Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Functionele evaluatie van olfactorische trajecten in levende Xenopus kikkervisjes

doi: 10.3791/58028 Published: December 11, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Xenopus kikkervisjes bieden een uniek platform voor het onderzoek naar de functie van het zenuwstelsel in vivo. We beschrijven methodologieën voor evaluatie van de verwerking van olfactorische informatie in levende Xenopus larven bij fokken normaal of na blessure.

Abstract

Xenopus kikkervisjes bieden een uniek platform voor het onderzoek naar de functie van het zenuwstelsel. Zij bieden meerdere experimentele voordelen, zoals toegankelijkheid van talrijke imaging benaderingen, elektrofysiologische technieken en gedrags testen. Het Xenopus tadpole olfactorische systeem is bijzonder goed geschikt voor onderzoeken van de functie van synapsen gevestigd tijdens normale ontwikkeling of hervormd na blessure. Hier beschrijven we methodologieën voor evaluatie van de verwerking van olfactorische informatie in levende Xenopus larven. We schetsen een combinatie van in vivo metingen van exocytose calcium reacties in de glomeruli van de bulbus olfactorius met olfactorische geleide gedrag testen. Methoden kunnen worden gecombineerd met het transect van bulbus zenuwen te bestuderen de bedrading van synaptic connectiviteit. Experimenten zijn gepresenteerd met behulp van zowel wild-type en genetisch gemodificeerde dieren uiten GFP verslaggevers in cellen van het centrale zenuwstelsel. Toepassing van de methoden beschreven om genetisch gemodificeerde kikkervisjes kan nuttig zijn voor het ontrafelen van de moleculaire grondslagen die gewervelde gedrag definiëren.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Xenopus kikkervisjes vormen een uitstekende diermodel om te bestuderen van de normale functie van het zenuwstelsel. Transparantie, een volledig gesequenceerd genoom1,2, en de toegankelijkheid van chirurgische, elektrofysiologische en imaging technieken zijn unieke eigenschappen van Xenopus larven waarmee onderzoeken neuronale functies in vivo3 . Enkele van de meerdere experimentele mogelijkheden van deze diermodel worden geïllustreerd door de grondige studies uitgevoerd op tadpole sensorische en motorische systemen4,5,6. Een bijzonder geschikt neuronale circuit te bestuderen van vele aspecten van informatie verwerking op het niveau van synapsen is de Xenopus tadpole olfactorische systeem7. In de eerste plaats de synaptische verbinding is goed gedefinieerd: olfactorische receptor neuronen (ORNs) naar de bulbus olfactorius project en synaptische contacten leggen met dendrites van mitralisklep/getuft cellen binnen de glomeruli geur kaarten. Ten tweede, zijn ORNs worden voortdurend gegenereerd door neurogenese gedurende het hele leven te handhaven van de functionaliteit van olfactorische trajecten8. En ten derde omdat de olfactorische systeem een groot regeneratieve vermogen blijkt, Xenopus kikkervisjes kunnen hun bulbus olfactorius na ablatie9volledig te hervormen.

In deze paper beschrijven we benaderingen die beeldvorming van olfactorische glomeruli in levende kikkervisjes met gedrags experimenten combineren te bestuderen van de functionaliteit van olfactorische trajecten. De hier gedetailleerde methoden werden gebruikt om de studie van het functionele herstel van de glomerulaire connectiviteit in de bulbus olfactorius na bulbus zenuw transect10. Gegevens die zijn verkregen in Xenopus kikkervisjes representatief zijn voor gewervelden omdat olfactorische verwerking evolutionaire is bewaard.

De beschreven methoden zijn geïllustreerd met behulp van X. tropicalis , maar ze kunnen eenvoudig worden geïmplementeerd in X. laevis. Ondanks de grotere omvang van de volwassen X. laeviszijn beide soorten opvallend vergelijkbaar tijdens tadpole stadia. De belangrijkste verschillen bevinden zich op het genomisch niveau. X. laevis geeft arme genetische werkwillig, meestal bepaald door haar allotetraploid genoom en de lange generatietijd (ongeveer 1 jaar). Is daarentegen meer vatbaar voor genetische modificaties vanwege de kortere generatietijd (5 tot 8 maanden) en diploïde genoom X. tropicalis . De representatieve experimenten worden geïllustreerd voor wild-type dieren en drie verschillende transgene lijnen: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) en tubb2:GFP (X. laevis).

De methoden die worden beschreven in de lopende werkzaamheden moeten naast de genetische vordert in het veld Xenopus worden beschouwd. De eenvoud en de eenvoudige implementatie van de technieken gepresenteerd maakt ze bijzonder nuttig voor de evaluatie van de reeds beschreven mutanten11, evenals Xenopus regels gegenereerd door CRISPR-Cas9 technologie12. Ook beschrijven we een chirurgische ingreep gewend transect bulbus zenuwen die kunnen worden uitgevoerd in een laboratorium dat die toegang hebben tot Xenopus kikkervisjes. De benaderingen gebruikt voor de evaluatie van de reacties van de presynaptische calcium en olfactorische geleide gedrag vereisen specifieke apparatuur, zij beschikbaar op een matige kosten. Methoden worden gepresenteerd in een eenvoudig formulier ter bevordering van het gebruik ervan in de onderzoeksgroepen en de grondslagen van meer complexe tests kon instellen door het implementeren van verbeteringen of door de associatie met andere technieken, dat wil zeggen, histologische of genetische benaderingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van het dierlijke onderzoek aan Universiteit van Barcelona.

Opmerking: De kikkervisjes van X. tropicalis en X. laevis worden gefokt volgens de standaardmethoden13,14. Tadpole water wordt bereid door commerciële zouten (Zie Tabel van materialen) toe te voegen aan water verkregen door omgekeerde osmose. Geleidbaarheid wordt aangepast aan de ∼700 µS en ∼1, 400 µS voor X. tropicalis en X. laevis kikkervisjes, respectievelijk. Larven kunnen worden verkregen door natuurlijke paring of bevruchting in vitro14. Embryo's zijn dejellied met 2% L-cysteïne bereid in 0.1 x Marc's bewerkt Ringers (BMR). 1 x MMR bevat (in mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0.1 EDTA, pH 7,8. Larven worden overgedragen na 2-3 dagen (fase 25) naar 2 L tanks met tadpole water. Wanneer de kikkervisjes bereiken fase 40 van de Nieuwkoop-Faber (NF) criteria15, ze zijn geplaatst in 5 L tanks en onderhouden bij een dichtheid van 10 dieren/L. temperatuur constant bij 23-25 ° C en 18-20 ° C wordt gehouden voor X. tropicalis en X. laevis kikkervisjes, respectievelijk. Dieren gevonden in stadia 48-52 van de NF-criteria worden gebruikt voor experimenten.

1. transect van bulbus zenuwen

  1. Bereid een anesthetizing oplossing van 0,02% MS-222 in 50 mL tadpole water op kamertemperatuur.
  2. Voorbereiden van een kleine tank (1-2-L) met tadpole water dat herstel van de dieren na de operatie.
  3. Knip rechthoekige stukken van cellulose kwalitatief filtreerpapier (4 cm x 3 cm, Zie Tabel van materialen).
  4. 2 stuks van cellulose kwalitatief filtreerpapier in 0.02% MS-222 oplossing NAT en plaats ze onder de ontleden.
  5. Kies een tadpole uit de tank en het onderdompelen in de anesthetizing oplossing. Het dier stopt met zwemmen binnen 2-4 min en reageert niet op mechanische stimuli toegepast op het niveau van de staart met pincet.
  6. Plaats de narcose tadpole op de rechthoekige stukken filtreerpapier. Plaats het dier met de dorsale zijde naar boven gericht, zodat de breinstructuur kunnen worden gevisualiseerd.
    1. Met behulp van vannas-schaar (Zie Tabel van materialen) snijden één of beide bulbus zenuwen (afhankelijk van het type test uit te voeren). Transect een enkele zenuw voor experimenten die een interne controle van zenuw schade vereisen.
    2. Transect voor gedrags experimenten, beide zenuwen te onderdrukken van alleinformatie odorant aankomst naar de bulbus olfactorius. De efficiëntie van het segmenteren van bulbus zenuwen kan gemakkelijk worden waargenomen onder de ontleden; pigmentatie of dier positie kan echter factoren beperken.
      Opmerking: (Optioneel) De beste manier om te certificeren van de geldigheid van de procedure is het gebruik van transgene kikkervisjes die uitdrukking geven aan fluorescerende verslaggevers op hun zenuwstelsel (Zie representatieve resultaten). Voor dit doel moet het gebruik van een scope van de dissectie uitgerust met fluorescentie (Figuur 1). Als alleen wild-type dieren beschikbaar zijn, kan traceren met CM-diI worden toegepast. Volg protocol 2 (zie hieronder) om te injecteren een 0,5 mg/mL oplossing van CM-diI bereid in 0,3 M sacharose in de nasale capsule. Zie 16 voor details over de voorbereiding en de opslag van CM-diI. Lekkage van kleurstof uit de belangrijkste Holte moeten worden minimaliseren. Voor dit doel is het noodzakelijk om de druk van de injectie en de opening van micropipetten te wijzigen. Fluorescentie op het niveau van de glomerulaire laag van de bulbus olfactorius wordt duidelijk 24u na toepassing van CM-diI. Het huidige werk maakt gebruik van labelen met CM-diI gewoon te certificeren van de transect procedure; Deze methode kan echter ook morfologische informatie verkrijgen van olfactorische glomeruli met behulp van conventionele histologische procedures worden gebruikt.
  7. Dieren overbrengen in de herstel-tank. Kikkervisjes moeten herstellen normale zwemmen binnen ~ 10 min. een zorgvuldige inspectie op de aanwezigheid van bloeduitstortingen, die worden verwacht in ~ 1% van de dieren aan operatie onderworpen uitvoeren.
  8. Euthanaseren gewonde dieren in een oplossing van 0,2% MS-222.

2. etikettering van olfactorische Receptor neuronen met fluorescerende Calcium indicatoren

  1. Bereid een oplossing met 12% Calcium Green-1-dextran (Zie Tabel of Materials), 0,1% Triton X-100 en 1 mM NaCl17. De oplossing bij-20 ° C of bij-80 ° C worden opgeslagen als het is niet te worden gebruikt binnen een maand.
  2. Glas pipetten met tip openingen ~ 1 – 2 µm (soortgelijke diameter aan microelectrodes gebruikt voor patch-clamp experimenten) voorbereiden microinjection met behulp van een trekker van de micropipet (Zie Tabel van materialen).
  3. Kalibreren van het volume van microinjections. Met gedestilleerd water, druk en injectie tijd aanpassen met het oog op de injectie hoeveelheid 0,15 – 0,3 µL.
    Opmerking: Een eenvoudige procedure bestaat in het tellen van het aantal pulsen vereist voor het leegmaken van een pipet gevuld met 1 µL van water. Typische parameters zijn een tijdsdruk 30 psi en 50 ms injectie.
  4. Plaats een pipet in de microinjector en laad het met ~ 2 µL van calcium groen-1 dextran oplossing.
  5. Bereiden een tadpole 1.1 tot 1.6 als volgt.
  6. Het uiteinde van de pipet verplaatsen naar de belangrijkste holte van de nasale capsule.
    Opmerking: Zie Figuur 2A met een beschrijving van de locatie van olfactorische trajecten in een Xenopus tadpole.
  7. Met instellingen die zijn verkregen in punt 2.3, leveren een aantal soezen. Aanwezigheid van de kleurstof beperken tot de nasale capsule.
  8. Laat de tadpole rusten voor 2 – 3 min. met behulp van een pipet van Pasteur, pour druppels van 0.02% MS-222-oplossing op de meer caudal delen van het dier tot het vermijden van drogen.
  9. Het dier overbrengen in de herstel-tank.
    Opmerking: Het normale zwemmen moet herstellen binnen ~ 10 min. manipulatie van dieren verwondingen kan veroorzaken.
  10. Euthanaseren kikkervisjes die normale zwemmen gedrag 15 min na het inspuiten met een oplossing van 0,2% MS-222 niet herstellen.
  11. Observeren fluorescentie op het niveau van de glomerulaire laag van de bulbus olfactorius op de dag na de injectie.

3. bereiding van kikkervisjes Live beeldvorming van exocytose reacties

  1. 24-48 h vóór het uitvoeren van het experiment, jas 4 – 6 petrischalen met diameter van 35 mm met silicone-elastomeer (bijvoorbeeld Sylgard). Zodra de elastomeer is polymeervorm, fabriceren een rechthoekige goed aanpassen aan de tadpole.
    Opmerking: Typische afmetingen voor X. tropicalis kikkervisjes gevonden in NF stadia 48-52 zijn 10 x 4 mm.
  2. Bereiden van 100 mL een 160 µM tot 1 mM aminozuur oplossing fungeert als een odorant stimulans voor kikkervisjes. De oplossing kan bestaan uit een mix van verschillende aminozuren: methionine, leucine, histidine, arginine en lysine. Verdun aminozuren in oplossing van Xenopus Ringer's, samengesteld uit (in mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glucose, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7,8. Zorgen ervoor dat pH is gehouden op 7,8.
  3. Vul een verhoogde reservoir met 20 mL van de oplossing van het aminozuur. Sluit het reservoir met polyethyleen buis tot een capillaire buis 28 G (Zie Tabel van materialen) geplaatst boven de nasale capsule.
    Opmerking: Het capillair is gemonteerd op een micromanipulator (Zie Tabel van materialen). Luchtbellen moet afwezig uit de perfusie-systeem.
  4. Bereiken temporele precisie bij de toepassing van het aminozuur oplossing met behulp van de transistor-transistor-logic (TTL) controle van snuifje magneetafsluiters (Zie Tabel van materialen). Een stimulator wordt gebruikt voor het genereren van TTL pulsen (Zie Tabel van materialen). Controleer de temporele precisie de odorant om oplossing te komen door het veranderen van de duur van de TTL pulsen, dwz., 0.1 tot 1 s.
  5. Een ander verhoogde reservoir vullen met 100 mL Xenopus Ringer's oplossing.
  6. Een tadpole anesthetize en plaats deze onder de ontleden (stappen 1.1 tot 1.6).
  7. Een tadpole voorbereiden op imaging. Als albino kikkervisjes beschikbaar zijn gaat u verder met stap 3.9, anders Verwijder de huid boven de bulbus olfactorius omdat het bevat melanocyten die afbreuk doen aan de beeldvorming (stap 3.8).
    Opmerking: Er zijn twee manieren voor het uitvoeren van het experiment is afhankelijk van de pigmentatie van het dier. Het is beter dan gebruik maken van albino dieren. Albino stammen zijn beschikbaar voor X. laevis en albino X. tropicalis lijnen onlangs zijn gegenereerd door CRISPR-Cas9 12 of TALENs18.
  8. Met behulp van vannas maken schaar, een laterale insnijding op de tadpole huid aan de rand van het centrale zenuwstelsel. Maak de snede moet plaatsvinden op het niveau van de bulbus olfactorius en nooit het bereiken van de positie van tectum, die gemakkelijk kan worden geïdentificeerd door de locatie van de oogzenuw.
  9. Knijp de gesneden huid met behulp van pincet en trekken over het zenuwstelsel. Controleer of u succesvol verwijderen door het ontbreken van melanocyten boven de bulbus olfactorius. Houd het dier vochtige door gieten druppels van 0.02% MS-222-oplossing met behulp van een precisiepipet Pasteur.
  10. De tadpole in de put van de gecoate schotel plaatsen (Zie Tabel van materialen). Zet een glas dekglaasje aan bekleed met hoog vacuüm vet boven het dier. Plaats het dekglaasje aan ter dekking van de bovenkant van de tectum aan het einde van de staart.
  11. Zorg ervoor dat de bulbus olfactorius en placodes blootgesteld aan het extracellulaire medium blijven. Houd de tadpole immobiel tijdens imaging. Vul de petrischaal met Xenopus Ringer's solutioncontaining 100 µM tubocurarine (Zie Tabel van materialen) om te voorkomen dat spiersamentrekkingen.
    Opmerking: Tubocurarine wordt opgeslagen in aliquots bij-80 ° C niet langer dan 6 maanden.
  12. Zet de schotel de tadpole onder een Microscoop rechtop te houden. Sluit het reservoir met Xenopus Ringer's oplossing met de schotel met behulp van polyethyleen buizen (Zie Tabel of Materials) voor continue perfusie van Xenopus Ringer's oplossing het dier om levend te houden voor > 1 h.
    Opmerking: Mini magnetische klemmen (Zie Tabel van materialen) zijn zeer nuttig stabiel buizen verbinden met de schotel. Perfusie en zuig buizen moeten zich bevinden in ~ 180° hoek.
  13. Start zoogdierlevercellen Xenopus Ringer's oplossing. Het beschermingsniveau van de oplossing in de schotel constante gedurende het gehele experiment. Doorlopende evaluatie tadpole levensvatbaarheid door het observeren van de omloop van het bloed door de vaten.

4. levende Imaging presynaptische Ca2 + mutatieoverzicht olfactorische Glomeruli

Opmerking: De imaging procedure is beschreven voor het breed-gebied microscopie, maar kan gemakkelijk worden aangepast aan een confocal microscoop door de overname-instellingen aan te passen. Imaging moet worden uitgevoerd in een rechtop Microscoop gemonteerd op een anti-trillingen-tabel.

  1. Visualiseren van de tadpole met een lage vergroting doelstelling, bijvoorbeeld 5 x.
  2. Verplaats de micromanipulator assen te plaatsen van het capillair leveren de odorant oplossing op de top van een nasale capsule vormen een hoek van 90 ° met de bulbus zenuw. De stroom van odorant oplossing boven de bulbus olfactorius moet worden vermeden omdat het turbulenties die imaging verstoren kan veroorzaken.
  3. Zoeken de bulbus olfactorius ipsilaterally gelegen aan de nasale capsule (afhankelijk van stimulatie) met behulp van een hoge vergroting, lange afstand, water onderdompeling doelstelling: 60Xx, 0.9 N.A.
  4. Controleer de fluorescentie-emissie door oog. Glomerulaire structuren moet duidelijk (Figuur 2B).
  5. Live overname met een camera geschikt voor calcium imaging uitvoeren. Definieer een doos met de volledige bulbus olfactorius, typisch van 256 x 256 of 512 x 512 pixels. Set de overname frame rate verwerving tot 20-40 Hz. de winst, zodanig aanpassen dat de waarden van basale fluorescentie zijn ~ 20% van verzadiging. Verwerven van een 5 s-video.
  6. Visualiseren van de film. Controleer beeld focus, de afwezigheid van bewegingsartefacten en regio's met verzadigde pixels. Typische fluorescentie waarden van glomerulaire regio's moeten van 5.000-20.000 a.u. als een 16-bits-camera gebruikt. Ga verder met de volgende stap als imaging voorwaarden optimaal zijn. Herhaal stap 4.6 als die nodig zijn om de beeldkwaliteit te verbeteren of aanpassen van de winst.
  7. Start een time-lapse overname als u wilt opnemen van reacties opgeroepen door olfactorische prikkels.
    Opmerking: Precieze toepassing van de odorant oplossing wordt beheerd door TTL prikkels. Een typisch experiment bevat een basislijn periode van 4 s, gevolgd door stimulatie tijden variërend van 0,1 tot 0,5 s en een herstelperiode van 6-10 s.
  8. Uitvoeren van repetitieve stimulaties van odorant voor tijdsintervallen > 2 min. ingesteld het debiet op 1 – 1,5 mL·min-1. Aangezien de globale perfusie tijdens alle experimenten op, zijn lokaal toegepaste aminozuren weggespoeld.
    Opmerking: Het volume van de oplossing in de schotel is ~ 3 mL.
  9. Beeldanalyse
    1. Detectie van reacties
      1. Films exporteren naar ImageJ.
        Opmerking: Het doel is het opsporen van de aanwezigheid van glomerulaire regio's reageren op prikkels.
      2. De ruwe reeks van fluorescentie beelden aan een ΔF/F0 film transformeren. Het meten van relatieve wijzigingen in basale fluorescentie volgens de volgende relatie: (F-F0) / f0, waar F0 geeft aan basislijn fluorescentie niveaus dat.
      3. Regio's van belang (ROI) tekenen rond gebieden met verhogingen van de vermeende fluorescentie tijdens stimulatie en opnemen van hun positie in de ROI-manager(Figuur 2). Teken een ROI te sporen achtergrondniveaus fluorescentie in een gebied verstoken glomerulaire structuren.
    2. Kwantificering van reacties.
      1. Plaats de gedefinieerde ROIs in de ruwe opeenvolging van fluorescentie beelden. De gemiddelde grijze waarde van geselecteerde ROIs voor elk frame verkrijgen. Overdracht van de volgorde van de waarden die zijn verkregen aan een analyseprogramma (bijvoorbeeld., Igor Pro).
      2. Achtergrond fluorescentie aftrekken en vervolgens ΔF/F0 wijzigingen te berekenen voor elke ROI (figuur 2F). Plot de stijgingen van de ΔF/F0 voor elk van de ROIs geselecteerd. Bereken de standaarddeviatie van basale ΔF/F0 (vóór stimulatie).
        Opmerking: Een positieve reactie wordt beschouwd als de stijgingen van de ΔF/F0 verkregen tijdens stimulatie groter zijn dan 2 standaardafwijkingen van basale waarden.

5. olfactorische geleide gedrag Assay

Opmerking: Een schema van de installatie voor het uitvoeren van de bepaling is afgebeeld in Figuur 3.

  1. Maak kleine gaatjes te passen 1.57 mm od x 1.14 mm I.D. buis in het bovenste deel van elk putje van een schotel 6-well. Plaats de buis en verzegelen met een epoxy lijm (Zie Tabel van materialen).
    Opmerking: De gewijzigde schotel kan hergebruikt worden vele malen na grondig wassen met gedestilleerd water.
  2. Bereiden van 50 mL van de oplossing van een aminozuur met methionine, leucine, histidine, arginine en lysine (zie stap 3.2 voor details). De concentraties kunnen variëren van 160 µM tot 1 mM. Plaats 20 mL van de oplossing in een verhoogde reservoir.
  3. Don't feed kikkervisjes voor ten minste 12 uur vóór de bepaling. Neem 6 kikkervisjes uit hun huisvesting tank en plaats hen in 2 L van schone tadpole water om te minimaliseren van de blootstelling aan odorant.
  4. Plaats de gemodificeerde 6 wells schotel op een witte LED-transilluminator (Figuur 3).
  5. Koppel de perfusie inhammen naar het reservoir met de oplossing van de aminozuur met behulp van een variëteit (Zie Tabel van materialen). De perfusie-systeem controleren en elimineren van luchtbellen. Vul de 6 putten gelijktijdig. Aanpassen van de hoogte van het reservoir om de levering van ≥5 van odorant binnen ~ 30 mL s.
    Opmerking: Elk goed 4 keer met dubbel gedestilleerd water na blootstelling aan de oplossing van odorant wassen.
  6. Vul elk goed met 10 mL tadpole water. Plaats 1 tadpole per putje. Verlof om uit te rusten voor > 3 min.
  7. Beeldacquisitie instellen. Het gebruik van een conventionele CCD-camera, die beelden op ≥5 Hz. Sluit de camera op een computer kan verwerven. Hier, het gebruik van een Zeiss MRC5 camera gecontroleerd door Zen software maar andere gelijkwaardige configuraties kunnen worden gebruikt. Als het nodig is te verhogen van de framesnelheid, toepassing pixel weggooien. Afbeeldingen moeten laten zien dat de hele 6-well schotel.
  8. Start Beeldacquisitie zodanig dat sommige films bevatten basale (30 s), stimulus (25 – 35 s) en terugwinning (30 – 60 s) perioden.
  9. Terug dieren uit de schotel 6 putten naar tanks na imaging.
  10. Analyseren van films in ImageJ met behulp van plugins zoals wrMTrck19,20 , waarmee meerdere parameters die zijn gekoppeld aan beweeglijkheid.
  11. Als u wilt afbeeldingen voorbereiden voor analyse, selecteert u eerst een goed door te tekenen op een rechthoekig ROI van 35 x 35 mm (Figuur 4A). Een achtergrondafbeelding ophalen door het berekenen van de maximale projectie van de gehele reeks. Het moet een beeld van de put zonder de tadpole.
  12. Aftrekken van de maximale projectie van de rauwe film. Drempelmethode uitvoeren op de gegenereerde 32-bits-film en de wrMTrck plugin toe te passen. Aanpassen WrMTrck parameters voor het op betrouwbare wijze bijhouden van verplaatsingen van dieren. Overdracht van de verkregen X, Y-coördinaten in een analyseprogramma.
  13. Met behulp van X-en Y-coördinaten, berekenen de Euclidische afstand tot de bron van odorant (perfusie inlaat in de put), door toepassing van de volgende vergelijking:
    Equation 1
    waar os geeft de positie van de bron van de geur en tad geeft de tadpole positie op een bepaald moment. Zie Figuur 4A voor meer informatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In deze paper presenteren we een combinatie van twee complementaire benaderingen voor het uitvoeren van in-vivo -onderzoek van de functionaliteit van de Xenopus tadpole olfactorische systeem: ik) een methode voor imaging presynaptische Ca2 + veranderingen in de glomeruli van leven kikkervisjes met behulp van een fluorescerende calcium indicator, en ii) begeleide een geur gedrags test die kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de reactie op specifieke waterbasis odorant. Omdat deze benaderingen hebben gewerkt om het herstel van de olfactorische verwerking na letsel10, wordt een eenvoudige methode voor het transecting van de bulbus zenuwen ook beschreven.

Transect van olfactorische trajecten in Xenopus kikkervisjes
Er zijn twee manieren om te certificeren van de geldigheid van de procedure. Beide gebruik van de visualisatie van de bulbus zenuwen met behulp van fluorescerende verslaggevers. Een methode is gebaseerd op transgene kikkervisjes die uitdrukking geven aan fluorescerende eiwitten op hun zenuwstelsel. Twee aanbevolen lijnen die uitdrukking geven aan GFP onder een neuronale β-tubuline promotor zijn X. laevis tubb2b-GFP en X. tropicalis NBT-GFP (Figuur 1, Zie Tabel van materialen). Indien slechts wild-type dieren beschikbaar zijn, CM-diI kan worden gebruikt (zie stap 1.8). Figuur 1 toont beelden van tubb2-GFP X. laevis kikkervisjes. Beelden zijn van vier verschillende dieren, waar een enkele zenuw van de bulbus was verbeelde. De snede moet duidelijk onder de werkingssfeer van de dissectie. Het voordeel van het gebruik van transgene lijnen is dat de Reformatie van de bulbus zenuw kan worden gevolgd over een periode van tijd. Bij het doen van opeenvolgende opmerkingen, is het aanbevolen om blootstelling aan kunstlicht om te voorkomen dat photodamage minimaliseren. Afdelen van een enkele bulbus zenuw is handig wanneer een interne controle is vereist, zoals bijvoorbeeld normaal ontwikkelde vs herbedraad glomerulaire eenheden te vergelijken. Afdelen van beide bulbus zenuwen moet worden toegepast als het doel is volledig het onderdrukken van de overdracht van informatie.

Live imaging van exocytose reacties op olfactorische stimuli
De juiste labelen van ORNs met kalk groen-1 dextran waarneembaar op het niveau van de bulbus olfactorius (Figuur 2A) met behulp van widefield microscopie. Glomeruli duidelijk (Figuur 2B) en door het bewegen van het vliegtuig focus verdeeld in verschillende lagen moeten verschijnen. De morfologie van de glomerulaire structuren beter kan worden opgelost als een confocal microscoop in plaats daarvan wordt gebruikt (Figuur 2C). Het aantal gelabelde glomeruli hangt af van kleurstof opname op het niveau van de olfactorische epitheel. Deze procedure staat daarom geen de visualisatie van alle glomerulaire eenheden. Dieren met een meer intense fluorescentie kleuring van de glomerulaire regio moeten zijn ingeschakeld voordat u imaging experimenten, omdat ze meer ORNs met het label bevatten. Deze manoeuvre wordt sterk aanbevolen om experimentele doorvoer te vergroten en moet worden uitgevoerd onder een ontleden scope voorzien van een fluorescentie-lamp. Dieren die vertonen geen gelabelde glomerulaire eenheden of die Toon fluorescentie beperkt tot bepaalde gebieden van de glomerulaire laag verwerpen. Exocytose Ca2 + reacties kunnen zo spoedig 1 dag na het laden van de kleurstof worden waargenomen. Voor de uitvoering van experimenten imaging is het wenselijk te gebruiken van de doelstellingen van hoge numerieke diafragma, meestal ≥0.9.

Verhogingen van de presynaptische calciumgehalte kunnen worden opgeroepen bloot dendritische knoppen van ORNs aminozuren. Het is belangrijk om de positie van de capillaire leveren de odorant oplossing boven de nasale capsule. Zorg moet worden genomen om contact te voorkomen omdat het kon de tip van het capillair verstoppen en/of mechanische stimulatie van ORNs veroorzaken. Voorbijgaande stijgingen van de presynaptische calciumgehalte voor prikkels ≥0.1 s (Figuur 2D) kunnen worden waargenomen en zijn indicatief voor een juiste olfactorische transductie. Het is ook belangrijk om te visualiseren basale calciumgehalte met lage camera te krijgen. Exocytose terminals van ORNs weer hoge fluorescerende verhogingen en is het essentieel om te voorkomen dat signaal verzadiging. Hoge temporele resolutie kan worden bereikt met widefield microscopie. Bijvoorbeeld is met een CCD-camera met elektron-vermenigvuldigd, het mogelijk om beeldfrequenties van 50 Hz of hoger. Gebruik van de confocal microscopie vermindert temporele resolutie maar maakt een betere definitie van de glomerulaire structuren.

De hoge affiniteit van calcium groen voor bindende calcium (190 nM) is bijzonder nuttig om het detecteren van kleine reacties. Voorbijgaande intracellulair calcium verhoogt gedetecteerd in de glomerulaire laag zijn variabel. Wijzigingen worden in sommige glomerulaire regio's weergegeven in ΔF/F0 ≥0.2, terwijl naburige processen niet zelfs (Figuur 2D reageren kunnen). De volgende factoren dragen bij aan de variabiliteit van de respons van de glomerulaire eenheden: i) het totale aantal gelabelde glomeruli, ii) de intracellulaire concentratie van calcium groen, en iii) de selectiviteit van ORNs te detecteren van aminozuren. Omdat een te laag aantal gelabelde glomeruli misschien beletsel voor observatie van reacties, is het absoluut noodzakelijk voor het uitvoeren van deze experimenten met dieren met veel ORNs aangeduid als mogelijk.

Bulbus geleide gedrag
Data-analyse
Bulbus geleide gedrag is bestudeerd met behulp van een op maat gemaakte systeem. Figuur 3 toont een schematische tekening van de apparatuur die wordt gebruikt voor het uitvoeren van de test. De test is gevestigd in het vermogen van kikkervisjes de aanwezigheid van aminozuren, die als odorant fungeren vast te stellen. Een combinatie van vijf verschillende aminozuren (methionine, leucine, histidine, arginine en lysine) oplossing wordt gebruikt voor stimulatie. De oplossing is lokaal geleverd tijdens 30 s met een 35 mm putje met een vrijzwemmende tadpole. De onmiddellijke reactie van kikkervisjes op de binnenkomende oplossing is een toename van beweeglijkheid. Willekeurige bewegingen die zich voordoen tijdens de eerste ∼5-10-s oplossing ervan worden gevolgd door een directe duik naar de bron van odorant. Kikkervisjes gedurende enkele seconden in de nabijheid van het mondstuk tijdens de levering van aminozuren en beweeglijkheid in willekeurige richtingen (Zie aanvullende video's 1, 2) geleidelijk te herstellen.

De proefomstandigheden beschreven toestaan het normale zwemmen X. tropicalis kikkervisjes fasen 48-52; echter moet het worden rekening gehouden dat de beweeglijkheid van grotere dieren in 35 mm putten kan worden beperkt. Tadpole bewegingen worden geregistreerd met een CCD-camera. Attractie voor de oplossing van odorant kan worden gedetecteerd als een verlaging van de Euclidische afstand tussen perfusie inlaat vanaf tadpole positie (Figuur 4). Bijhouden van tadpole hoofd posities binnen een gebied van 35 x 35 mm (of het equivalent grootte in pixels) kunt verkrijgen van een kwantitatieve analyse van olfactorische geleide gedrag (Figuur 4A). Individuele percelen van tadpole bewegingen worden geconstrueerd met behulp van X-en Y-coördinaten verkregen door beeldanalyse (Figuur 4B). De beweeglijkheid van de uitgepakte percelen moeten getrouwe videobeelden.

Er zijn twee mogelijke methoden olfactorische geleide gedrag experimenten te interpreteren. De eerste aanpak is geïnspireerd op een eerdere studie met behulp van zebrafishes21. Meting van de tijd doorgebracht in de nabijheid van het mondstuk voor het leveren van odorant bewijzen de aanwezigheid van een positief tropisme. Een gebied van belang voor 8.75 mm radius (overeenkomend met ¼ van de goed diameter) gecentreerd op de inlaat van de oplossing die wordt gebruikt voor het classificeren van de nabijheid van de dieren naar de bron van odorant (figuur 4A, 4 C). Weggooien van de tijd besteed door kikkervisjes in de nabijheid van de verstuiver in gedefinieerde periodes, dat wil zeggen, 15 s intervallen, kunt identificeren van de mogelijkheid om te detecteren aminozuur oplossingen (Figuur 4D). Het algehele gedrag van een bevolking van kikkervisjes kan worden verkregen door het uitzetten van de verdeling van de individuele gegevens (Figuur 5A). Een positief tropisme kan worden gedetecteerd wanneer de oplossing van methionine, leucine, histidine, arginine en lysine wordt voorbereid op 1 mM of 160 μM (figuur 5A en 5B). Dieren reageren niet op water toepassing (Figuur 5C), dus het teruggooien van de deelname van de mechanosensitive mechanismen. Verschillen tussen tijd intervallen die zijn gedefinieerd in elke experimentele groep kunnen worden vastgesteld met behulp van niet-parametrische herhaalde maatregelen ANOVA met Dunns meerdere vergelijkingen test. Het nadeel van het weggooien van gegevens in tijdsintervallen van 15 s is een lagere temporele resolutie.

Een manier om tijdelijke informatie van de gedragsmatige reactie is doordat de gemiddelde percelen van Euclidische afstand van de bron van de geur. Hoewel tadpole bewegingen Toon een intrinsieke variabiliteit, toont de beweeglijkheid van het gemiddelde van een populatie van dieren (meestal ≥40) de olfactorische geleide gedrag. Voor het uitvoeren van deze analyse is het noodzakelijk groep dieren positie vóór het intreden van stimulatie. Aangezien de kikkervisjes zijn te vinden in verschillende locaties wanneer de odorant oplossing heeft ingevoerd in de put is verplicht de Euclidische afstand instellen op 0 net voor stimulatie (Figuur 6A, zie ook de criteria voor opneming in Figuur 7). Negatieve en positieve waarden geven daarom een attractie of een afkeer van de bron van de geur, respectievelijk. Een attractie voor geuren is goed beschreven door een lineaire fit met regressie coëfficiënten ≥0.9. Als water wordt geleverd, de mutaties van de Euclidische afstand bevinden zich rond 0 en het is niet mogelijk om te passen een regel tijdens odorant stimulatie, aldus waaruit blijkt dat zij een olfactorische geleide gedrag (Figuur 6B). Vergelijking van de gemiddelde percelen van Euclidische afstanden voor aminozuur oplossingen bereid op 1 mM en 160 µM suggereren verschillende vertragingen in de olfactorische geleide reactie (Vergelijk figuur 6A en C). Het tijdsinterval moeten initiëren van het verkeer op de weg naar de bron van odorant is korter wanneer aminozuren worden toegepast op een hogere concentratie. Een gebrek aan olfactorische geleide gedrag wordt waargenomen in kikkervisjes met beide bulbus zenuwen verbeelde (Figuur 6D).

Een beperking van de beschreven olfactorische geleide gedrags test is de oprichting van complexe vloeistof pluimen. Dit kan worden gezien als de oplossing van het aminozuur wordt vervangen door een kleurstof, zoals Fast Green, bij het opzetten van het systeem. Het gebruik van gekleurde oplossingen wordt gecontroleerd of de vorming van pluimen en toont aan dat waterbasis odorant elke regio van de put binnen 5 s. turbulenties bereiken, veroorzaakt door de levering van de oplossing waarschijnlijk worden gedetecteerd door de zijlijn van kikkervisjes en waarschijnlijk bijdragen aan de variabiliteit waargenomen in dierlijke motiliteit, maar niet interfereren met de olfactorische begeleide gedrag. Controle experimenten uitgevoerd met behulp van water in plaats van aminozuur oplossingen blijkt dat kikkervisjes staat te discrimineren olfactorische van mechanische stimuli. De schatting van de tijd doorgebracht in een regio van belang (Figuur 5) en de gemiddelde plot van Euclidische afstanden (Figuur 6) zijn twee complementaire methoden om te beschrijven de olfactorische geleide reactie van kikkervisjes.

Inclusie criteria
Inclusie criteria moeten ook voor data-analyse in aanmerking worden genomen. Sommige kikkervisjes Toon een resonante beweging, die wordt geïllustreerd door het aanbrengen van de plot van Euclidische afstanden naar een sinusoïdale functie (Figuur 7A). Kikkervisjes weergeven van dit probleem moeten worden verwijderd uit alle analyse.

De uitsluiting van dieren die aan het begin van de toepassing van odorant oplossingen bij een maximale zijn (> 30 mm Figuur 7B) of een minimumafstand van de Euclidische (< 5 mm, Figuur 7C) van het mondstuk kunt minderen de variabiliteit van de gemiddelde percelen. Het voorbeeld geïllustreerd in Figuur 7B toont een positief tropisme voor de oplossing van het aminozuur. De tadpole is gelegen op een maximale afstand van de inlaat van de oplossing bij het begin van de stimulatie. Daarom kan deze relatieve positie alleen onthullen een attractie voor de bron van de geur. Figuur 7 C toont de tegenovergestelde situatie. Hier, is een tadpole gelegen in de nabijheid van het mondstuk voor het leveren van de oplossing van het aminozuur. Kwantificering van de tijd doorgebracht in de buurt van de bron van de geur toont een reactie (methode gebruikt in Figuur 5); echter tonen niet het een netto beweging naar de inlaat.

Kortom definieert de voorgestelde bepaling van de olfactorische geleide gedrag een binaire test. Deze methode kan worden gebruikt om op te sporen van het vermogen van een experimentele groep van kikkervisjes inspelen op odorant. Verdere verbeteringen zijn nodig als het doel is de oprichting van verschillen tussen complexe olfactorische geleide reacties, als bijvoorbeeld, vaststelling van voorkeuren voor de gegeven geuren.

Figure 1
Figuur 1: Transect van bulbus zenuwen. Representatieve beelden van tubb2-GFP X. laevis kikkervisjes verkregen na transect van een enkele bulbus zenuw (pijlen). Zenuwen van tubb2-GFP kikkervisjes weergeven sterke fluorescentie Zenuw transect is duidelijk onmiddellijk na de operatie (D0). Hergroei van de bulbus zenuw is duidelijk 4 dagen na knippen (D4). Acht dagen na de operatie (D8) er is weinig verschil tussen controle en hervormde zenuwen. Kikkervisjes in 0.02% waren verdoofd MS-222 voor het verzamelen van beelden. Bulbus olfactorius (O.B.) bulbus zenuw (O.N.), nasale capsule (N.C.), tectum (VEG), oogzenuw (Op.N.). Pijlen geven de locatie van de transected zenuw. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Etikettering van olfactorische receptor neuronen met calcium groene dextran en visualisatie van de presynaptische calcium toestroom op stimulatie met aminozuren. (A) overdraagbare licht beeld van een tadpole toont de locatie van de olfactorische epitheel, bulbus zenuwen en de glomerulaire laag van de bulbus olfactorius. (B) afbeelding van een bulbus olfactorius gevisualiseerd door widefield (wf) microscopie. Neuronen waren gelabeld door toepassing van calcium groen-1 dextran op de nasale capsule. De fluorescentie waargenomen komt overeen met de presynaptische terminals van olfactorische receptor neuronen vorming van de glomeruli. O.N: bulbus zenuw; O.B: bulbus olfactorius. (C) Confocal sectie dorsally gelegen van de vermelding van de bulbus zenuw naar de lamp. De presynaptische component van olfactorische glomeruli was gelabeld met behulp van calcium groen-1 dextran, net als in B). (D) presynaptische terminals verhogen Transient hun calcium bij blootstelling van de olfactorische epitheel aan een oplossing met vijf verschillende aminozuren. Relatieve veranderingen in calcium fluorescentie verkregen vóór, tijdens en na 1 s stimulatie. (E) distributie van 10 verschillende regio's van belang (ROIs) bij de berekening van de ΔF/F0 wijzigingen. ROI11 is buiten de glomerulaire laag en wordt gebruikt voor het definiëren van de achtergrondniveaus van fluorescentie. (F) individuele ΔF/F0 reacties voor ROIs gedefinieerd in E). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Gedrag bulbus geleide assay. (A) schematisch diagram weergegeven: de apparatuur die wordt gebruikt in de test. (B) voorbeeld van beweeglijkheid tracks opgenomen meer dan 90 s. Elke cirkel vertegenwoordigt een putje met een enkel dier. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Bijhouden van olfactorische geleide gedrag. (A) in het volgende voorbeeld toont een goed gebruikt voor de gedrags assay. De locatie van X, Y-coördinaten (in mm) gebruikt voor het bijhouden van tadpole bewegingen (Zie ook aanvullende Video 1) wordt aangegeven door blauwe stippellijn. De groene ellips vertegenwoordigt de positie van de inlaat van de oplossing. De gestippelde zwarte lijn geeft het proximale gebied aan de buis leveren de aminozuur-oplossing (zie tekst voor meer informatie). (B) beweeglijkheid van het getoond in A tadpole) tijdens de gedrags test. Gekleurde sporen geven de positie van het dier voordat het werd (grijs) en na olfactorische stimulatie (violet). Mutaties tijdens de toepassing van de odorant oplossing worden geïllustreerd in een tijdelijke kleurverloop (30 s, rood naar blauw). (C) met behulp van X, Y-posities van de tadpole is het mogelijk om te berekenen van veranderingen in de Euclidische afstand van het hoofd tadpole bij de inlaat van de perfusie. Afstanden korter dan 8.75 mm komen overeen met het proximale gebied van de verstuiver. (D) Plot van de tijd besteed door kikkervisjes in de regio die is gedefinieerd door de stippellijn in A). Elke stip geeft een 15 s-periode. Het dier wordt aangetrokken door de odorant oplossing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Kikkervisjes worden aangetrokken door aminozuren. (A) tijd besteed door kikkervisjes in de nabijheid van de bron van de geur. Elke opslaglocatie omvat een 15 s-periode. Vak percelen vertegenwoordigt de mediaan (zwarte horizontale lijn), 25 tot en met 75% kwartielen (dozen) en gegevensbereiken (snorharen). Levering van een oplossing van 1 mM aminozuur aangetrokken kikkervisjes naar de bron van de geur. (B) kikkervisjes werden aangetrokken door de odorant oplossing wanneer de concentratie van aminozuren werd teruggebracht tot 160 μM. (C) levering van water deed dierlijk gedrag niet wijzigen. Herhaalde maatregelen ANOVA met Dunn is meerdere vergelijkingen test, p < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Temporele reactie van kikkervisjes op odorant. (A) Plot van het gemiddelde van de Euclidische afstand tot de bron van de geur als functie van de tijd. De Euclidische afstand is ingesteld op 0 voor stimulatie in elke afzonderlijke trace. Negatieve en positieve waarden geven een afname en toename van de afstand tot de bron van de geur, respectievelijk. Attractie naar de bron van de geur kan worden beschreven door een lineaire pasvorm (r2= 0,98). (B) levering van water wijzigt niet de afstand tot de bron van de geur. (C) kikkervisjes reageren op de toepassing van een 160 μM oplossing van aminozuren zoals geopenbaard door een lineaire pasvorm (r2= 0,96). (D) kikkervisjes met beide bulbus zenuwen verbeelde reageren niet op aminozuren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 : Inclusie criteria voor de olfactorische geleide gedrag assay. (A) sommige kikkervisjes Toon een resonante beweging. Dit probleem is geopenbaard door succesvolle pasvorm van een sinusoïdale functie aan de plot van de Euclidische afstand tot de bron van de geur. Kikkervisjes weergeven van deze activiteit moeten worden uitgesloten van de test. (B, C) Een manier om de variabiliteit in de gemiddelde temporele reactie op odorant (Figuur 6) is door met uitzondering van dieren die zijn gelegen aan een maximum (B) of een minimale (C) de Euclidische afstand aan het begin van de stimulatie. Rode gestippelde lijnen geven de drempelwaarde (30 mm en 5 mm). De Euclidische afstand vóór het begin van de stimulatie (pijltje, links van de percelen) is ingesteld op '0' verslag waarden aantrekkelijk of weerzinwekkende gedrag als negatieve of positieve (juiste percelen), respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Supplementary Video 1
Aanvullende Video 1: olfactorische geleide gedrag veroorzaakt door levering van een aminozuur oplossing. De film toont een tadpole vrij zwemmen op een 35 mm goed. De blauwe ellips geeft de positie van de verstuiver de odorant oplossing leveren. Het begin en einde van stimulatie worden aangegeven met groene en rode stippen, respectievelijk. Figuur 4 toont de analyse van het waargenomen gedrag. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Supplementary Video 2
Aanvullende Video 2: Tadpole motiliteit tijdens de levering van water. De film toont een tadpole vrij zwemmen op een 35 mm goed. De blauwe ellips geeft de positie van de verstuiver vrijgeven MQ water. Het begin en einde van waterlevering worden aangegeven met groene en rode stippen, respectievelijk. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit witboek beschrijft technieken die nuttig zijn voor het onderzoeken van de functionaliteit van olfactorische trajecten in levende Xenopus kikkervisjes. Het huidige protocol is vooral handig voor laboratoria die werken, of toegang hebben tot Xenopus; het is echter ook interessant voor deze onderzoekers bestuderen de cellulaire en moleculaire grondslagen van neuronale regeneratie en reparatie. Resultaten van Xenopus kunnen worden gecombineerd met gegevens die zijn verzameld in andere gewervelde modellen geconserveerde mechanismen te identificeren. De beschreven methoden zullen profiteren van de ontwikkeling van genetisch gemodificeerde Xenopus18,-22,23 en zijn van toepassing op experimentele modellen van ziekten van het zenuwstelsel van kikkervisjes24, 25.

Met het oog op een reproduceerbare in vivo gegevens, is het sleutel tot Xenopus kikkervisjes correct aan de achterkant. Met name is X.tropicalis zeer gevoelig voor slechte woonomstandigheden. Bijvoorbeeld, ze tolereren geen temperaturen lager dan 20 ° C en moeten worden bewaard in tanks of watersystemen in het bereik van 24 tot en met 28 ° C. Het is ook belangrijk niet verhogen van dierlijke dichtheid hierboven vastgestelde grenzen, regelmatig feed kikkervisjes en houden van een optimale water kwaliteit13. Beheer van dierlijke kolonies gestandaardiseerde volgendevoorwaarden is absoluut vereist zijn voor het verkrijgen van de reproduceerbaarheid van in vivo experimenten.

De beschreven methode voor calcium imaging is handig om op te sporen een juiste olfactorische transductie van ORNs in vivo. Laden van ORNs met kalk groen-1 dextran wordt bereikt door voorbijgaande permeabilization van het plasma-membraan met behulp van een lage concentratie van Triton X-100, als eerder gemeld17. Het belangrijkste voordeel van deze methode laden is eenvoud, aangezien er slechts een microinjector. Een belangrijk nadeel is dat Triton X-100 zorgt ervoor dat de tijdelijke opheffing van de olfactorische trilharen en microvilli. De olfactorische epitheel van de zebravis regenereert binnen 48 uur na behandeling17. Regeneratie in Xenopus kikkervisjes misschien zelfs sneller worden aangezien reacties op odorant 1 dag na kleurstof laden (Figuur 2D) kunnen worden waargenomen. Een gedetailleerde morfologische analyse is echter vereist om te schatten nauwkeurig het tijdstip van de regeneratie van de olfactorische epitheel na Triton X-100 behandeling.

Labelen van ORNs met kalk groen-1 dextran is alleen effectief in een populatie van neuronen, waardoor de visualisatie van de presynaptische terminals met een hoge signaal-ruis-verhouding (figuur 2B en 2 C). Het bijna volledig ontbreken van achtergrond is voordelig als in vergelijking met het laden van de hele bulbus olfactorius met AM ester vormen van calcium kleurstoffen. Het aantal fluorescerende ORNs verschilt van dier op dier. Het is dus noodzakelijk om te gebruiken een brede olfactorische stimulans van verschillende aminozuren. We hebben succesvolle resultaten met behulp van een oplossing van methionine, leucine, histidine, arginine en lysine verkregen. Andere combinaties van verschillende aminozuren kunnen ook effectief zijn. Een alternatieve methode voor het laden van ORNs met calcium indicatoren is electroporation26, waarmee grote schaal genetisch gecodeerde fluorescerende verslaggevers in tadpole neuronen27express. Electroporation kan worden gedaan met behulp van commerciële of op maat gemaakte apparatuur en kunt visualisatie van neuronale structuren met een uitstekende signal-to-noise verhouding28. Ook aan de beschreven benadering, populaties van de cel met het label zijn heterogeen en verschillen van dier op dier. Transgenese is wenselijk als het doel een gedefinieerde populatie van neuronen22onderzoekt. Bijvoorbeeld, zou de uitdrukking van genetisch gecodeerde calcium indicatoren zoals GCaMPs rijden in een beperkte groep van ORNs, zeer nuttig zijn voor het onderzoeken van de reactie van een gedefinieerde set van exocytose terminals op odorant.

De beschreven methode met behulp van calcium-groen 1 dextran meldt presynaptische terminal functie in vivo. De waarneming van intracellulair calcium verhogingen is kenmerkend voor een juiste olfactorische transductie en vrijlating van glutamaat op het niveau van de glomeruli. Kwantitatieve analyse van veranderingen in de fluorescentie is echter beperkt. Stimulatie van presynaptische terminals verhoogt intracellulair calcium niveaus aan het micromolar bereik en verzadiging van een hoge affiniteit calcium indicator zoals calcium groene rekening moet worden gehouden. Resultaten geïllustreerd in Figuur 2 zijn verkregen met behulp van widefield microscopie. Dit is de eenvoudigste aanpak en in de meeste laboratoria kan worden geïmplementeerd. Verbetering met behulp van twee-foton microscopie of genetisch gecodeerde fluorescerende verslaggevers kunnen verkrijgen meer kwantitatieve ramingen van de presynaptische functie.

Voor live beeldvorming van calcium reacties is het essentieel dat er passende positionering van het capillair de odorant oplossing leveren. Het moet zich bevinden boven de nasale capsule en Vermijd altijd direct contact met weefsel. Zowel de correcte levering van de odorant oplossing en de stroom van de perfusie moeten worden gecontroleerd alvorens de tadpole onder de Microscoop. Alle leidingen voor de perfusie gebruikt moet worden geïnspecteerd op luchtbellen. Stroom wijzigingen van het aminozuur oplossing moeten onmiddellijk reageren op opeenvolgende openen en sluiten van het magneetventiel. Vertragingen zijn indicatief voor de aanwezigheid van lucht. Het is ook wenselijk om te controleren voor de juiste volume stijgingen of dalingen van oplossing geleverd na het wijzigen van de openingstijd, dwz., van 0,1 s op 1 s of vice versa. Gebruik een lage lichtintensiteit tijdens het instellen van experimentele parameters (stap 4.6) om te minimaliseren photobleaching.

Hoewel het belang van olfaction in de biologie van kikkervisjes gevestigde29, is er een gebrek proeven olfactorische geleide gedrag in Xenopus larven direct te beoordelen. De in dit document beschreven methode is een eenvoudige test waarmee de opsporing van een reactie op een prikkel van geur in een grote populatie van dieren. De recente beschrijving van de odorant gevoeligheid van Rana catesbeiana kikkervisjes voor de aanwezigheid van chemische stoffen in water illustreert de complexe mechanismen olfaction koppelen aan motor gedrag30. De bepaling in dit artikel wordt beschreven, rekening wordt gehouden met de intrinsieke variabiliteit van olfactorische geleide gedrag in kikkervisjes. Het gebruik van een 6-well schotel in plaats van één putten verhoogt de doorvoer van de experimentele. Factoren die bijdragen tot de variabiliteit worden dergelijke basale motiliteit, de relatieve positie aan de inlaat van de perfusie en pluimen gegenereerd door de odorant oplossing overwonnen door gemiddeld veel kikkervisjes. Ongeveer 40 onafhankelijke metingen zijn vereist om te beschrijven de reactie controle aantrekkelijk voor aminozuren.

Wij stellen twee soorten analyse voor de test van de reukzin. De eerste benadering kwantificeert de tijd doorgebracht in de buurt van de bron van de geur gedurende een bepaalde periode. Het is bijzonder goed geschikt voor statistische analyse. De tweede benadering is gebaseerd op de gemiddelde plot van Euclidische afstand van de bron van de geur en is nuttig voor het beschrijven van de temporele reactie op odorant. Beide soorten analyse zijn complementair en gegenereerd door dezelfde gegevens komen. Interpretatie is binaire en onderscheidende dieren die zin odorant uit die niet10doen.

Hoe kon de beschreven methoden zijn nuttig om de Xenopus Gemeenschap? Hoewel de methoden worden in wezen voor wild-type dieren geïllustreerd, moet het rekening dat genetische mogelijkheden breiden voortdurend uit op het gebied van Xenopus worden gehouden. De gecombineerde studie van in vivo ORN reacties en de aanwezigheid van olfactorische geleide gedrag kunnen ook zeer nuttig zijn voor de juiste verwerking van olfactorische informatie in Xenopus mutanten gemaakt hetzij door forward of reverse genetische schermen onderzoeken 11. de informatie die door calcium beeldvorming en de gedrags test kan worden gecombineerd. Bijvoorbeeld, een mutatie selectief beïnvloeden submodule cellen van de bulbus olfactorius de presynaptische reactie van ORNs niet zou wijzigen maar waarschijnlijk olfactorische geleide gedrag zou schaden.

Methoden koppelen van cellulaire en gedragsmatige reacties in vivo zijn met name relevant voor de genetische dissectie van neuronale circuits. De interpretatie van de resultaten kan worden geholpen door eerdere morfologische werken, die een anatomische kaart van de glomerulaire laag in kikkervisjes31hebben verstrekt. Bulbus olfactorius segmenten van Xenopus kikkervisjes32 verkregen informatie is ook zeer waardevol. Calcium beeldvorming van mitralisklep/getuft cellen in de bulbus olfactorius segmenten is gebleken dat fundamentele kenmerken van de olfactorische verwerking in Xenopus kikkervisjes, zoals bijvoorbeeld de gevoeligheid van ORNs tot en met verschillende aminozuren33 of de relevantie van reactie latencies in codage van olfactorische informatie7. Segmenten van de hersenen blijkt echter een beperkte capaciteit te reproduceren van de complexe integratieve mechanismen associëren verschillende neuronale circuits te wijten aan het segmenteren van talrijke neuronale projecties. Ook is een karakterisering van de eigenschappen van afzonderlijke glomerulaire eenheden nog met uitzondering van de γ-glomerulus34ongrijpbaar. De vraag of afzonderlijke glomerulaire eenheden specifieke gedragingen in kikkervisjes bepalen zal alleen worden beantwoord door een combinatie van genetische hulpmiddelen, in vivo imaging benaderingen en gedrags testen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door subsidies van El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) door het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling (EFRO), gefinancierd door concurrentieonderzoek awards van de M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, de Stephen W. Kuffeler Fellowship Fonds, Laura en Arthur Colwin begiftigd zomer Fellowship onderzoeksfonds , de Fischbach Fellowship, en het grote fonds van de generatie van de mariene biologische laboratorium en de nationale Xenopus Resource RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) waar een deel van dit werk werd uitgevoerd. Wij danken ook CERCA programma / Generalitat de Catalunya voor institutionele ondersteuning. A.L. is een fellow van de Serra Húnter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) Tecniplast XPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich E10521
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) World Precision Instruments 501985
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) World Precision Instruments 501778
Whatman qualitative filter paper Fisher Scientific WH3030917
X. laevis tubb2-GFP National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFP European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiI ThermoFisher Scientific C-7001
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic ThermoFisher Scientific C-3713
Borosilicate capillaries for microinjection Sutter Instrument B100-75-10 O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.
Puller Sutter Instrument P-97
Microinjector Parker Instruments Picospritzer III
Sylgard-184 Sigma-Aldrich 761028-5EA
Microfil micropipettes World Precision Instruments MF28G-5
Upright microscope Zeiss AxioImager-A1
Master-8 stimulator A.M.P.I.
CCD Camera Hamamatsu Image EM
Solenoid valves Warner Instruments VC-6 Six Channel system
Dow Corning High Vacuum Grease VWR Scientific 636082B
Tubocurarine hydrochloride Sigma-Aldrich T2379
CCD Camera Zeiss MRC-5 Camera Controlled by Zen software
camera lens Thorlabs MVL8ML3 There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used
Epoxy resin RS Components
Manifold Warner Instruments MP-6 perfusion manifold
Micromanipulator for local delivery of solutions Narishige MN-153
Mini magnetic clamps Warner Instruments MAG-7, MAG-6
Polyethylene tubing Warner Instruments 64-0755 O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328, (5978), 633-636 (2010).
  2. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538, (7625), 336-343 (2016).
  3. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395, (6697), 37-44 (1998).
  4. Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69, (2), 273-286 (2011).
  5. Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37, (15), 4032-4045 (2017).
  6. Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
  7. Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67, (5), 872-884 (2010).
  8. Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5, (12), 2175-2186 (1980).
  9. Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48, (1), 15-24 (2006).
  10. Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525, (17), 3769-3783 (2017).
  11. Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2, (6), 91 (2006).
  12. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, (12), 835-843 (2013).
  13. Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
  16. Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317, (1), 174-186 (2008).
  17. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18, (5), 737-752 (1997).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1, (12), 1273-1276 (2012).
  19. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  20. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
  21. Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (24), 9884-9889 (2009).
  22. Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138, (24), 5451-5458 (2011).
  23. Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426, (2), 325-335 (2017).
  24. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6, (5), 1057-1065 (2013).
  25. Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11, (1), 14 (2016).
  26. Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33, (44), 17247-17252 (2013).
  27. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, (3), 583-591 (2001).
  28. Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36, (19), 5279-5288 (2016).
  29. McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
  30. Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
  31. Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489, (4), 403-424 (2005).
  32. Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26, (4), 399-407 (2001).
  33. Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123, (2), 99-107 (2004).
  34. Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35, (20), 7892-7902 (2015).
Functionele evaluatie van olfactorische trajecten in levende <em>Xenopus</em> kikkervisjes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Terni, B., Pacciolla, P., Perelló, M., Llobet, A. Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (142), e58028, doi:10.3791/58028 (2018).More

Terni, B., Pacciolla, P., Perelló, M., Llobet, A. Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (142), e58028, doi:10.3791/58028 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter