا العمل وضع العلامات مع دي سم فقط للتصديق على إجراءات ترانسيكشن؛ ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب للحصول على معلومات المورفولوجية لحاسة الشم جلوميرولي باستخدام الإجراءات التقليدية النسيجي.
  7. نقل الحيوانات إلى خزان الانتعاش. يجب استعادة الضفادع الصغيرة السباحة العادية داخل ~ 10 دقيقة القيام بتفتيش دقيق للوجود للنزيف، الذي من المتوقع في ~ 1 في المائة حيوانات تخضع لعملية جراحية.
  8. Euthanize الحيوانات المصابين في التوصل إلى حل مرض التصلب العصبي المتعدد-222 0.2%.

2-وضع العلامات للخلايا العصبية مستقبلات الشم مع مؤشرات الكالسيوم الفلورية

  1. تحضير محلول يحتوي على 12% الكالسيوم الخضراء-1-ديكستران (انظر الجدول للمواد)، 0.1% Triton X-100، و 1 مم كلوريد الصوديوم17. تخزين الحل في-20 درجة مئوية أو في-80 درجة مئوية إذا كان ليس لاستخدامها في غضون شهر.
  2. إعداد الماصات الزجاجية مع تلميح الفتحات ~ 1 – 2 ميكرومتر (قطره مماثلة إلى ميكروليكتروديس التي تستخدم لإجراء التجارب على التصحيح-المشبك) microinjection استخدام ساحبة ميكروبيبيتي (انظر الجدول للمواد).
  3. معايرة حجم ميكروينجيكشنز. استخدام الماء المقطر، ضبط وقت الضغط والحقن من أجل الحصول على حقن كميات من 0.15-0.3 ميليلتر.
    ملاحظة: إجراء بسيط يتمثل في عد عدد النبضات اللازمة لإفراغ ماصة مليئة 1 ميليلتر من الماء. معلمات النموذجية ضغط الوقت حقن هذه المبادرة 30 و 50 مللي ثانية.
  4. مكان ماصة في ميكروينجيكتور وتحميله مع ~ 2 ميليلتر من الكالسيوم ديكستران أخضر-1 الحل.
  5. إعداد شرغوف اتباع الخطوات 1، 1، 1 إلى 6.
  6. نقل تلميح الماصة في تجويف الرئيسية الكبسولة الآنف.
    ملاحظة: انظر الشكل 2أ تصف موقع مسارات حاسة الشم في شرغوف النمو.
  7. باستخدام الإعدادات التي تم الحصول عليها في 2.3، تسليم اثنين من نفث. تقييد الوجود صبغ الكبسولة الآنف.
  8. واسمحوا شرغوف الراحة لدقيقة 2-3 استخدام ماصة باستور، من أجل قطرات حل مرض التصلب العصبي المتعدد-222 0.02 في المائة على أجزاء أكثر والذيلية للحيوان لتفادي التجفيف.
  9. نقل الحيوانات إلى خزان الانتعاش.
    ملاحظة: ينبغي أن تسترد سباحة عادية داخل ~ 10 دقيقة التلاعب بالحيوانات قد تسبب إصابات.
  10. Euthanize الضفادع الصغيرة التي لا استرداد السلوك الطبيعي السباحة 15 دقيقة بعد الحقن باستخدام حل مرض التصلب العصبي المتعدد-222 0.2%.
  11. مراقبة الأسفار على مستوى الطبقة الكبيبي اللمبة شمي في اليوم التالي للحقن.

3-إعداد الضفادع الصغيرة لتصوير حية من الردود بريسينابتيك

  1. 24 – 48 ح قبل إجراء التجربة، معطف أطباق بيتري 4 – 6 من 35 مم مع سيليكون الاستومر (مثلاً، سيلجارد). مرة واحدة قد بلمرة الاستومر، اختﻻق بئر مستطيلة لاحتوائه شرغوف.
    ملاحظة: الأبعاد النموذجية للضفادع الصغيرة X. tropicalis التي وجدت في مراحل NF 48 – 52، 10 مم × 4 مم.
  2. تحضير 100 مل من مكم 160 1 مم من الأحماض الأمينية الحل بوصفها حافزا الرائحة للضفادع الصغيرة. الحل يمكن أن تحتوي على خليط أحماض الأمينية عدة: الميثيونين ولوسين والحامض الأميني ارجينين يسين. تخفف من الأحماض الأمينية في حل النمو في المسابقة، ويتألف من (في مم): 100 كلوريد الصوديوم، 2 بوكل، كاكل 12، 2 مجكل2، الجلوكوز 10، 10 حبيس، 240 من موسم للكيلوجرام، الأس الهيدروجيني 7.8. ضمان الحفاظ على هذا الرقم الهيدروجيني في 7.8.
  3. ملء خزان ارتفاع مع 20 مل الحل من الأحماض الأمينية. ربط الخزان بالبولي إيثيلين (انظر الجدول للمواد) وضع الأنابيب إلى أنبوب شعري ز 28 أعلاه الكبسولة الآنف.
    ملاحظة: الأنبوبة الشعرية هي التي شنت ميكرومانيبولاتور (انظر الجدول للمواد). فقاعات الهواء يجب أن تكون غائبة عن نظام التروية.
  4. تحقيق الدقة الزمنية في تطبيق الحل من الأحماض الأمينية باستخدام الترانزستور الترانزستور منطق (TTL) مراقبة الملف اللولبي الصمامات قرصه (انظر الجدول للمواد). مشجعا يستخدم لتوليد نبضات TTL (انظر الجدول للمواد). التحقق من الدقة الزمنية لتقديم حل الرائحة عن طريق تغيير مدة TTL البقول، أي., s 0.1 إلى 1.
  5. ملء خزان مرتفع آخر مع 100 مل من محلول النمو في المسابقة.
  6. تخدير شرغوف ووضعه تحت نطاق تشريح (الخطوات 1، 1، 1 إلى 6).
  7. إعداد شرغوف للتصوير. إذا توفرت ألبينو الضفادع الصغيرة للانتقال إلى الخطوة 3، 9، خلاف ذلك إزالة الجلد أعلاه لمبة شمي لأنه يحتوي على الخلايا الصباغية التي تنال من تصوير (الخطوة 3، 8).
    ملاحظة: هناك طريقتان لإجراء هذه التجربة تبعاً لتصبغ الحيوان. فمن الأفضل استخدام ألبينو الحيوانات. سلالات ألبينو متاحة ل X. laevis وخطوط X. tropicalis ألبينو مؤخرا تم إنشاؤها بواسطة كريسبر-Cas9 12 أو18من تالينس.
  8. باستخدام مقص فانس، جعل شق جانبية على الجلد شرغوف على حافة الجهاز العصبي المركزي. ينبغي جعل الخفض في مستوى لمبة شمي ولا يصل ابدأ إلى موقف تيكتوم، الذي يمكن بسهولة تحديد موقع العصب البصري.
  9. قرصه قطع الجلد باستخدام الملقط وتسحبه على الجهاز العصبي. التحقق من إزالة ناجحة بسبب غياب الخلايا الصباغية أعلاه لمبة شمي. إبقاء الحيوان رطبة بسكب قطرات من حل مرض التصلب العصبي المتعدد-222 0.02 في المائة استخدام ماصة باستور.
  10. ضع شرغوف في البئر للطبق المغلفة (انظر الجدول للمواد). وضع ساترة زجاجية مغلفة بارتفاع الشحوم فراغ أعلاه الحيوان. ضع ساترة لتغطية الجزء العلوي من تكتم إلى نهاية الذيل.
  11. ضمان أن تظل لمبة شمي وبلاكوديس يتعرض إلى الوسط خارج الخلية. الحفاظ شرغوف غير متحرك أثناء التصوير. ملء طبق بيتري مع سولوتيونكونتاينينج 100 ميكرومتر tubocurarine النمو في المسابقة (انظر الجدول للمواد) لمنع تقلصات العضلات.
    ملاحظة: يتم تخزين توبوكوراريني في مختبرين في-80 درجة مئوية لم يعد من 6 أشهر.
  12. ضع الطبق عقد شرغوف تحت مجهر رأسي. الاتصال في خزان يحتوي على الحل النمو المسابقة مع الطبق استخدام أنابيب البولي إيثيلين (انظر الجدول للمواد) التروية المستمرة للحل النمو في المسابقة لإبقاء الحيوانات على قيد الحياة > ح 1.
    ملاحظة: ميني المشابك المغناطيسية (انظر الجدول للمواد) مفيدة جداً لتوصيل أنابيب ستابلي إلى الطبق. أنابيب نضح والشفط يجب أن يكون موجوداً في زاوية ~ 180°.
  13. بدء تشغيل بيرفوسينج الحل النمو في المسابقة. الحفاظ على مستوى الحل في صحن ثابت طوال التجربة. استمرار تقييم جدوى شرغوف بمراقبة الدورة الدموية عن طريق السفن.

