Xenopus haletudser tilbyder en unik platform for at undersøge funktionen af nervesystemet in vivo. Vi beskriver metoder til at vurdere behandling af olfaktoriske oplysninger i levende Xenopus larver paa normale opdræt eller efter skade.
Xenopus haletudser tilbyder en unik platform for at undersøge funktionen af nervesystemet. De giver flere eksperimentelle fordele, såsom adgang til talrige imaging tilgange, elektrofysiologiske teknikker og adfærdsmæssige assays. Xenopus haletudse olfaktoriske system er særlig velegnet til at undersøge funktionen af synapser etableret under normale udvikling eller reformeret efter skade. Her, vi beskriver metoder til at vurdere behandling af olfaktoriske oplysninger i levende Xenopus larver. Vi skitsere en kombination af in vivo målinger af præsynaptiske calcium svar i glomeruli af olfaktoriske pære med olfaktoriske-styrede adfærd assays. Metoder kan kombineres med transection af olfaktoriske nerver at studere rewiring af synaptisk forbindelse. Eksperimenter er præsenteret ved hjælp af både vilde-typen og genetisk modificerede dyr udtryk for normal god landbrugspraksis journalister i centralnervesystemet celler. Anvendelsen af metoderne til genetisk modificerede haletudser beskrevne kan være nyttige for optrævler det molekylære grundlag, der definerer hvirveldyr adfærd.
Xenopus haletudser udgør en fremragende dyremodel for at studere den normale funktion af nervesystemet. Gennemsigtighed, fuldt sekventeret genom1,2og tilgængelighed til kirurgisk, elektrofysiologiske og Billeddannende teknikker er unikke egenskaber af Xenopus larver, der giver mulighed for at undersøge neuronal funktioner in vivo3 . Nogle af flere eksperimentelle mulighederne for dette dyr model er illustreret ved de grundige undersøgelser udført på haletudse sensoriske og motoriske systemer4,5,6. En særlig velegnet neuronal kredsløb til at studere mange aspekter af informationsbehandling på niveauet af synapser er Xenopus haletudse olfaktoriske system7. For det første, dens synaptisk forbindelse er veldefineret: olfaktoriske receptor neuroner (ORNs) projekt til olfaktoriske pære og etablere synaptic kontakter med dendritter af mitral/tuftet celler i glomeruli at generere lugt kort. For det andet genereres dens ORNs kontinuerligt af neurogenese hele livet at opretholde funktionaliteten af olfaktoriske veje8. Og for det tredje fordi det olfaktoriske system viser en stor regenerative evne, Xenopus haletudser er købedygtig helt reformere deres lugtekolben efter ablation9.
I dette papir beskriver vi tilgange, der kombinerer billeddannelse af olfaktoriske glomeruli i levende haletudser med adfærdsmæssige eksperimenter til at studere funktionaliteten af olfaktoriske veje. Metoderne detaljeret her blev brugt til at studere den funktionelle genopretning af glomerulær connectivity i de olfaktoriske pære efter lugtenerven transection10. Oplysninger indhentet i Xenopus haletudser er repræsentant for hvirveldyr da olfaktoriske forarbejdning er evolutionær bevares.
De beskrevne metoder er eksemplificeret ved hjælp af X. tropicalis , men de kan nemt implementeres i X. Bærmispel. Trods den større størrelse af voksen X. laeviser begge arter bemærkelsesværdigt ens haletudse gennemførelsesstadier. De væsentligste forskelle findes på genomisk niveau. X. laevis viser dårlig genetiske sporbarhed, overvejende bestemt af sin allotetraploid genom og lange generationstid (ca 1 år). Derimod er X. tropicalis mere modtagelig for genetiske modifikationer på grund af dens kortere generationstid (5-8 måneder) og diploide genom. De repræsentative eksperimenter er illustreret for wild-type dyr og tre forskellige transgene linjer: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) og tubb2:GFP (X. laevis).
De metoder, der er skitseret i det nuværende arbejde bør overvejes sammen med de genetiske skrider frem i feltet Xenopus . Enkelhed og nem implementering af de teknikker præsenteret gør dem særligt nyttigt for evaluering allerede beskrevet mutanter11, samt Xenopus linjer genereret af CRISPR-Cas9 teknologi12. Vi også beskrive en kirurgisk procedure, der anvendes til Transekttællinger olfaktoriske nerver, der kan gennemføres i et laboratorium, der har adgang til Xenopus haletudser. Metoderne anvendes for at vurdere præsynaptiske calcium svar og olfaktoriske-styrede adfærd kræver specifikke udstyr, omend på en moderat omkostninger. Metoder er præsenteret i en simpel formular til at fremme deres anvendelse i forskningsgrupper og kunne angive grundlaget for mere komplekse assays, enten ved at gennemføre forbedringer eller ved association til andre teknikker, dvs, histologiske eller genetiske metoder.
Dette papir beskriver teknikker, der er nyttige til at undersøge funktionaliteten af olfaktoriske veje i levende Xenopus haletudser. Den nuværende protokol er især nyttigt for de laboratorier, der arbejder, eller har adgang til Xenopus; Det er imidlertid også interessante for de forskere, der studerer det cellulære og molekylære grundlag af neuronal regenerering og reparation. Resultaterne fra Xenopus kan kombineres med data indsamlet i andre hvirveldyr modeller til at identificere bevare…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) destruktionsbestemmelser af den europæiske fond for Regionaludvikling (EFRU), af konkurrencedygtige forskning priser fra M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Fellowship fond, Laura og Arthur Colwin begavet sommer Research Fellowship Fund , Fischbach stipendium, og den store Generation fond af den Marine biologiske laboratorium og den nationale Xenopus ressource RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) hvor en del af dette arbejde blev udført. Vi takker også CERCA Program / Generalitat de Catalunya til institutionel støtte. A.L. er en Serra Húnter fyr.
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
Epoxy resin | RS Components | ||
Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |