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Neuroscience

Évaluation fonctionnelle des voies olfactives chez les têtards de Xenopus vivant

doi: 10.3791/58028 Published: December 11, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Les têtards de Xenopus offrent une plate-forme unique pour étudier la fonction du système nerveux in vivo. Nous décrivons des méthodologies pour évaluer le traitement de l’information olfactive vie Xenopus larves dans des conditions normales d’élevage ou après une blessure.

Abstract

Les têtards de Xenopus offrent une plate-forme unique pour étudier la fonction du système nerveux. Ils offrent plusieurs avantages expérimentales, telles que l’accessibilité à nombreuses approches d’imagerie, des techniques électrophysiologiques et tests comportements. Le système olfactif de Xenopus têtard est particulièrement bien adapté pour étudier la fonction des synapses établis au cours du développement normal ou réformés après une blessure. Nous décrivons ici les méthodologies permettant d’évaluer le traitement de l’information olfactive dans la vie des larves de Xenopus . Nous exposons une combinaison de mesures in vivo des réponses de calcium présynaptique dans les glomérules du bulbe olfactif avec des essais de comportement olfactif guidée. Méthodes est cumulable avec la transection des nerfs olfactifs pour étudier le recâblage de la connectivité synaptique. Des expériences sont présentées à l’aide d’animaux sauvage et génétiquement modifiés exprimant des reporters de la GFP dans les cellules du système nerveux central. Application des méthodes décrites aux têtards génétiquement modifiés peut être utile pour démêler les bases moléculaires qui définissent le comportement de vertébrés.

Introduction

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Les têtards de Xenopus constituent un excellent modèle animal pour étudier la fonction normale du système nerveux. Transparence, un génome entièrement séquencé1,2et l’accessibilité aux techniques chirurgicales, électrophysiologiques et d’imagerie sont des propriétés uniques des larves de Xenopus qui permettent d’étudier les fonctions neuronales in vivo3 . Quelques-unes des multiples possibilités expérimentales de ce modèle animal sont illustrés par les études approfondies réalisées têtard les systèmes sensoriels et moteurs4,5,6. Un circuit neuronal particulièrement bien adapté pour étudier plusieurs aspects de l’information au niveau des synapses est le Xenopus têtard système olfactif7. Tout d’abord, sa connectivité synaptique est bien définie : neurones récepteurs olfactifs (Orn) projettent vers le bulbe olfactif et établir des contacts synaptiques avec les dendrites des cellules mitrales/tuffeté dans les glomérules pour générer des cartes de l’odeur. Deuxièmement, son Orn continuellement générés par neurogenèse tout au long de la vie pour maintenir le fonctionnement des voies olfactives8. Et troisièmement, parce que le système olfactif montre une grande capacité régénératrice, Xenopus têtards sont en mesure de reformer entièrement leur bulbe olfactif après ablation9.

Dans cet article, nous décrivons les approches qui combinent l’imagerie des glomérules olfactifs chez les têtards vivant avec des expériences comportementales pour étudier la fonctionnalité des voies olfactives. Les méthodes détaillées ici ont été utilisées pour étudier la récupération fonctionnelle de la connectivité glomérulaire dans le bulbe olfactif après transection de nerf olfactif10. Données obtenues chez les têtards de Xenopus sont représentatifs des vertébrés comme traitement olfactif est évolutive conservée.

Les méthodes décrites sont illustrés à l’aide de X. tropicalis , mais elles peuvent être facilement implémentées dans X. laevis. Malgré la grande taille des adultes X. laevis, les deux espèces sont remarquablement semblables au cours des étapes de têtard. Les principales différences résident au niveau génomique. X. laevis affiche les pauvre traçabilité génétique, principalement déterminée par son génome allotétraploïde et longue durée de génération (environ 1 an). En revanche, x. tropicalis est plus favorable à des modifications génétiques en raison de sa durée d’une génération plus courte (5 à 8 mois) et le génome diploïde. Les expériences représentatives sont illustrées pour animaux sauvage et trois différentes lignées transgéniques : Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) et tubb2:GFP (X. laevis).

On envisagera les méthodologies décrites dans les travaux en cours aux côtés de la génétique progresse dans le domaine de Xenopus . La simplicité et la simple mise en œuvre des techniques présentées qui les rend particulièrement utile pour l’évaluation mutants déjà décrit11, ainsi que des lignes de Xenopus générés par CRISPR-Cas9 technologie12. Nous décrivons également une intervention chirurgicale permettant de transect des nerfs olfactifs qui peuvent être implémentées dans un laboratoire ayant accès aux têtards de Xenopus . Les approches utilisées pour évaluer les réponses de calcium présynaptique et comportement olfactif guidée nécessitent des équipements spécifiques, quoique disponible à un coût modéré. Méthodes sont présentées sous une forme simple de promouvoir leur utilisation dans des groupes de recherche et marquera-t-il le début les bases de tests plus complexes en mettant en œuvre des améliorations, ou par l’association à d’autres techniques, c'est-à-dire aux approches de, histologiques ou génétiques.

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Protocol

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Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche animale à l’Université de Barcelone.

Remarque : Les têtards de X. tropicalis et X. laevis sont élevés selon les méthodes standard13,14. Eau de têtard est préparé en ajoutant des sels commerciales (voir Table des matières) à eau obtenue par osmose inverse. Conductivité est réglée à ∼700 µS et ∼1, 400 µS pour les têtards X. tropicalis et X. laevis , respectivement. Les larves peuvent être obtenus par accouplement naturel ou par fécondation in vitro,14. Les embryons sont dejellied avec 2 % de que l-cystéine préparé en sonneries modifiée de 0,1 x Marc (ROR). 1 x ROR contient (en mM) : 100 NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0.1 EDTA, pH 7,8. Les larves sont transférés après 2 – 3 jours (étape 25) aux réservoirs de 2 L d’eau de têtard. Quand les têtards atteignent étape 40 des critères Nieuwkoop-Faber (NF)15, ils sont placés dans des réservoirs de 5 litres et maintenues à une densité de 10 animaux/L. température est maintenue constante à 23 et 25 ° C et 18 à 20 ° C pour X. tropicalis et X. laevis les têtards, respectivement. Animaux trouvés à étapes 48 – 52 des critères NF sont utilisés pour des expériences.

1. transection des nerfs olfactifs

  1. Préparer une solution anesthésier de 0,02 % MS-222 dans 50 mL d’eau de têtard à température ambiante.
  2. Préparer un petit réservoir (1 à 2 L) avec têtard eau pour permettre la récupération des animaux après la chirurgie.
  3. Couper les morceaux rectangulaires de papier filtre qualitatif de cellulose (4 cm x 3 cm, voir Table des matières).
  4. Mouiller les 2 morceaux de papier filtre qualitative de cellulose en solution MS-222 0,02 % et placez-les dans le cadre de dissection.
  5. Choisir un têtard de la cuve et le plonger dans la solution anesthésier. L’animal s’arrête la natation dans les 2 à 4 min et ne réagit pas aux stimuli mécaniques appliquées au niveau de la queue à l’aide de la pince à épiler.
  6. Placez le têtard anesthésié sur le morceaux rectangulaires de papier filtre. La position de l’animal avec sa face dorsale vers le haut, donc les structures du cerveau peuvent être visualisées.
    1. À l’aide de ciseaux de vannas (voir Table des matières) coupe un ou des deux nerfs olfactifs (selon le type d’analyse à effectuer). Un seul nerf pour les expériences nécessitant un contrôle interne des lésions du nerf du transect.
    2. Pour des expériences comportementales, transect les deux nerfs afin de supprimer toutes les informations de substance odorante qui arrivent à l’ampoule olfactive. L’efficacité du sectionnement de nerfs olfactifs sont facilement observables dans le cadre de dissection ; Cependant, position de pigmentation ou un animal peut être des facteurs limitants.
      Remarque : (Facultatif) Le meilleur moyen pour certifier la validité de la procédure utilise les têtards transgéniques qui expriment les reporters fluorescents sur leur système nerveux (voir résultats représentatifs). Dans ce but, il est nécessaire d’utiliser une portée de dissection équipée de fluorescence (Figure 1). Si seulement les animaux sauvage sont disponibles, le traçage avec CM-diI peut être employée. Suivre le protocole 2 (voir ci-dessous) pour injecter une solution de 0,5 mg/mL de CM-diI préparé à 0,3 M de saccharose dans la capsule nasale. Voir 16 pour plus de détails sur la préparation et conservation des CM-diI. Fuite du colorant dans la cavité principale doit être minimiser. Dans ce but, il est nécessaire de modifier la pression d’injection et l’ouverture de micropipettes. Fluorescence au niveau de la couche glomérulaire du bulbe olfactif devient évidente 24h après l’application du CM-diI. Le présent ouvrage utilise le marquage avec CM-diI juste pour certifier la procédure transection ; Toutefois, cette méthode peut aussi servir pour obtenir des informations morphologiques des glomérules olfactifs à l’aide de méthodes histologiques conventionnelles.
  7. Transférer les animaux dans le réservoir de récupération. Les têtards devraient récupérer nage normale dans environ 10 min. effectuer une inspection minutieuse pour détecter la présence d’hémorragies, qui sont attendus dans environ 1 % des animaux soumise à la chirurgie.
  8. Euthanasier les animaux blessés dans une solution de MS-222 de 0,2 %.

2. marquage des neurones récepteurs olfactifs avec indicateurs fluorescents Calcium

  1. Préparer une solution contenant 12 % Calcium vert-1-dextran (voir Table des matières), 0,1 % Triton X-100 et 1 mM NaCl,17. Conserver la solution à-20 ° C ou à-80 ° C si c’est ne pas pour être utilisée pendant un mois.
  2. Préparer des pipettes de verre avec embout ouvertures ~ 1 à 2 µm (diamètre semblable à Microélectrodes utilisés pour des expériences de patch clamp) microinjection utilisant un micropipettes (voir Table des matières).
  3. Calibrer le volume des microinjections. À l’aide d’eau distillée, ajuster le temps de pression et d’injection afin d’obtenir des volumes d’injection de 0,15 à 0,3 µL.
    Remarque : Une méthode simple consiste à compter le nombre d’impulsions nécessaires pour vider une pipette remplie de 1 µL d’eau. Les paramètres typiques sont une pression de 30 lb/po2 et 50 ms temps d’injection.
  4. Placer une pipette dans le microinjector et le charger avec ~ 2 µL de solution de dextran vert-1 de calcium.
  5. Préparer un têtard suivant étapes 1.1 à 1.6.
  6. Déplacer l’extrémité de la pipette dans la cavité principale de la capsule nasale.
    Remarque : Voir la Figure 2A , qui décrit l’emplacement des voies olfactives dans un têtard de Xenopus.
  7. À l’aide de paramètres obtenus au point 2.3, fournir quelques bouffées. Restreindre la présence de colorant à la capsule nasale.
  8. Laissez le têtard reposer pendant 2 à 3 min. à l’aide d’une pipette Pasteur, verser des gouttes de solution MS-222 0,02 % sur les parties plus caudales de l’animal pour éviter le séchage.
  9. Transférer l’animal dans le réservoir de récupération.
    Remarque : Il devrait récupérer la natation normale dans environ 10 min. Manipulation des animaux pourrait causer des blessures.
  10. Euthanasier les têtards qui ne récupèrent pas le comportement de nage normale 15 min après l’injection à l’aide d’une solution de MS-222 de 0,2 %.
  11. Observer la fluorescence au niveau de la couche glomérulaire du bulbe olfactif le jour après l’injection.

3. préparation des têtards pour l’imagerie direct des réponses présynaptiques

  1. 24 à 48 h avant d’effectuer l’expérience, couche 4-6 boîtes de pétri de 35 mm de diamètre d’élastomère de silicone (p. ex., Sylgard). Une fois que l’élastomère a polymérisé, fabriquer un puits rectangulaire pour adapter le têtard.
    Remarque : Dimensions typiques pour les têtards X. tropicalis trouvés aux stades NF 48 – 52 sont 10 x 4 mm.
  2. Préparer 100 mL d’un 160 µM à solution d’acide aminé 1 mM agissant comme un stimulus odorants pour les têtards. La solution peut contenir un mélange de plusieurs acides aminés : méthionine, leucine, histidine, arginine et lysine. Diluer les acides aminés dans une solution de Ringer Xenopus , composé de (en mM) : 100 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2glucose 10, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7,8. Veiller à ce que le pH est maintenu à 7,8.
  3. Remplir un réservoir en hauteur avec 20 mL de la solution d’acides aminés. Raccorder le réservoir avec du polyéthylène tube dans un tube capillaire de 28 G (voir Table des matières) placée au-dessus de la capsule nasale.
    Remarque : Le tube capillaire est monté sur un micromanipulateur (voir Table des matières). Bulles d’air doivent être absents du système de perfusion.
  4. Atteindre une précision temporelle dans l’application de la solution d’acides aminés en utilisant le transistor-transistor logic (TTL) contrôle pincée d’électrovannes (voir Table des matières). Un stimulateur est utilisé pour générer des impulsions TTL (voir Table des matières). Vérifier la précision temporelle pour offrir la solution de la substance odorante en changeant la durée des impulsions TTL, c’est à dire., s de 0,1 à 1.
  5. Remplir un autre réservoir surélevé avec 100 mL de solution de Ringer Xenopus .
  6. Anesthésier un têtard et placez-le dans le cadre de dissection (étapes 1.1 à 1.6).
  7. Préparer un têtard pour l’imagerie. Si têtards albinos sont disponibles, passez à l’étape 3.9, sinon Enlevez la peau au-dessus du bulbe olfactif car il contient des mélanocytes qui nuisent à l’imagerie (étape 3,8).
    Remarque : Il y a deux façons de réaliser l’expérience selon la pigmentation de l’animal. Il est préférable d’utiliser des animaux albinos. Les souches albinos sont disponibles pour X. laevis et albino X. tropicalis lignes ont récemment été générées par CRISPR-Cas9 12 ou TALENs18.
  8. À l’aide de ciseaux de vannas, faire une incision latérale sur la peau de têtards sur le bord du système nerveux central. Il faudrait faire la coupe au niveau du bulbe olfactif et de ne jamais atteindre la position de tectum, qui peut être facilement identifié par l’emplacement du nerf optique.
  9. Pincer la peau coupée à l’aide de la pince à épiler et tirez sur le système nerveux. Suppression réussie pour vérifier l’absence de mélanocytes au-dessus du bulbe olfactif. Garder l’animal humide par coulage de gouttes de solution de MS-222 de 0,02 % à l’aide d’une pipette Pasteur.
  10. Placez le têtard dans le puits du plat enduit (voir Table des matières). Mettre une lamelle de verre recouverte d’une graisse sous vide élevée au-dessus de l’animal. Position de la lamelle couvre-objet pour couvrir le haut du tectum jusqu’au bout de la queue.
  11. Veiller à ce que le bulbe olfactif et placodes restent exposés dans le milieu extracellulaire. Le têtard garder immobile pendant la formation image. Remplir la boîte de pétri avec tubocurarine de Xenopus Ringer solutioncontaining 100 µM (voir Table des matières) pour éviter les contractions musculaires.
    Remarque : La tubocurarine est stockée en aliquotes à-80 ° C n’est plus de 6 mois.
  12. Placer le plat tenant le têtard sous un microscope vertical. Raccorder le réservoir contenant une solution de Ringer Xenopus avec le plat à l’aide de tubes en polyéthylène (voir Table des matières) pour une perfusion continue de solution de Ringer Xenopus pour maintenir l’animal en vie pour > 1 h.
    Remarque : Mini pinces magnétiques (voir Table des matières) sont très utiles pour brancher stablement tuyau au plat. Tubes de perfusion et d’aspiration doivent être situés dans l’angle ~ 180°.
  13. Commencez perfusant de Xenopus Ringer. Maintenir le niveau de la solution dans la constante plat tout au long de l’expérience. Évaluer continuellement la viabilité de têtard en observant la circulation sanguine à travers les vaisseaux.

4. vivre d’imagerie présynaptique Ca2 + changements dans les glomérules olfactifs

Remarque : La procédure d’imagerie est décrite pour la microscopie à champ large, mais pourrait être facilement adaptée à un microscope confocal en ajustant les paramètres d’acquisition. Imagerie devrait être effectué dans un microscope vertical monté sur une table anti-vibration.

  1. Visualiser le têtard avec un objectif de faible grossissement, par exemple 5 x.
  2. Déplacer les axes micromanipulateur pour placer le tube capillaire fournir la solution de la substance odorante sur le dessus une capsule nasale formant un angle de 90 ° avec le nerf olfactif. L’écoulement de la substance odorante solution au-dessus du bulbe olfactif doit être évitée car elle peut provoquer des turbulences qui dénaturent l’imagerie.
  3. Trouver le bulbe olfactif situé homolatéralement à la capsule nasale (sous réserve d’une stimulation) en utilisant un grossissement élevé, longue distance de travail, objectif à immersion d’eau : 60Xx, 0,9 N.A.
  4. Vérifier l’émission de fluorescence par oeil. Glomérulaires structures devraient être évidentes (Figure 2B).
  5. Effectuer achat direct avec un appareil approprié pour imagerie calcique. Définir une boîte contenant le bulbe olfactif ensemble, généralement de 256 x 256 ou 512 x 512 pixels. Ensemble l’acquisition de taux de trame acquisition de 20 à 40 Hz. ajuster le gain, afin que les valeurs de la fluorescence basale sont environ 20 % de saturation. Acquérir une vidéo s 5.
  6. Visualiser le film. Vérifier le focus de l’image, l’absence d’artefacts de mouvement et de régions contenant des pixels saturés. Valeurs de fluorescence typique des régions glomérulaires devraient être de 5 000 – 20 000 a.u. si vous utilisez une caméra de 16 bits. Passez à l’étape suivante si conditions d’imagerie sont optimales. Répétez l’étape 4.6 si nécessaire pour améliorer la qualité de l’image ou ajuster les réglages de gain.
  7. Démarrer une time-lapse acquisition pour enregistrer les réponses induites par les stimuli olfactifs.
    Remarque : Champ d’application de la solution de la substance odorante est contrôlée par des stimuli TTL. Une expérience typique contient une période de référence de 4 s, suivie d’une stimulation fois allant de 0,1 à 0,5 s et une période de récupération de 6 à 10 s.
  8. Effectuer des stimulations répétitives d’Odorisants pour des intervalles de temps > 2 min. régler le débit à 1 – 1,5 mL·min-1. Étant donné que la perfusion globale est activé au cours de toutes les expériences, les acides aminés appliqués localement sont délavées.
    Remarque : Le volume de solution dans le plat est ~ 3 mL.
  9. Analyse d’images
    1. Détection des réponses
      1. Exporter les films vers ImageJ.
        Remarque : L’objectif détecte la présence de régions glomérulaires en réponse à des stimuli.
      2. Transformer la séquence brute d’images de fluorescence à un film de0 ΔF/F. Mesurer les variations relatives en fluorescence basale selon la relation suivante : (F-F,0) / f0, où F0 indique les niveaux de fluorescence de base.
      3. Dessiner des régions d’intérêt (ROI) autour des zones démontrant des augmentations putatif de fluorescence au cours de la stimulation et enregistrer leur position dans le gestionnaire de ROI (Figure 2E). Dessiner un retour sur investissement pour détecter des niveaux de fluorescence de fond dans une zone dépourvue de structures glomérulaires.
    2. Quantification des réponses.
      1. Placer la ROIs définie dans la séquence brute d’images de fluorescence. Obtenir la valeur de gris moyenne des ROIs sélectionnés pour chaque image. La séquence des valeurs obtenues pour un programme d’analyse de transfert (par exemple., Igor Pro).
      2. Soustrayez la fluorescence de fond et ensuite calculer les changements de0 ΔF/F pour chaque ROI (Figure 2F). Tracer les augmentations ΔF/F0 pour chacun d'entre la ROIs sélectionné. Calculer l’écart type de basale ΔF/F0 (avant la stimulation).
        Remarque : Une réponse positive est considéré comme si des augmentations ΔF/F0 obtient au cours de la stimulation sont plus grandes que 2 écarts-types des valeurs basales.

5. test de comportement olfactives guidées

Remarque : Un schéma de l’installation pour la réalisation de l’essai est illustré à la Figure 3.

  1. Faire des petits trous pour s’adapter à 1,57 mm diamètre extérieur x 1,14 mm diamètre intérieur tube dans la partie supérieure de chaque cupule d’une boîte de 6 puits. Insérer le tuyau et le sceller à l’aide d’une colle époxy (voir Table des matières).
    Remarque : Mis à jour le plat peut être réutilisé plusieurs fois après lavage complet avec de l’eau distillée.
  2. Préparer 50 mL d’une solution d’acides aminés contenant méthionine, leucine, histidine, arginine et lysine (voir l’étape 3.2 pour plus de détails). Les concentrations varient de 160 µM à 1 mM. Dans un réservoir en hauteur, placer 20 mL de la solution.
  3. Ne pas nourrir les têtards pendant au moins 12 h avant le dosage. Prélever 6 têtards dans leur réservoir de logements et les placer dans 2 L d’eau propre têtard pour minimiser l’exposition aux substances odorantes.
  4. Placer le plat de 6 puits modifiés sur un LED-transilluminateur blanc (Figure 3).
  5. Couple des entrées de perfusion au réservoir contenant la solution d’acides aminés à l’aide d’un collecteur (voir Table des matières). Vérifier le système de perfusion et d’éliminer les bulles d’air. Remplir les 6 puits simultanément. Régler la hauteur du réservoir afin de permettre l’acheminement de ≥ 5 mL de solution de substance odorante dans les ~ 30 s.
    Remarque : Laver chaque puits de 4 fois avec l’eau bidistillée après exposition à la solution de la substance odorante.
  6. Remplir chaque bien avec 10 mL d’eau de têtard. Placez 1 têtard/puits. Laisser reposer pendant > 3 min.
  7. Mettre en place l’acquisition d’images. Utiliser une caméra CCD classique qui peut acquérir des images au moins 5 Hz. connecter la caméra à un ordinateur. Ici, utilisez une caméra Zeiss MRC5 contrôlée par logiciel Zen mais autres configurations équivalentes peuvent être utilisées. S’il est nécessaire d’augmenter la cadence, appliquer pixel binning. Images devraient montrer le plat entier 6 puits.
  8. Démarrer une acquisition d’images tels que films contiennent basale (30 s), stimulus (25 – 35 s) et périodes de récupération (30 à 60 s).
  9. Retour animaux du plat 6 puits aux réservoirs après l’imagerie.
  10. Analyser des films en utilisant des plugins tels que wrMTrck19,20 qui fournissent plusieurs paramètres associés à la motilité de ImageJ.
  11. Pour préparer les images pour l’analyse, sélectionnez d’abord un puits en dessinant un ROI rectangulaire de 35 x 35 mm (Figure 4A). Obtenir une image d’arrière-plan en calculant la projection maximale de la séquence entière. Il doit afficher une image du puits sans le têtard.
  12. Soustraire la projection maximale du film brut. Effectuer le seuillage sur le film de 32 bits généré et appliquer le plugin wrMTrck. Ajuster les paramètres de WrMTrck pour suivre efficacement les mouvements d’animaux. Transfert obtenus des coordonnées X, Y dans un programme d’analyse.
  13. X-Y à l’aide de coordonnées, calculer la distance euclidienne à la source odorante (inlet de perfusion dans le puits), en appliquant l’équation suivante :
    Equation 1
    où os indique la position de la source de l’odeur, et le tad indique la position de têtard à un moment donné. Voir Figure 4A pour plus de détails.

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Representative Results

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Dans cet article, nous présentons une combinaison des deux approches complémentaires à effectuer en vivo étude des fonctionnalités du système olfactif Xenopus têtard : J’ai) une méthode d’imagerie présynaptique Ca2 + change dans les glomérules de la vie les têtards en utilisant un indicateur calcique fluorescent et ii) une odeur guidé analyse comportementale qui peut être utilisé pour étudier la réponse spécifique Odorisants d’origine hydrique. Étant donné que ces approches ont été utilisées pour évaluer la reprise du traitement olfactif après blessure10, est décrit également une méthode simple pour sectionner les nerfs olfactifs.

Transection des voies olfactives dans Xenopus têtards
Il existe deux façons pour certifier la validité de la procédure. S’appuient sur la visualisation des nerfs olfactifs à l’aide de reporters fluorescents. Une méthode est basée sur des têtards transgéniques exprimant des protéines fluorescentes sur leur système nerveux. Deux lignes recommandées qui expriment la GFP dans un promoteur de la β-tubuline neuronale sont X. laevis tubb2b-GFP et X. tropicalis NBT-GFP (Figure 1, voir la Table des matières). Si seulement les animaux sauvage sont disponibles, CM-diI peut être utilisé (voir l’étape 1.8). La figure 1 montre les images des têtards de X. laevis tubb2-GFP. Les images sont de quatre animaux différents, où un seul nerf olfactif a été recoupée. La coupe doit être évidente selon l’étendue de la dissection. L’avantage d’utiliser des lignées transgéniques, c’est que la réforme du nerf olfactif peut être suivie sur une période de temps. Lorsque vous faites des observations séquentielles, il est recommandé de minimiser l’exposition à la lumière fluorescente pour prévenir le photovieillissement. La section d’un nerf olfactif unique est utile lorsqu’un contrôle interne est nécessaire, comme par exemple, pour comparer les unités glomérulaire normalement développés vs refaite. La section des deux nerfs olfactifs devrait être appliquée lorsque l’objectif supprime complètement la transmission des informations.

Imagerie des présynaptiques réponses aux stimuli olfactifs en direct
L’étiquetage correct des Orn avec dextran vert-1 de calcium peut être observée au niveau du bulbe olfactif (Figure 2A) au microscope widefield. Glomérules sont évidentes (Figure 2B) et devraient apparaître distribuées dans les différentes couches en déplaçant le plan focal. La morphologie des structures glomérulaires peut être mieux résolue si un microscope confocal est utilisé à la place (Figure 2C). Le nombre de glomérules étiquetées dépend sur l’absorption du colorant au niveau de l’épithélium olfactif. Par conséquent, cette procédure ne permet pas la visualisation de toutes les unités glomérulaires. Les animaux présentant une coloration plus intense de fluorescence de la région glomérulaire doivent être sélectionnés avant d’effectuer des expériences d’imagerie, car ils contiennent plus Orn étiqueté. Cette manœuvre est fortement recommandée afin d’augmenter le débit expérimental et doit être assujettie à une dissection étendue équipée d’une lampe à fluorescence. Rejeter les animaux qui ne montrent pas étiquetées unités glomérulaires ou qui montrent une fluorescence particulière dans des zones de la couche glomérulaire. Réponses2 + Ca présynaptiques peuvent être observés dès le 1 jour après le chargement de colorant. Pour mener à bien des expériences d’imagerie, il est souhaitable d’utiliser des objectifs d’ouverture numérique élevée, typiquement ≥0.9.

Élévation des taux de calcium présynaptique peuvent être évoqués à l’exposant dendritiques boutons d’Orn, d’acides aminés. Il est important de placer le tube capillaire fournir la solution de la substance odorante au-dessus de la capsule nasale. Il faut pour éviter tout contact parce qu’il pouvait obstruer l’extrémité du capillaire et/ou provoquer une stimulation mécanique d’Orn. Calcémie présynaptique des augmentations transitoires peuvent être observées pour des stimuli ≥ 0,1 s (Figure 2-D) et sont le signe d’une transduction olfactive correcte. Il est également important de visualiser le taux de calcium basal avec caméra faible gain. Les terminaisons présynaptiques d’Orn affichent les augmentations fluorescentes hautes et il est essentiel d’éviter la saturation du signal. Haute résolution temporelle peut être réalisée au microscope widefield. Par exemple, à l’aide d’une caméra CCD électron-multiplié, il est possible d’atteindre des cadences de 50 Hz ou supérieur. Utilisation de la microscopie confocale réduit la résolution temporelle, mais permet une meilleure définition des structures glomérulaires.

La forte affinité de calcium vert pour lier le calcium (190 nM) est particulièrement utile pour détecter les petites réponses. Des augmentations transitoires de calcium intracellulaire détectées dans la couche glomérulaire sont variables. Certaines régions glomérulaires montrent des changements dans ΔF/F0 ≥0.2, tandis que les processus voisins ne réagira pas encore (Figure 2D). Les facteurs suivants contribuent à la variabilité de la réponse des unités glomérulaires : i) le nombre total de glomérules étiquetées, ii) la concentration intracellulaire de calcium vert et iii) la sélectivité d’Orn pour détecter les acides aminés. Car un trop faible nombre de glomérules marqués pourrait empêcher à l’observation des réponses, il est absolument nécessaire de procéder à ces expériences avec des animaux contenant comme plusieurs libellés Orn que possible.

Comportement olfactif guidée
Analyse des données
Comportement olfactif-guidé est étudiée à l’aide d’un système sur mesure. La figure 3 montre un schéma de l’équipement utilisé pour effectuer le test. Le test repose dans la capacité des têtards pour détecter la présence d’acides aminés, qui agissent comme des substances odorantes. Une solution combinant cinq différents acides aminés (méthionine, leucine, histidine, arginine et lysine) est utilisée pour la stimulation. La solution est remises localement pendant 30 s à un 35 mm cupule contenant un têtard nage libre. La réponse immédiate des têtards à la solution entrante est une augmentation de la motilité. Mouvements aléatoires survenant au cours de la s ∼5 – 10 initial d’application de la solution sont suivis par un bain direct vers la source de substances odorantes. Têtards restent pendant plusieurs secondes dans le voisinage de la buse pendant l’accouchement d’acides aminés et progressivement récupéré la motilité dans des directions aléatoires (voir supplémentaire vidéos 1, 2).

Les conditions expérimentales décrites permettent la nage normale des étapes de têtards X. tropicalis 48-52 ; Cependant, il doit être tenu compte du fait que la motilité des animaux plus gros pourrait être restreint dans les puits 35 mm. Têtard mouvements sont enregistrés avec une caméra CCD. Attraction pour la solution de la substance odorante peut être détectée comme une réduction de la distance euclidienne séparant l’entrée de perfusion de la position de tadpole (Figure 4). Suivi des positions tête têtard dans une zone de 35 x 35 mm (ou la même taille en pixels) permet d’obtenir une analyse quantitative du comportement olfactif guidée (Figure 4A). Des parcelles individuelles de mouvements têtard sont construits à l’aide de coordonnées X-Y, obtenues par analyse d’image (Figure 4B). Les parcelles de motilité extrait doivent reproduire fidèlement les images vidéo.

Il existe deux méthodes possibles d’interpréter les expériences de comportement olfactif guidée. La première approche est inspirée sur une étude antérieure à l’aide de zebrafishes21. Mesure du temps passé dans le voisinage de la buse livrant Odorisants atteste la présence d’un tropisme positif. Une région d’intérêt de 8,75 mm de rayon (correspondant à 1/4 du diamètre du puits) centré sur l’entrée de solution, qu'il est utilisé pour classer la proximité des animaux à la source odorante (Figure 4 a, 4C). Binning le temps passé par les têtards dans le voisinage de la buse au cours de périodes définies, c'est-à-dire 15 intervalles de s, permet d’identifier la capacité à détecter des solutions d’acides aminés (Figure 4D). Le comportement global d’une population de têtards peut être obtenu en traçant la distribution des données individuelles (Figure 5A). Un tropisme positif peut être détecté lorsque la solution de méthionine, leucine, histidine, arginine et lysine est établie à 1 mM ou 160 μM (Figure 5 a et 5 b). Animaux ne répondre pas à la demande de l’eau (Figure 5C), rejetant ainsi la participation des mécanismes mécanosensibles. Différences entre les intervalles définis dans chaque groupe expérimental peuvent être établis à l’aide de non paramétrique ANOVA à mesures répétées avec des comparaisons multiples de Dunn de temps d’essai. L’inconvénient de binning données dans des intervalles de temps de 15 s est une résolution temporelle réduite.

Un moyen d’accroître l’information temporelle de la réponse comportementale est en faisant des parcelles moyennes distances euclidiennes de la source de l’odeur. Bien que les mouvements de têtard montrent une variabilité intrinsèque, la motilité moyenne d’une population d’animaux (en général au moins 40) montre le comportement olfactif guidée. Pour effectuer cette analyse, il est nécessaire de postes animale du groupe avant le début de la stimulation. Étant donné que les têtards sont trouvent à différents endroits lorsque la solution de la substance odorante entrera dans le puits, il faut régler la distance euclidienne à 0 juste avant la stimulation (Figure 6A, voir aussi les critères d’inclusion dans la Figure 7). Les valeurs positives et négatives indiquent donc une attirance ou une répulsion de la source de l’odeur, respectivement. Une attraction pour les odeurs est bien décrite par un ajustement linéaire avec ≥0.9 de coefficients de régression. Si l’eau est administrée, les variations nettes de la distance euclidienne sont réparties autour de 0 et il n’est pas possible d’installer une ligne pendant la stimulation odorante, ce qui indique l’absence d’un comportement olfactif guidée (Figure 6B). Comparaison des parcelles moyennes distances euclidiennes pour les solutions d’acides aminés préparées à 1 mM et 160 µM suggèrent différents retards dans la réponse olfactive guidée (cf. Figure 6 a et C). L’intervalle de temps nécessaire pour enclencher le mouvement vers la source de substances odorantes est plus court lorsque les acides aminés sont appliquées à une concentration plus élevée. Un manque de comportement olfactif guidée est observé chez les têtards avec les deux traversés les nerfs olfactifs (Figure 6D).

Une limitation du test comportemental olfactives guidées décrite est la mise en place des panaches de fluides complexes. Ceci peut être vu si la solution d’acides aminés est remplacée par un colorant, tels que Fast Green, lorsque vous configurez le système. L’utilisation de solutions colorées vérifie la formation de panaches et montre que les substances odorantes d’origine hydrique atteint n’importe quelle région du puits dans les Turbulences s. 5, causée par la livraison de la solution est probablement détectée par la ligne latérale des têtards et contribue probablement à la variabilité observée dans la motilité animale mais n’interfèrent pas avec le comportement guidée olfactif. Des expériences de contrôle effectués à l’aide de l’eau au lieu des solutions acides aminés révèlent que les têtards sont capables d’exercer une discrimination olfactive de stimuli mécaniques. L’estimation du temps passé dans une région d’intérêt (Figure 5) et la parcelle moyenne des distances euclidiennes (Figure 6) sont deux méthodes complémentaires pour décrire la réaction olfactive guidée des têtards.

Critères d’inclusion
Critères d’inclusion doivent également prendre en compte pour l’analyse des données. Certains têtards montrent un mouvement de résonant, qui est illustré par le raccord de l’intrigue de distances euclidiennes à une fonction sinusoïdale (Figure 7A). Les têtards affichant ce comportement doivent être jetés de toutes les analyses.

L’exclusion des animaux qui, au début de l’application de solutions odorantes sont au maximum (> 30 mm Figure 7B) ou une distance euclidienne minimale (< 5 mm, Figure 7C) de la buse permet de diminuer la variabilité des parcelles moyennes. L’exemple illustré dans la Figure 7B montre un tropisme positif pour la solution d’acides aminés. Le têtard est situé à une distance maximum de l’entrée de la solution au début de la stimulation. Par conséquent, cette position relative peut révéler seulement une attraction pour la source de l’odeur. Figure 7 C montre la situation inverse. Ici, un têtard se trouve dans les environs de la buse de livrer la solution d’acides aminés. Quantification du temps passé près de la source de l’odeur montre une réponse (méthode utilisée dans la Figure 5) ; Toutefois, il ne peut pas affiché une tendance nette vers l’entrée.

En résumé, l’analyse proposée du comportement olfactif guidée définit un test binaire. Cette méthode peut être utilisée pour détecter la capacité d’un groupe expérimental de têtards de répondre aux substances odorantes. D’autres améliorations sont nécessaires si le but est établissant des différences parmi des réponses complexes olfactives guidées, comme par exemple, déterminer des préférences pour certains les odeurs.

Figure 1
Figure 1 : Transection des nerfs olfactifs. Images représentant des têtards de X. laevis de tubb2-GFP obtenues après résection du nerf olfactif unique (flèches). Nerfs des têtards tubb2-GFP affichent forte fluorescence. Transection nerveuse est évidente immédiatement après la chirurgie (D0). Repousse du nerf olfactif est évidents 4 jours après la coupe (D4). Huit jours après la chirurgie (D8) il y a peu de différence entre le contrôle et les nerfs réformées. Les têtards ont été anesthésiés à 0,02 % MS-222 pour recueillir des images. Bulbe olfactif (O.B.), nerf olfactif (O.N.), capsule nasale (N.F.), tectum (Tec), nerf optique (Op.N.). Les flèches indiquent l’emplacement du nerf sectionnée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Marquage des neurones récepteurs olfactifs avec dextran de calcium vert et visualisation des influx de calcium présynaptique lors de la stimulation avec des acides aminés. (A) transmissibles image lumineuse d’un têtard montrant l’emplacement de l’épithélium olfactif, les nerfs olfactifs et la couche glomérulaire du bulbe olfactif. (B) l’Image d’un bulbe olfactif microscope widefield (wf). Les neurones ont été marquées par l’application de dextran vert-1 de calcium à la capsule nasale. La fluorescence observée correspond à terminaisons présynaptiques des neurones récepteurs olfactifs formant des glomérules. O.N : nerf olfactif ; O.B : bulbe olfactif. (C) section Confocal située sur le dos de l’entrée du nerf olfactif à l’ampoule. L’élément présynaptique des glomérules olfactifs a été marquée, à l’aide de dextran vert-1 de calcium, comme dans B). (D) les terminaisons présynaptiques transitoirement augmentent leur taux de calcium lors de l’exposition de l’épithélium olfactif, une solution contenant de cinq acides aminés différents. Changements relatifs de fluorescence de calcium obtenu avant, pendant et après la stimulation s 1. (E) Distribution des 10 régions différentes d’intérêt (ROIs) utilisé pour quantifier les changements de0 ΔF/F. ROI11 est à l’extérieur de la couche glomérulaire et est utilisé pour définir un niveau de fluorescence. (F) ΔF/F individuels0 responses pour ROIs définies dans E). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Test de comportement olfactif guidée. (A) schéma montrant l’équipement utilisé dans le test. (B) exemple de motilité des pistes a enregistré plus de 90 s. Chaque cercle représente une cupule contenant un seul animal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Suivi du comportement olfactif guidée. (A) exemple d’un puits utilisé pour l’analyse comportementale. Les lignes pointillées bleues indiquent l’emplacement de X, Y coordonnées (en mm) utilisé pour suivre les mouvements de tadpole (voir aussi supplémentaire vidéo 1). L’ellipse verte représente la position de l’entrée de la solution. La ligne noire pointillée indique la zone proximale au tube de livrer la solution d’acides aminés (voir le texte pour plus de détails). (B) la motilité du têtard montré a) au cours de l’analyse comportementale. Traces de couleur indiquent la position de l’animal avant (gris) et après stimulation olfactive (violet). Mouvements au cours de l’application de la solution de la substance odorante sont illustrés dans un dégradé de couleurs temporelle (30 s, rouge au bleu). (C) à l’aide de X, Y des positions de têtard il est possible de calculer les changements dans la distance euclidienne de la tête de tadpole à l’entrée de la perfusion. Distance inférieure à 8,75 mm correspondre à la zone proximale de la buse. (D) emplacement du temps passé par les têtards dans la région délimitée par la ligne pointillée à A). Chaque point indique une période s 15. L’animal est attiré par la solution de la substance odorante. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Les têtards sont attirés par les acides aminés. (A) temps passé par les têtards dans le voisinage de la source de l’odeur. Chaque emplacement comprend une période de s 15. Diagrammes en boîte représente la médiane (ligne noire horizontale), quartiles de 25 à 75 % (boîtes) et plages (moustaches) de données. Livraison d’une solution d’acide aminé de 1 mM a attiré les têtards à la source de l’odeur. (B) les têtards sont attirés par la solution de la substance odorante lorsque la concentration d’acides aminés a été réduite à 160 μM. (C) la distribution d’eau ne modifie pas le comportement animal. Les mesures répétées ANOVA avec Dunn s test de comparaisons multiples, p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Réponse temporelle des têtards à Odorisants. Terrain (A) de la moyenne distance euclidienne à la source de l’odeur en fonction du temps. La distance euclidienne est définie sur 0 avant la stimulation dans chaque trace individuel. Les valeurs négatives et positives indiquent une diminution et une augmentation de la distance à la source de l’odeur, respectivement. Attirance pour la source de l’odeur peut être décrite par un ajustement linéaire (r2= 0,98). (B) la distribution d’eau ne modifie pas la distance à la source de l’odeur. Les têtards (C) répondent à la demande d’une solution de 160 μM d’acides aminés tel que révélé par un ajustement linéaire (r2= 0,96). Les têtards (D) avec les deux traversés les nerfs olfactifs ne répondent pas aux acides aminés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Critères d’inclusion pour l’analyse de comportement olfactif guidée. Mouvement (A) certains têtards émission une résonance. Ce comportement se révèle par fit réussie d’une fonction sinusoïdale à l’intrigue de la distance euclidienne à la source de l’odeur. Les têtards affichant cette activité devraient être exclues de l’essai. (B, C) Un moyen de réduire la variabilité de la réponse temporelle moyenne aux substances odorantes (Figure 6) est en excluant les animaux situé au maximum (B) ou à une distance minimale (C) euclidienne au début de la stimulation. Les lignes pointillées rouges indiquent la valeur de seuil (30 mm et 5 mm). La distance euclidienne avant le début de la stimulation (flèche, parcelles à gauche) est réglé sur « 0 » au rapport attractives ou répulsives des comportements négatifs ou positifs valeurs (parcelles de droite), respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplementary Video 1
Supplémentaire vidéo 1 : comportement olfactif guidée déclenchée par la livraison d’une solution d’acides aminés. Le film montre un têtard nage libre sur un 35 mm bien. L’ellipse bleu indique la position de la buse de fournir la solution de la substance odorante. Le début et la fin de la stimulation sont indiqués par des points verts et rouges, respectivement. La figure 4 illustre l’analyse du comportement observé. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Supplementary Video 2
Complémentaire 2 vidéo : motilité têtard pendant la livraison de l’eau. Le film montre un têtard nage libre sur un 35 mm bien. L’ellipse bleu indique la position de la buse en libérant l’eau MQ. Le début et la fin de la livraison d’eau sont indiquées par des points verts et rouges, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

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Discussion

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Cet article décrit les techniques qui sont utiles pour étudier la fonctionnalité des voies olfactives dans vie Xenopus têtards. Le protocole actuel est particulièrement utile pour les laboratoires qui travaillent ou ont accès aux Xenopus; Toutefois, il est également intéressant pour les chercheurs qui étudient les bases cellulaires et moléculaires de la réparation et la régénération neuronale. Résultats obtenus chez Xenopus est cumulable avec les données recueillies dans d’autres vertébrés modèles afin d’identifier les mécanismes conservés. Les méthodes décrites bénéficieront du développement des organismes génétiquement modifiés Xenopus18,22,23 et sont appliquent aux modèles expérimentaux de maladies du système nerveux en têtards24, 25.

Afin d’obtenir des données in vivo reproductibles, il est essentiel pour élever correctement des têtards de Xenopus . En particulier, la X.tropicalis est très sensible aux mauvaises conditions de logement. Par exemple, ils ne tolèrent pas les températures inférieures à 20 ° C et doivent être conservés dans des réservoirs ou des systèmes d’eau de l’ordre de 24 à 28 ° C. Il est également important de ne pas augmenter la densité des animaux est au-dessus des limites établies, régulièrement nourrir les têtards et garder une qualité de l’eau optimale13. Gestion de colonies animales, suite à des conditions normalisées est absolument nécessaire pour gagner la reproductibilité des expériences in vivo.

La méthode décrite d’imagerie calcique est utile pour détecter une transduction olfactive correcte d’Orn in vivo. Chargement d’Orn avec dextran vert-1 de calcium est obtenu par transitoire perméabilisation de la membrane de plasma à l’aide d’une faible concentration de Triton X-100, comme indiqué précédemment17. Le principal avantage de cette méthode de chargement est simplicité, car il ne nécessite qu’un microinjector. Un inconvénient important est que Triton X-100 provoque l’élimination transitoire des cils olfactifs et microvillosités. L’épithélium olfactif du poisson-zèbre se régénère sous 48 h après traitement de17. Régénération chez les têtards de Xenopus pourrait être encore plus vite puisque les réponses aux substances odorantes peuvent être observés 1 jour après la teinture chargement (Figure 2D). Cependant, une analyse morphologique détaillée est nécessaire d’évaluer avec précision le temps de régénération de l’épithélium olfactif après traitement de Triton X-100.

Étiquetage Orn avec dextran vert-1 de calcium n’est efficace que dans une population de neurones, ce qui permet la visualisation des terminaisons présynaptiques avec un rapport signal sur bruit élevé (Figure 2 b et 2C). L’absence presque totale de fond est avantageux par rapport au chargement du bulbe olfactif ensemble avec formes ester AM des colorants de calcium. Le nombre d’Orn fluorescent diffère de l’animal à l’autre. Il est donc nécessaire d’utiliser un stimulus olfactif large de plusieurs acides aminés. Nous avons obtenu de bons résultats à l’aide d’une solution de méthionine, leucine, histidine, arginine et lysine. D’autres combinaisons d’acides aminés différents pourraient également être efficaces. Une autre méthode pour charger Orn avec indicateurs de calcium est électroporation26, qui est employé couramment pour exprimer génétiquement encodés reporters fluorescents en têtard neurones27. Électroporation peut se faire à l’aide d’équipement commercial ou faits sur mesure et permet la visualisation des structures neuronales avec un excellent rapport signal-bruit28. De même à l’approche décrite, les populations de cellules marquées sont hétérogènes et diffèrent d’un animal à l’autre. Transgénèse est souhaitable si le but étudie une population définie de neurones22. Par exemple, l’expression des indicateurs de calcium génétiquement encodé comme GCaMPs au volant dans un groupe restreint d’Orn, pourrait être très utile pour étudier la réponse d’un ensemble défini de terminaisons présynaptiques aux substances odorantes.

La méthode décrite à l’aide de calcium-vert 1 dextran rapports présynaptique borne fonction in vivo. L’observation de l’augmentation de calcium intracellulaire est indicative d’une transduction olfactive correcte et la libération de glutamate au niveau des glomérules. Cependant, une analyse quantitative des variations de fluorescence est limitée. Stimulation des terminaisons présynaptiques augmente les taux de calcium intracellulaire à la gamme micromolaire et saturation d’un indicateur de calcium de haute affinité comme le calcium vert doit prendre en considération. On obtient des résultats illustrées à la Figure 2 au microscope widefield. C’est l’approche la plus simple et peut être mis en œuvre dans la plupart des laboratoires. Amélioration à l’aide de la microscopie biphotonique ou reporters fluorescents génétiquement encodés pourraient permettre d’obtenir des estimations quantitatives plus de fonction présynaptique.

Pour l’imagerie direct des réponses de calcium, il est essentiel qu’il y a un positionnement approprié du capillaire fournir la solution de la substance odorante. Il doit être situé au-dessus de la capsule nasale et toujours éviter un contact direct avec les tissus. Tant l’exécution correcte de la solution de la substance odorante et le débit de la perfusion doivent être vérifiés avant de placer le têtard sous le microscope. Tous les tuyaux utilisé pour la perfusion doivent être inspecté pour les bulles d’air. Modifications du débit de la solution d’acides aminés ont immédiatement répondu à ouverture successifs et la fermeture de l’électrovanne. Des retards sont révélateurs de la présence d’air. Il est également souhaitable de vérifier le bon volume augmente ou diminue de la solution livrée après avoir changé les heures d’ouverture, c’est à dire., de 0,1 s à 1 s ou vice versa. Utilisez une faible intensité lumineuse tout en définissant des paramètres expérimentaux (étape 4,6) afin de minimiser le Photoblanchiment.

Bien que l’importance de l’olfaction dans la biologie des têtards est bien établi29, il y a un manque de tests évaluant directement olfactives guidées de comportement chez les larves de Xenopus . La méthode décrite dans le présent document est un test simple qui permet la détection d’une réponse à un stimulus d’odeur dans une large population d’animaux. La description récente de la sensibilité de l’odeur des têtards de Rana catesbeiana pour la présence de produits chimiques dans l’eau illustre les couplage olfaction à comportement moteur30des mécanismes complexes. Le test décrit dans le présent document tienne compte de la variabilité intrinsèque du comportement olfactif guidée chez les têtards. L’utilisation d’un plat de 6 puits au lieu unique puits augmente expérimentale. Facteurs contribuant à la variabilité telles motilité basale, la position relative à l’entrée de la perfusion et les panaches générés par la solution de la substance odorante sont surmontés par une moyenne de nombreux têtards. Environ 40 mesures indépendantes sont nécessaires pour décrire une réponse séduisante de contrôle pour les acides aminés.

Nous proposons deux types d’analyse pour le test de l’olfaction. La première approche quantifie le temps passé près de la source de l’odeur sur une période définie. Il est particulièrement bien adapté pour l’analyse statistique. La deuxième approche repose sur la parcelle moyenne des distances euclidiennes de la source de l’odeur et est utile pour décrire la réponse temporelle de substances odorantes. Les deux types d’analyse sont complémentaires et viennent générées par les mêmes données. L’interprétation est binaire et permet aux animaux distinctif qu’Odorisants sens de ceux qui le ne font pas10.

Comment les méthodes décrites serait utile à la communauté de Xenopus ? Bien que les méthodes sont essentiellement illustrés pour les animaux sauvage, il devrait tenir compte du fait que les possibilités génétiques sont en expansion continue dans le domaine de Xenopus . L’étude combinée des réponses ORN in vivo et la présence de comportement olfactif guidée peuvent aussi être très utiles pour étudier le traitement correct des informations olfactives chez Xenopus mutants créés soit par des écrans génétiques avant ou arrière 11. les informations fournies par l’imagerie calcique et l’analyse comportementale peuvent être combinées. Par exemple, une mutation affectant sélectivement les cellules étoilées du bulbe olfactif ne modifierait pas la réponse présynaptique d’Orn mais nuirait probablement comportement olfactif guidée.

Méthodes associant les réponses comportementales et cellulaires in vivo sont particulièrement pertinents pour la dissection génétique des circuits neuronaux. L’interprétation des résultats peut être aidée par travaux morphologiques antérieurs, qui ont fourni une carte anatomique de la couche glomérulaire en têtards31. Renseignements obtenus de tranches de bulbe olfactif de Xenopus têtards32 est également très précieux. Imagerie calcique des cellules mitrales/tuffeté dans des tranches de bulbe olfactif a révélé des caractéristiques fondamentales de traitement olfactif chez les têtards de Xenopus , comme par exemple la sensibilité d’Orn à différents acides aminés33 ou la pertinence des latences de réponse dans le codage de l’information olfactive7. Toutefois, des tranches de cerveau montrent une capacité limitée à reproduire les mécanismes d’intégration complexes associant différents circuits neuronaux en raison de la découpe de nombreuses projections neuronales. En outre, une caractérisation des propriétés des différentes unités glomérulaires est encore insaisissable à l’exception de la γ-glomérule34. La question de savoir si seule unités glomérulaires déterminer les comportements spécifiques chez les têtards sera seulement répondue en combinant des outils génétiques, imagerie in vivo des approches et des tests comportements.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO ; SAF2015-63568-R) co-financé par le Fonds européen de développement régional (FEDER), de bourses de recherche concurrentielle de la M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, le Stephen W. fonds de bourses Kuffler, Laura et Arthur Colwin doué Summer Research Fellowship Fund , la bourse de Fischbach et le grand fonds de génération du laboratoire de Biologie Marine et la National Xenopus ressources RRID:SCR_013731 (Woods Hole, Massachusetts), où une partie de ce travail a été effectuée. Nous remercions également le programme CERCA / Generalitat de Catalunya d’appui institutionnel. A.L. est un camarade de Serra Húnter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) Tecniplast XPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich E10521
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) World Precision Instruments 501985
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) World Precision Instruments 501778
Whatman qualitative filter paper Fisher Scientific WH3030917
X. laevis tubb2-GFP National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFP European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiI ThermoFisher Scientific C-7001
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic ThermoFisher Scientific C-3713
Borosilicate capillaries for microinjection Sutter Instrument B100-75-10 O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.
Puller Sutter Instrument P-97
Microinjector Parker Instruments Picospritzer III
Sylgard-184 Sigma-Aldrich 761028-5EA
Microfil micropipettes World Precision Instruments MF28G-5
Upright microscope Zeiss AxioImager-A1
Master-8 stimulator A.M.P.I.
CCD Camera Hamamatsu Image EM
Solenoid valves Warner Instruments VC-6 Six Channel system
Dow Corning High Vacuum Grease VWR Scientific 636082B
Tubocurarine hydrochloride Sigma-Aldrich T2379
CCD Camera Zeiss MRC-5 Camera Controlled by Zen software
camera lens Thorlabs MVL8ML3 There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used
Epoxy resin RS Components
Manifold Warner Instruments MP-6 perfusion manifold
Micromanipulator for local delivery of solutions Narishige MN-153
Mini magnetic clamps Warner Instruments MAG-7, MAG-6
Polyethylene tubing Warner Instruments 64-0755 O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Évaluation fonctionnelle des voies olfactives chez les têtards de <em>Xenopus</em> vivant
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Terni, B., Pacciolla, P., Perelló, M., Llobet, A. Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (142), e58028, doi:10.3791/58028 (2018).More

Terni, B., Pacciolla, P., Perelló, M., Llobet, A. Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (142), e58028, doi:10.3791/58028 (2018).

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