4-يعيش التصوير Presynaptic Ca2 + التغيرات في حاسة الشم جلوميرولي

ملاحظة: ويرد وصف للفحص المجهري واسع المجال الإجراء التصوير لكن يمكن تكييفه بسهولة مجهر [كنفوكل] عن طريق ضبط الإعدادات اقتناء. ينبغي أن يتم التصوير في مجهر تستقيم شنت على طاولة المضادة اهتزاز.

  1. تصور شرغوف ذات هدف تضخم منخفضة، على سبيل المثال 5 س.
  2. نقل المحاور ميكرومانيبولاتور مكان شعري تقديم حل الرائحة على رأس واحد كبسولة الآنف تشكل زاوية 90 درجة مع عصب شمي. وينبغي تجنب تدفق الرائحة الحل أعلاه لمبة شمي نظراً لأنها قد تسبب تثربولنسس التي تشوه التصوير.
  3. بحث لمبة شمي الموقع إيبسيلاتيرالي للكبسولة الآنف (رهنا بتحفيز) تضخم عالية، منذ فترة طويلة من العمل عن بعد، باستخدام الماء الغمر والهدف: 60Xx، 0.9 N.A.
  4. تحقق من انبعاث الأسفار بالعين. يجب أن تكون هياكل الكبيبي واضحة (الشكل 2ب).
  5. أداء اكتساب العيش مع كاميرا مناسبة لتصوير الكالسيوم. تعريف صندوق يحتوي على لمبة شمي كامل، عادة من 256 × 256 أو 512 × 512 بكسل. تعيين معدل الإطار اقتناء حيازة إلى 20-40 هرتز. ضبط الربح، حيث تكون قيم fluorescence القاعدية ~ 20 ٪ تشبع. الحصول على شريط فيديو s 5.
  6. تصور الفيلم. تحقق من الصورة التركيز، وعدم وجود حركة القطع الأثرية والمناطق التي تحتوي على المشبعة بكسل. ينبغي أن تكون قيم fluorescence نموذجية من مناطق الكبيبي a.u. 5,000 – 20,000 إذا باستخدام كاميرا 16-بت. المضي قدما إلى الخطوة التالية إذا كانت ظروف التصوير الأمثل. كرر الخطوة 4، 6 إذا لزم الأمر لتحسين جودة الصورة أو ضبط إعدادات الربح.
  7. بدء عملية شراء الوقت الفاصل لتسجيل الاستجابات التي أثارت من قبل المحفزات حاسة الشم.
    ملاحظة: ويسيطر التطبيق الدقيق للحل الرائحة المحفزات TTL. تجربة نموذجية تحتوي على فترة خط أساس 4 s، تليها تحفيز مرات تتراوح من 0.1 إلى 0.5 s وفترة استرداد من 6 – 10 s.
  8. إجراء التحفيز المتكررة من أودورانتس لفترات زمنية > تعيين الحد الأدنى 2 معدل التدفق إلى 1 – 1.5 mL·min-1. منذ نضح العالمية في خلال جميع التجارب، هي جرفت الأحماض الأمينية المطبقة محلياً.
    ملاحظة: حجم الحل في الطبق ~ 3 مل.
  9. تحليل الصور
    1. الكشف عن الاستجابات
      1. تصدير الأفلام إلى إيماجيج.
        ملاحظة: والهدف هو الكشف عن وجود مناطق الكبيبي الاستجابة للمحفزات.
      2. تحويل الخام تسلسل الصور الفلورية إلى فيلم0 ΔF/F. قياس التغيرات النسبية في الأسفار القاعدية وفقا للعلاقة التالية: (و-F0) &/F0، حيث يشير و0 إلى مستويات خط الأساس للأسفار.
      3. رسم المناطق ذات الاهتمام (ROI) حول المناطق تظهر زيادات fluorescence المفترضة من خلال التحفيز وتسجيل موقفهم في إدارة العائد على الاستثمار (الشكل 2ه). رسم العائد على الاستثمار للكشف عن مستويات fluorescence الخلفية في منطقة تخلو من هياكل الكبيبي.
    2. التقدير الكمي للاستجابات.
      1. ضع رويس محددة في تسلسل الصور الفلورية الخام. الحصول على قيمة الرمادي يعني رويس المحدد لكل إطار. نقل سلسلة القيم التي تم الحصول عليها إلى برنامج تحليل (على سبيل المثالبرو إيغور).
      2. طرح fluorescence الخلفية، ومن ثم حساب التغييرات0 ΔF/F لكل عائد الاستثمار (الشكل 2 واو). ارسم الزيادات في ΔF/و0 لكل واحد من رويس المحدد. حساب الانحراف المعياري ل القاعدية ΔF/و0 (قبل التحفيز).
        ملاحظة: وتعتبر استجابة إيجابية إذا حصلت زيادات في ΔF/و0 خلال التحفيز أكبر من 2 انحراف معياري للقيم القاعدية.

5-حاسة الشم-انطلاقا من السلوك بالانزيم

ملاحظة: الرسم تخطيطي للإعداد للقيام الفحص يظهر في الشكل 3.

  1. جعل الثقوب الصغيرة لتناسب 1.57 مم x نقلت 1.14 ملم معرف الأنابيب في الجزء العلوي من كل بئر من طبق 6-جيدا. إدراج الأنبوب وختم استخدام لاصق الإيبوكسي (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: طبق المعدل يمكن إعادة استخدام مرات عديدة بعد غسل دقيق مع الماء المقطر.
  2. إعداد 50 مل من محلول الأحماض الأمينية المحتوية على الميثيونين، لوسين، والحامض الأميني، ارجينين ويسين (راجع الخطوة 3، 2 للحصول على التفاصيل). يمكن أن تتراوح التركيزات ميكرومتر 160 1 مم. وضع 20 مل الحل في خزان مرتفعة.
  3. لم آر الضفادع الصغيرة لمالا يقل عن 12 ح قبل المقايسة. تأخذ 6 الضفادع الصغيرة من دبابتهم السكن ووضعها في ل 2 من المياه النظيفة شرغوف للتقليل من التعرض إلى أودورانتس.
  4. ضع الطبق الآبار 6 معدلة على بيضاء LED-ترانسيلوميناتور (الشكل 3).
  5. زوجان مداخل نضح للخزان الذي يحتوي على الأحماض الأمينية الحل باستخدام على (انظر الجدول للمواد). التحقق من نظام التروية والقضاء على فقاعات الهواء. سد الآبار 6 في وقت واحد. ضبط ارتفاع الخزان السماح بتسليم إيه فايف مل من محلول الرائحة داخل ~ 30 ثانية.
    ملاحظة: أغسل جيدا 4 مرات مع الماء المقطر مزدوجة كل بعد التعرض للحل الرائحة.
  6. ملء كل جيدا مع 10 مل مياه شرغوف. 1 مكان شرغوف/حسنا. إجازة للراحة > 3 دقيقة.
  7. إعداد الحصول على الصور. استخدم كاميرا CCD تقليدية التي يمكنك الحصول على الصور في إيه فايف هرتز-توصيل الكاميرا بالكمبيوتر. هنا، استخدم كاميرا زايس MRC5 التي تسيطر عليها البرمجيات زن ولكن يمكن استخدام تكوينات مماثلة أخرى. إذا كان من الضروري زيادة معدل الإطار، تطبيق binning بكسل. وينبغي أن تظهر الصور الطبق كله 6-جيدا.
  8. بدء الحصول على الصور أن تحتوي على أفلام القاعدية (30 ثانية)، التحفيز (25-35 ثانية) وفترات الانتعاش (30-60 ثانية).
  9. عودة الحيوانات من طبق 6 آبار للدبابات بعد التصوير.
  10. تحليل الأفلام في استخدام الإضافات التي توفر معلمات متعددة مرتبطة بحركية مثل ورمترك19،20 إيماجيج.
  11. إعداد الصور للتحليل، حدد أولاً جيدا عن طريق رسم عائد مستطيلة من 35 ملم × 35 ملم (الشكل 4أ). الحصول على صورة خلفية عن طريق حساب الإسقاط الأقصى تسلسل كله. كان يجب عرض صورة للبئر دون شرغوف.
  12. طرح الإسقاط الحد الأقصى من الفيلم الخام. أداء مستوى العتبة على الفيلم 32-بت التي تم إنشاؤها وتطبيق البرنامج المساعد ورمترك. ضبط معلمات ورمترك لتعقب تحركات الحيوانات موثوق بها. نقل الحصول على X, Y تنسق في برنامج تحليل.
  13. س-ص "باستخدام" الإحداثيات، حساب المسافة الإقليدية إلى مصدر الرائحة (مدخل التروية في البئر)، بتطبيق المعادلة التالية:
    Equation 1
    حيث نظام التشغيل إلى موقف مصدر الرائحة وصبي تشير إلى موقف شرغوف في وقت معين. انظر الشكل 4أ لمزيد من التفاصيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في هذه الورقة، نقدم الجمع بين نهجين متكاملين لإجراء الدراسة في فيفو من وظائف النظام حاسة الشم شرغوف النمو : أنا) طريقة للتصوير كاليفورنيا presynaptic2 + والتغيرات في glomeruli للمعيشة الضفادع الصغيرة باستخدام مؤشر الكالسيوم الفلورية، وثانيا) رائحة تسترشد المقايسة السلوكية التي يمكن استخدامها للتحقيق في الرد على أودورانتس التي تنقلها المياه المحددة. حيث استخدمت هذه النهج لتقييم إعادة تجهيز حاسة الشم بعد إصابة10، كما يتم وصف طريقة بسيطة للأعصاب شمي ترانسيكتينج.

ترانسيكتيون مسارات حاسة الشم في النمو الضفادع الصغيرة
هناك طريقتان للتحقق من صحة الإجراء. على حد سواء تعتمد على تصور الأعصاب شمي استخدام الصحفيين الفلورسنت. ويستند أسلوب واحد الضفادع الصغيرة المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية على الجهاز العصبي. هي سطرين الموصى بها التي تعبر عن التجارة والنقل تحت مروج العصبية β-توبولين X. laevis tubb2b-التجارة والنقل و X. tropicalis NBT-التجارة والنقل (الشكل 1، انظر الجدول للمواد). إلا إذا كان الحيوانات البرية من نوع متوفرة، يمكن استخدام دي سم (راجع الخطوة 1.8). ويبين الشكل 1 الصور من الضفادع الصغيرة X. laevis tubb2-التجارة والنقل. الصور من الحيوانات المختلفة الأربعة حيث عصب شمي واحد كان بحف. القص ينبغي أن يكون واضحا في نطاق التشريح. وميزة استخدام خطوط المعدلة وراثيا أن إصلاح عصب شمي يمكن اتباعها على مدى فترة من الزمن. عند القيام بالملاحظات متتابعة، من المستحسن لتقليل التعرض للضوء الفلورية لمنع د. تقطيع من العصبية شمي واحد مفيد عندما يتطلب الأمر، على سبيل المثال، لمقارنة الوحدات المتقدمة عادة مقابل مجدد أسلاك الكبيبي رقابة داخلية. وينبغي تطبيق تقطيع الأعصاب شمي كلا عند الهدف هو قمع تماما نقل المعلومات.

يعيش التصوير presynaptic الاستجابات للمثيرات حاسة الشم
ويمكن ملاحظة التالي الصحيح من أورنس مع الكالسيوم الخضراء-1 ديكستران على صعيد اللمبة شمي (الشكل 2A) باستخدام الفحص المجهري ويديفيلد. Glomeruli واضحة (الشكل 2ب) وينبغي أن تظهر موزعة في طبقات مختلفة بتحريك الطائرة التركيز. مورفولوجية هياكل الكبيبي يمكن أن يكون أفضل حل إذا كان يتم استخدام مجهر [كنفوكل] بدلاً من ذلك (الشكل 2-ج). يعتمد عدد glomeruli المسمى على امتصاص الصبغة على مستوى ظهارة حاسة الشم. ولذلك، لا يسمح هذا الإجراء التصور من جميع الوحدات الكبيبي. وينبغي اختيار الحيوانات عرض تلطيخ fluorescence أكثر كثافة من منطقة الكبيبي قبل إجراء تجارب التصوير، نظراً لأنها تحتوي على أكثر من أورنس المسمى. ينصح بشدة من أجل زيادة الإنتاجية التجريبية هذه المناورة وينبغي أن يقوم ضمن نطاق تشريح مزودة بمصباح الأسفار. رفض الحيوانات التي لا تظهر وحدات الكبيبي مسماة أو التي تظهر الأسفار يقتصر على مناطق معينة من طبقة الكبيبي. ويمكن ملاحظة presynaptic Ca2 + ردود أقرب وقت ممكن بعد تحميل صبغ يوم 1. للقيام بتصوير التجارب من المستحسن استخدام الأهداف للفتحة العددية عالية، وعادة ما ≥0.9.

يمكن أثارت الزيادات في مستويات الكالسيوم presynaptic فضح المقابض الجذعية من أورنس للأحماض الأمينية. من المهم وضع الشعرية تقديم حل الرائحة أعلاه الكبسولة الآنف. وينبغي الحرص على تجنب الاتصال نظراً لأنه يمكن أن تسد غيض من الشعرية و/أو يسبب التحفيز الميكانيكي ل ORNs. عابر زيادات في مستويات الكالسيوم presynaptic يمكن ملاحظتها للمنبهات ≥0.1 s (الشكل 2د) وتدل توصيل حاسة الشم الصحيح. من المهم أيضا لتصور مستويات الكالسيوم القاعدية مع اكتساب الكاميرا منخفضة. محطات بريسينابتيك من أورنس عرض زيادات الفلورية العالية ومن الضروري تجنب إشارة التشبع. ويمكن تحقيق عالية الدقة الزمنية مع ويديفيلد المجهري. على سبيل المثال، باستخدام كاميرا CCD ضرب إلكترون، ممكن لتحقيق معدلات الإطار 50 هرتز أو أعلى. استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] يقلل من الأزمنة ولكن يسمح تعريف أفضل لهياكل الكبيبي.

تقارب عالية من الكالسيوم الخضراء لربط الكالسيوم (190 نانومتر) مفيد بشكل خاص للكشف عن الاستجابات الصغيرة. زيادات الكالسيوم داخل الخلايا عابرة اكتشف في طبقة الكبيبي متغير. بعض المناطق الكبيبي إظهار التغييرات في ≥0.2 و ΔF/0 ، بينما العمليات المجاورة قد لا تستجيب حتى (الشكل 2د). تسهم العوامل التالية في تباين استجابة الوحدات الكبيبي: ط) العدد الإجمالي للمسمى جلوميرولي والثاني) داخل الخلايا تركيز الكالسيوم الخضراء، والثالث) الانتقائية في أورنس للكشف عن الأحماض الأمينية. نظراً لعدد قليل جداً من glomeruli المسمى قد يحول دون مراقبة الردود، من الضروري على الإطلاق القيام بهذه التجارب مع الحيوانات التي تحتوي على العديد من المسمى أورنس قدر الإمكان.

السلوك تسترشد شمي
تحليل البيانات
هو دراسة السلوك تسترشد شمي استخدام نظام المواصفات. ويبين الشكل 3 تخطيطي الرسم من المعدات التي تستخدم للقيام التحليل. الاختبار يستند في قدرة الضفادع الصغيرة الكشف عن وجود الأحماض الأمينية، التي تعمل بمثابة أودورانتس. حل يجمع بين خمسة من الأحماض الأمينية المختلفة (الميثيونين، لوسين، الحامض الأميني، ارجينين ويسين) يستخدم للتحفيز. الحل هو تسليم محلياً خلال 30 ق إلى 35 ملم جيدا يحتوي على شرغوف تخترق. الاستجابة الفورية للضفادع الصغيرة على الحل الوارد زيادة في حركية. وتليها سباحة مباشرة نحو مصدر odorants الحركات العشوائية التي تحدث أثناء ليالي ∼5 – 10 الأولى من تطبيق الحل. تظل لعدة ثوان محيط الفوهة أثناء الولادة أحماض الأمينية الضفادع الصغيرة وتدريجيا استعادة حركية في اتجاهات عشوائية (انظر التكميلية كليب 1، 2).

تسمح الشروط التجريبية ووصف السباحة العادية من مراحل الضفادع الصغيرة X. tropicalis 48-52؛ ومع ذلك، يجب مراعاة أن حركية الحيوانات الكبيرة قد يكون مقيداً في الآبار 35 ملم. وتسجل حركات شرغوف مع كاميرا CCD. ويمكن الكشف عن الجذب للحل الرائحة كالحد من مسافة إقليدية فصل مدخل نضح من موقف شرغوف (الشكل 4). تتبع المواقف شرغوف الرأس داخل منطقة مساحتها 35 ملم × 35 ملم (أو ما يعادل حجم بالبكسل) يتيح الحصول على تحليل الكمي للسلوك الموجهة بحاسة الشم (الشكل 4أ). قطع فردية من حركات شرغوف هي التي شيدت باستخدام إحداثيات س ص التي تم الحصول عليها من تحليل الصور (الشكل 4ب). يجب أن تستنسخ المؤامرات حركية المستخرجة إخلاص صور الفيديو.

هناك طريقتين الممكنة لتفسير التجارب السلوك الموجهة بحاسة الشم. النهج الأول هو الهم في دراسة سابقة لاستخدام زيبرافيشيس21. قياس الوقت الذي تستغرقه محيط فوهة إيصال odorants يثبت وجود انتحاء إيجابي. منطقة الاهتمام بدائرة نصف قطرها ملم 8.75 (المقابلة لربع القطر جيدا) تركز على مدخل الحل يتم استخدامه لتصنيف بقرب الحيوانات إلى مصدر الرائحة (الشكل 4 أ، ج 4). Binning الوقت الذي يقضيه الضفادع الصغيرة محيط الفوهة خلال فترات محددة، أي 15 في فواصل زمنية s، يسمح لتحديد القدرة على اكتشاف حلول حمض أميني (الشكل 4د). يمكن الحصول على السلوك العام لسكان الضفادع الصغيرة برسم توزيع البيانات الفردية (الشكل 5ألف). ويمكن الكشف عن انتحاء إيجابي عند إعداد الحل من الميثيونين ولوسين والحامض الأميني ارجينين يسين أما في 1 مم أو ميكرو 160 (الشكل 5A و 5B). الحيوانات لا تستجيب للمياه التطبيق (الشكل 5ج)، ومن ثم تجاهل مشاركة الآليات ميتشانوسينسيتيفي. اختبار الفروق بين وقت يمكن إنشاء فترات زمنية محددة في كل مجموعة تجريبية استخدام التدابير المتكررة nonparametric ANOVA مع مقارنات متعددة في دن. ومن سيئات binning البيانات في فواصل زمنية من 15 s قرار تخفيض الزمانية.

طريقة لزيادة المعلومات الزمنية الاستجابة السلوكية بجعل متوسط قطع مسافات إقليدية من مصدر الرائحة. على الرغم من أن تظهر حركات شرغوف التغيرات جوهرية، يظهر حركية متوسط عدد من الحيوانات (عادة إيه فور زيرو) السلوك الموجهة بحاسة الشم. للقيام بهذا التحليل الضروري لمجموعة مواقف الحيوان قبل البداية للتحفيز. حيث توجد الضفادع الصغيرة في مواقع مختلفة عند حل الرائحة يدخل في البئر فإنه مطلوب لتعيين مسافة إقليدية إلى 0 قبل التحفيز (الشكل 6A، انظر أيضا معايير الاشتمال في الشكل 7). ولذلك تشير القيم السلبية والإيجابية جاذبية أو النفور من مصدر الرائحة، على التوالي. مصدر جذب للروائح جيدا يصفها نوبة خطي مع ≥0.9 معاملات الانحدار. إذا كان يتم توصيل المياه، يتم توزيع التغييرات الصافية لمسافة إقليدية حولها 0 ومن غير الممكن تناسب خط خلال التحفيز الرائحة، مما يدل على عدم وجود السلوك الموجهة بحاسة الشم (الشكل 6ب). مقارنة بين متوسط قطع مسافات إقليدية لحلول حمض أميني أعدت في 1 مم و 160 ميكرون توحي تأخيرات مختلفة في الاستجابة الموجهة بحاسة الشم (مقارنة الرقم 6 ألف وجيم). الفترة الزمنية المطلوبة لبدء التحرك نحو مصدر أودورانتس أقصر عندما يتم تطبيق الأحماض الأمينية بتركيز أعلى. ولوحظ نقص في حاسة الشم توجيه السلوك في الضفادع الصغيرة مع كلا شمي الأعصاب بحف (الشكل 6د).

حد من التحليل السلوكي وصف الموجهة بحاسة الشم هو إنشاء أعمدة السوائل المعقدة. يمكن أن ينظر إلى هذا إذا استعيض عن الحل من الأحماض الأمينية بصبغة، مثل "حمل الأخضر"، عند إعداد النظام. يقوم بالتحقق من استخدام الحلول الملونة تشكيل أعمدة وتبين أن أودورانتس التي تنقلها المياه تصل إلى أي منطقة من البئر داخل تثربولنسس س. 5 الناجمة عن تقديم الحل يرجح أن يتم الكشف عن طريق الخط الجانبي من الضفادع الصغيرة وربما يسهم لوحظ التباين في حركية الحيوانات ولكن لا تتداخل مع سلوك تسترشد حاسة الشم. مراقبة التجارب التي تقوم بها باستخدام المياه بدلاً من الحلول من الأحماض الأمينية تكشف أن الضفادع الصغيرة قادرة على تميز حاسة الشم من المنبهات الميكانيكية. تقدير للوقت الذي يقضيه في منطقة لمصلحة (الشكل 5) وارسم متوسط المسافات إقليدية (الشكل 6) طريقتان مكملة لوصف استجابة حاسة الشم تسترشد الضفادع الصغيرة.

معايير الاشتمال
يجب أن تؤخذ أيضا معايير الاشتمال في الاعتبار لتحليل البيانات. وتظهر بعض الضفادع الصغيرة حركة رنانة، الذي يتضح من تركيب قطعة المسافات إقليدية إلى دالة جيبية (الشكل 7أ). يجب أن يتم تجاهل الضفادع الصغيرة عرض هذا السلوك من تحليل كافة.

استبعاد الحيوانات التي كحد أقصى في بداية تطبيق الحلول الرائحة (> 30 ملم الشكل 7ب) أو مسافة إقليدية الحد أدنى (< 5 مم، الرقم 7ج) من الفوهة يسمح تخفيض التفاوت قطع متوسط. يوضح المثال المبين في الشكل 7ب انتحاء إيجابي للحل من الأحماض الأمينية. شرغوف يقع على مسافة الحد أقصى من مدخل الحل في البداية للتحفيز. ولذلك، أن هذا الموضع النسبي فقط يمكن أن تكشف عن مصدر جذب لمصدر الرائحة. الشكل 7 ج يبين الوضع المعاكس. هنا، يقع شرغوف القرب من فوهة تقديم الحل من الأحماض الأمينية. تحديد مقدار الوقت الذي يقضيه قرب مصدر رائحة يبين استجابة (الطريقة المستخدمة في الشكل 5)؛ ومع ذلك، فإنه لا يمكن إظهار حركة صافي نحو المدخل.

وباختصار، يعرف التحليل المقترح للسلوك الموجهة بحاسة الشم اختبار ثنائي. يمكن استخدام هذا الأسلوب للكشف عن مجموعة تجريبية من الضفادع الصغيرة قادرة على الرد على أودورانتس. تحسينات إضافية مطلوبة إذا كان الهدف هو إقامة الفروق بين استجابات معقدة الموجهة بحاسة الشم، كما على سبيل المثال، تحديد تفضيلات للروائح الكريهة.

Figure 1
رقم 1: ترانسيكشن للأعصاب شمي. صور الممثل للتجارة والنقل tubb2 X. laevis الضفادع الصغيرة التي تم الحصول عليها بعد ترانسيكشن العصبية شمي واحدة (الأسهم). عرض الأعصاب من الضفادع الصغيرة tubb2-بروتينات فلورية خضراء fluorescence قوية. ترانسيكتيون العصب من الواضح فورا بعد الجراحة (D0). نمو العصب شمي واضح 4 أيام بعد قطع (D4). ثمانية أيام بعد الجراحة (D8) هناك فرق طفيف بين المراقبة والأعصاب بعد إصلاحه. تم تخديره الضفادع الصغيرة في 0.02% مرض التصلب العصبي المتعدد-222 لجمع الصور. شمي لمبة (O.B.)، عصب شمي (كلمة)، كبسولة الآنف (نورث كارولاينا)، وتكتم (Tec)، العصب البصري (Op.N.). تشير الأسهم إلى موقع العصب بحف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تسمية الخلايا العصبية مستقبلات الشم مع ديكستران الكالسيوم الخضراء والتصور لتدفق الكالسيوم presynaptic عند التحفيز مع الأحماض الأمينية. (أ) صورة شرغوف عرض موقع ظهارة حاسة الشم، والأعصاب شمي وطبقة الكبيبي اللمبة شمي الخفيفة المنقولة. (ب) صورة لمبة شمي تصور بالفحص المجهري ويديفيلد (wf). كانت تسمية الخلايا العصبية بتطبيق ديكستران أخضر-1 الكالسيوم في الكبسولة الآنف. الأسفار ولاحظ يناظر المحطات بريسينابتيك من الخلايا العصبية مستقبلات الشم تشكيل glomeruli. O.N: عصب شمي؛ O.B: شمي لمبة. (ج) قسم [كنفوكل] يقع على دورسالي من دخول عصب شمي للمصباح. عنصر presynaptic glomeruli حاسة الشم وصفت استخدام الكالسيوم ديكستران أخضر-1، كما هو الحال في ب). (د) محطات Presynaptic عابر زيادة مستويات الكالسيوم عند التعرض ظهارة حاسة الشم إلى محلول يحتوي على خمسة من الأحماض الأمينية المختلفة. التغيرات النسبية في الكالسيوم الفلورية حصلت قبل وأثناء وبعد 1 s التحفيز. () توزيع 10 مناطق مختلفة من الاهتمام (رويس) تستخدم لقياس التغييرات0 ΔF/F. ROI11 خارج طبقة الكبيبي ويستخدم لتحديد مستويات الخلفية من الأسفار. (و) الفردية ΔF/و0 استجابات رويس المعرفة في ه). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تحليل السلوك تسترشد شمي. (أ) رسم تخطيطي عرض المعدات المستخدمة في الاختبار. (ب) مثال على مسارات حركية تسجل أكثر من 90 ثانية. ويمثل كل دائرة جيدا يتضمن حيوان مفردة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : تتبع السلوك الموجهة بحاسة الشم. (أ) على سبيل المثال عرض بئر تستخدم للتحليل السلوكي. تشير الخطوط المنقطة الزرقاء إلى موقع X, Y إحداثيات (في مم) المستخدمة لتعقب تحركات شرغوف (انظر أيضا التكميلي فيديو 1). القطع الناقص الخضراء يمثل موقف مدخل الحل. خط أسود منقط يشير إلى منطقة الدانية إلى أنبوب إيصال الحل من الأحماض الأمينية (انظر النص للحصول على التفاصيل). (ب) حركية من شرغوف هو موضح في A) أثناء التحليل السلوكي. آثار مرمزة تشير إلى موقف الحيوان قبل (رمادي) وبعد تحفيز حاسة الشم (البنفسجي). الحركات أثناء تطبيق الحل الرائحة موضحة في تدرج لون الزمانية (30 ثانية، الأحمر إلى الأزرق). (ج) X باستخدام، Y شرغوف المواقف فمن الممكن لحساب التغيرات في مسافة إقليدية من الرأس شرغوف إلى مدخل التروية. مسافات أقصر مم 8.75 تتوافق مع مجال الدانية من الفوهة. (د) الأرض من الوقت الذي يقضيه الضفادع الصغيرة في المنطقة التي تعرف بخط منقط في A). كل نقطة يشير إلى فترة 15 ثانية. هو جذب الحيوان بالحل الرائحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : الضفادع الصغيرة تنجذب بالأحماض الأمينية- (أ) الوقت الذي يقضيه بالضفادع الصغيرة قرب مصدر الرائحة. ويتألف كل بن مدة 15 ثانية. قطع مربع يمثل الوسيط (خط أسود أفقي)، 25 إلى 75% quartiles (خانات) ونطاقات البيانات (شعيرات). تقديم حل من الأحماض الأمينية 1 مم جذب الضفادع الصغيرة إلى مصدر الرائحة. كانت تجذبهم الضفادع الصغيرة (ب) حل الرائحة عندما تم خفض تركيز الأحماض الأمينية إلى 160 ميكرومتر. (ج) إيصال المياه لم لا تعديل سلوك الحيوانات. التدابير المتكررة ANOVA مع دن لاختبار المقارنات المتعددة، ف < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : رد الزمانية للضفادع الصغيرة على أودورانتس- (أ) ارسم متوسط مسافة إقليدية إلى مصدر رائحة كدالة للزمن. وكان تعيين مسافة إقليدية إلى 0 قبل التحفيز في كل تتبع فردي. قيم سلبية وإيجابية تشير إلى انخفاض وزيادة المسافة إلى مصدر الرائحة، على التوالي. يمكن وصف الجذب إلى مصدر الرائحة التي تناسب خطي (ص2= 0.98). (ب) توفير المياه لا تعديل المسافة إلى مصدر الرائحة. الضفادع الصغيرة (ج) الاستجابة لتطبيق حل ميكرومترات 160 من الأحماض الأمينية كما كشفت عنها نوبة خطية (ص2= 0.96). (د) الضفادع الصغيرة مع كل الأعصاب شمي بحف لا تستجيب للأحماض الأمينية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 : إدراج معايير لتحليل السلوك الموجهة بحاسة الشم. (أ) بعض الضفادع الصغيرة إظهار مدوية الحركة. وكشف هذا السلوك التي تناسب ناجحة من دالة جيبية للأرض مسافة إقليدية إلى مصدر الرائحة. الضفادع الصغيرة عرض هذا النشاط ينبغي أن تستبعد من الاختبار. (ب، ج) طريقة لتقليل التغير في متوسط الاستجابة الزمنية أودورانتس (الشكل 6) باستثناء الحيوانات التي تقع في أقصى (ب) أو مسافة إقليدية (ج) الحد أدنى في البداية للتحفيز. تشير الخطوط المنقطة الحمراء إلى قيمة العتبة (30 و 5 ملم). مسافة إقليدية قبل بداية التحفيز (السهم، غادر المؤامرات) يتم تعيين إلى "0" لتقرير السلوكيات جذابة أو مثيرة للاشمئزاز سلبية أو إيجابية القيم (مؤامرات اليمين)، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplementary Video 1
التكميلي فيديو 1: السلوك الموجهة بحاسة الشم الناجمة عن تقديم حل الأحماض الأمينية. ويظهر الفيلم شرغوف بحرية السباحة في 35 ملم جيدا. القطع الناقص الأزرق يشير إلى موضع فوهة تقديم حل الرائحة. وترد في بداية ونهاية التحفيز بالنقط الخضراء والحمراء، على التوالي. ويبين الشكل 4 تحليل السلوك ولاحظ. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Supplementary Video 2
التكميلي فيديو 2: شرغوف حركية أثناء الولادة للمياه- ويظهر الفيلم شرغوف بحرية السباحة في 35 ملم جيدا. القطع الناقص الأزرق يشير إلى موضع فوهة إطلاق المياه MQ. وترد في بداية ونهاية لإيصال المياه بالنقط الخضراء والحمراء، على التوالي. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وتصف هذه الورقة التقنيات التي مفيدة للتحقيق في الأداء الوظيفي لمسارات حاسة الشم في المعيشة النمو الضفادع الصغيرة. البروتوكول الحالي مفيد بشكل خاص لتلك المختبرات التي تعمل، أو الوصول إلى النمو؛ ومع ذلك، كما أنها مثيرة للاهتمام لهؤلاء الباحثين دراسة الأسس الجزيئية والخلوية لإصلاح وتجديد الخلايا العصبية. يمكن الجمع بين النتائج التي تم الحصول عليها في النمو مع البيانات التي تم تجميعها في نماذج فقاريات أخرى لتحديد آليات مصانة. الأساليب الموصوفة سوف تستفيد من وضع الكائنات المعدلة وراثيا النمو18،،من2223 وقابلة للتطبيق لنماذج تجريبية من أمراض الجهاز العصبي في الضفادع الصغيرة24، 25.

من أجل الحصول على البيانات الحية في استنساخه، مفتاح تربية الضفادع الصغيرة في النمو بشكل صحيح. على وجه الخصوص، X.tropicalis حساس جداً لظروف السكن السيئة. على سبيل المثال، أنها لا تتسامح مع درجات حرارة أقل من 20 درجة مئوية، وينبغي أن يوضع في خزانات أو شبكات المياه في المجموعة من 24 إلى 28 درجة مئوية. كما أن من المهم عدم زيادة الكثافة الحيوانية أعلاه الحدود المقررة، بانتظام تغذية الضفادع الصغيرة والحفاظ نوعية مياه أمثل13. إدارة المستعمرات الحيوانية الشروط الموحدة التالية مطلوب على الإطلاق للحصول على إمكانية تكرار نتائج التجارب المجراة.

وصف طريقة تصوير الكالسيوم مفيد للكشف توصيل حاسة الشم صحيح من أورنس في الحية. تحميل أورنس مع ديكستران أخضر-1 الكالسيوم يتحقق عن طريق permeabilization عابرة من غشاء البلازما تستخدم تركيز منخفض من X-100 تريتون، كما ذكر سابقا17. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب التحميل هو البساطة، لأنها تتطلب فقط ميكروينجيكتور. عيب هام أن X-100 تريتون يسبب القضاء عابرة على أهداب حاسة الشم وزغيبات. ظهارة حاسة الشم من الزرد إنشائها خلال 48 ساعة بعد العلاج17. قد يكون التجديد في النمو الضفادع الصغيرة حتى أسرع حيث يمكن ملاحظة الردود إلى أودورانتس يوم 1 بعد صبغ تحميل (الشكل 2د). ومع ذلك، تحليلاً مفصلاً مورفولوجية مطلوب لدقة تقدير وقت التجديد ظهارة حاسة الشم بعد العلاج X-100 تريتون.

وسم أورنس مع الكالسيوم الخضراء-1 ديكستران الوحيد الفعال في عدد من الخلايا العصبية، السماح لتصور المحطات presynaptic نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية (الشكل 2 و 2 ج). غياب شبه كامل للخلفية مفيد إذا ما قورنت تحميل لمبة شمي كله مع أشكال إستر صباحا من الأصباغ الكالسيوم. يختلف عدد ORNs نيون من الحيوان للحيوان. وهكذا فإنه من الضروري استخدام حافز حاسة الشم واسع النطاق للعديد من الأحماض الأمينية. نحصل على نتائج ناجحة باستخدام حل من الميثيونين ولوسين والحامض الأميني ارجينين يسين. تركيبات أخرى من الأحماض الأمينية المختلفة يمكن أن تكون فعالة. هو أسلوب بديل لتحميل أورنس مع مؤشرات الكالسيوم انهانسر26، الذي يستخدم على نطاق واسع للتعبير عن الصحفيين الفلورسنت وراثيا مرمزة في الخلايا العصبية شرغوف27. انهانسر يمكن أن يتم استخدام المعدات التجارية أو مصنوعة خصيصا ويسمح التصور الهياكل العصبية مع ممتازة الإشارات إلى الضجيج نسبة28. وعلى نحو مماثل للنهج المبين، السكان الخلية المسمى غير متجانسة وتختلف من الحيوان للحيوان. ترانسجينيسيس أمر مرغوب فيه إذا كان الهدف هو التحقيق في عدد سكان محددة من الخلايا العصبية22. على سبيل المثال، القيادة التعبير عن مؤشرات الكالسيوم المرمزة وراثيا مثل جكامبس في مجموعة محدودة من أورنس، يمكن أن يكون مفيد جداً للتحقيق في رد مجموعة محددة من محطات بريسينابتيك على أودورانتس.

الأسلوب هو موضح استخدام الكالسيوم والأخضر 1 ديكستران تقارير الدالة المحطة الطرفية presynaptic المجراة. ملاحظة زيادات الكالسيوم داخل الخلية يدل توصيل حاسة الشم الصحيح والإفراج عن الغلوتامات على مستوى glomeruli. غير أن التحليل الكمي للتغييرات في الأسفار محدودة. التحفيز للمحطات presynaptic يزيد مستوى الكالسيوم داخل الخلايا في نطاق micromolar وتشبع مؤشر الكالسيوم تقارب عالية مثل الكالسيوم الخضراء يجب أن تؤخذ في الاعتبار. يتم الحصول على النتائج هو موضح في الشكل 2 استخدام الفحص المجهري ويديفيلد. وهذا هو أبسط أسلوب ويمكن تنفيذها في معظم المختبرات. التحسين باستخدام الفحص المجهري اثنين-فوتون أو الصحفيين الفلورسنت المشفرة جينياً يمكن أن تسمح بالحصول على أكثر التقديرات الكمية للدالة presynaptic.

لتصوير حية من الردود الكالسيوم، من الأهمية بمكان أن يوجد تحديد المواقع المناسبة شعري تقديم حل الرائحة. ينبغي أن يقع فوق الكبسولة الآنف ودائما تجنب الاتصال المباشر مع الأنسجة. يجب فحص كل التسليم الصحيح للحل الرائحة وتدفق التروية قبل وضع شرغوف تحت المجهر. يجب فحص جميع الأنابيب المستخدمة التروية لفقاعات الهواء. وقد تدفق التغييرات للحل من الأحماض الأمينية على الاستجابة فورا لفتح المتعاقبة وإغلاق صمام الملف اللولبي. التأخير إرشادية لوجود الهواء. من المستحسن أيضا التحقق من وحدة التخزين الصحيحة يزيد أو يقلل حل تسليمها بعد تغيير وقت الافتتاح، أي من 0.1 s إلى 1 s أو العكس بالعكس. استخدم كثافة ضوء منخفض أثناء إعداد معلمات التجريبية (الخطوة 4، 6) بغية التقليل إلى أدنى حد من فوتوبليتشينج.

وبالرغم من أهمية أولفاكشن في بيولوجيا الضفادع الصغيرة راسخة29، هناك نقص في اختبارات تقييم السلوك الموجهة بحاسة الشم في النمو اليرقات مباشرة. الطريقة الموضحة في هذه الورقة هو اختبار بسيط يسمح الكشف عن استجابة لحافز رائحة في عدد كبير من الحيوانات. وصف مؤخرا لحساسية الرائحة catesbeiana رانا الضفادع الصغيرة لوجود المواد الكيميائية في المياه يوضح آليات معقدة اقتران أولفاكشن للسلوك الحركي30. الفحص المبينة في هذه الورقة يأخذ في الاعتبار تباين الجوهرية للسلوك الموجهة بحاسة الشم في الضفادع الصغيرة. استخدام طبق 6-جيدا بدلاً من بئر واحدة يزيد الإنتاجية التجريبية. العوامل المساهمة في تقلب مثل حركية القاعدية والموضع النسبي إلى مدخل نضح وأعمدة التي تم إنشاؤها بواسطة الحل الرائحة يتم التغلب عليها بالعديد من الضفادع الصغيرة في المتوسط. القياسات المستقلة حوالي 40 المطلوبة لوصف استجابة التحكم جذابة للأحماض الأمينية.

ونحن نقترح نوعين من التحليل لاختبار أولفاكتيون. النهج الأول يحدد الوقت الذي يقضيه قرب مصدر رائحة على مدى فترة زمنية محددة. أنها مناسبة خاصة للتحليل الإحصائي. النهج الثاني يستند على الأرض متوسط المسافات إقليدية من مصدر الرائحة ومفيد لوصف الاستجابة الزمنية ل odorants. كلا النوعين من التحليل يكملان بعضهما البعض والتي تم إنشاؤها بنفس البيانات. التفسير هو ثنائي ويسمح الحيوانات المميزة أن الشعور أودورانتس من تلك التي لا لا10.

كيف يمكن للأساليب المذكورة تكون مفيدة للمجتمع النمو ؟ على الرغم من أن يتم توضيح الأساليب أساسا للحيوانات البرية من نوع، ينبغي مراعاة أن الاحتمالات الوراثية تتزايد بشكل مستمر في مجال النمو . دراسة الردود اورن المجراة في مجتمعة، ووجود السلوك الموجهة بحاسة الشم أيضا يمكن مفيدة للغاية للتحقيق في تجهيز المعلومات حاسة الشم في طفرات النمو تم إنشاؤها أما بواسطة شاشات الجينية إلى الأمام أو عكس الصحيح 11. ويمكن الجمع بين المعلومات المقدمة من تصوير الكالسيوم والتحليل السلوكي. على سبيل المثال، طفرة تؤثر بشكل انتقائي الخلايا الحبيبية اللمبة شمي لا يعدل استجابة presynaptic ORNs لكن ربما يؤثر على السلوك الموجهة بحاسة الشم.

أساليب ربط الاستجابات الخلوية والسلوكي المجراة في ذات الصلة لا سيما لتشريح الوراثية الدوائر العصبية. يمكن أن يساعد تفسير نتائج ذلك يعمل المورفولوجية السابقة، التي قدمت إلى خريطة تشريحية طبقة الكبيبي في الضفادع الصغيرة31. المعلومات التي تم الحصول عليها من شرائح لمبة شمي من النمو الضفادع الصغيرة32 أيضا قيمة للغاية. وكشفت تصوير الكالسيوم التاجي/معنقدة الخلايا في شرائح لمبة شمي الخصائص الأساسية لتجهيز حاسة الشم في النمو من الضفادع الصغيرة، على سبيل المثال حساسية أورنس بالأحماض الأمينية مختلفة33 أو أهمية استجابة الاختفاء في ترميز المعلومات حاسة الشم7. ومع ذلك، تظهر شرائح المخ قدرة محدودة على إنتاج الآليات التكاملية معقدة اقتران الدوائر العصبية المختلفة بسبب تمزيقها إسقاطات عديدة الخلايا العصبية. أيضا، وصفاً لخصائص وحدات الكبيبي الفردية لا يزال بعيد المنال باستثناء γ-الكبيبة34. سيتم الرد على مسألة ما إذا كان تحديد وحدات الكبيبي واحد سلوكيات معينة في الضفادع الصغيرة إلا من خلال الجمع بين الأدوات الجينية و في فيفو النهج التصوير وفحوصات السلوكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من ذ ش وزارة الاقتصاد دي كومبيتيتيفيداد (مينيكو؛ SAF2015-63568-R) كوفونديد بالاوروبية الإقليمية تطوير الصندوق (سيطلب)، بجوائز البحوث التنافسية من الزمالة التذكارية فورتيس ف. غ. م. وصندوق الزمالة جورج ستيفن كوفلر، لورا وآرثر كولون وهبت الصيف البحث صندوق الزمالة ، الزمالة فيشباخ، وصندوق الجيل العظيم من المختبر البيولوجي البحري والوطني النمو الموارد RRID:SCR_013731 (وودز هول، ماجستير) حيث أجرى جزء من هذا العمل. ونشكر أيضا برنامج سيركا/محافظة كاتالونيا للدعم المؤسسي. أ. ل. وزميل Húnter سيرا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) Tecniplast XPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich E10521
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) World Precision Instruments 501985
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) World Precision Instruments 501778
Whatman qualitative filter paper Fisher Scientific WH3030917
X. laevis tubb2-GFP National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFP European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiI ThermoFisher Scientific C-7001
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic ThermoFisher Scientific C-3713
Borosilicate capillaries for microinjection Sutter Instrument B100-75-10 O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.
Puller Sutter Instrument P-97
Microinjector Parker Instruments Picospritzer III
Sylgard-184 Sigma-Aldrich 761028-5EA
Microfil micropipettes World Precision Instruments MF28G-5
Upright microscope Zeiss AxioImager-A1
Master-8 stimulator A.M.P.I.
CCD Camera Hamamatsu Image EM
Solenoid valves Warner Instruments VC-6 Six Channel system
Dow Corning High Vacuum Grease VWR Scientific 636082B
Tubocurarine hydrochloride Sigma-Aldrich T2379
CCD Camera Zeiss MRC-5 Camera Controlled by Zen software
camera lens Thorlabs MVL8ML3 There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used
Epoxy resin RS Components
Manifold Warner Instruments MP-6 perfusion manifold
Micromanipulator for local delivery of solutions Narishige MN-153
Mini magnetic clamps Warner Instruments MAG-7, MAG-6
Polyethylene tubing Warner Instruments 64-0755 O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328, (5978), 633-636 (2010).
  2. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538, (7625), 336-343 (2016).
  3. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395, (6697), 37-44 (1998).
  4. Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69, (2), 273-286 (2011).
  5. Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37, (15), 4032-4045 (2017).
  6. Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
  7. Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67, (5), 872-884 (2010).
  8. Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5, (12), 2175-2186 (1980).
  9. Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48, (1), 15-24 (2006).
  10. Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525, (17), 3769-3783 (2017).
  11. Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2, (6), 91 (2006).
  12. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, (12), 835-843 (2013).
  13. Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
  16. Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317, (1), 174-186 (2008).
  17. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18, (5), 737-752 (1997).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1, (12), 1273-1276 (2012).
  19. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  20. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
  21. Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (24), 9884-9889 (2009).
  22. Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138, (24), 5451-5458 (2011).
  23. Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426, (2), 325-335 (2017).
  24. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6, (5), 1057-1065 (2013).
  25. Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11, (1), 14 (2016).
  26. Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33, (44), 17247-17252 (2013).
  27. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, (3), 583-591 (2001).
  28. Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36, (19), 5279-5288 (2016).
  29. McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
  30. Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
  31. Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489, (4), 403-424 (2005).
  32. Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26, (4), 399-407 (2001).
  33. Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123, (2), 99-107 (2004).
  34. Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35, (20), 7892-7902 (2015).
تقييم وظيفي لمسارات حاسة الشم في المعيشة <em>النمو</em> الضفادع الصغيرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Terni, B., Pacciolla, P., Perelló, M., Llobet, A. Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (142), e58028, doi:10.3791/58028 (2018).More

Terni, B., Pacciolla, P., Perelló, M., Llobet, A. Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (142), e58028, doi:10.3791/58028 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter