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Neuroscience

생활 Xenopus Tadpoles에 후 각 통로의 기능 평가

doi: 10.3791/58028 Published: December 11, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Xenopus tadpoles vivo에서 신경 시스템의 기능을 조사 하기 위해 독특한 플랫폼을 제공 합니다. 우리 생활에서 후 각 정보 처리를 평가 하는 방법론을 설명 Xenopus 애벌레 정상적인 양육 조건에서 또는 부상 후.

Abstract

Xenopus tadpoles 신경 시스템의 기능을 조사 하기 위해 독특한 플랫폼을 제공 합니다. 그들은 수많은 이미징 접근, electrophysiological 기법과 행동 분석에 대 한 접근 등 여러 실험 장점을 제공합니다. Xenopus 올챙이 후 각 시스템은 정상적인 개발 동안 또는 부상 후 개혁 시 냅 스의 기능을 조사 하는 특히 적합 합니다. 여기, 우리 생활에서 후 각 정보 처리를 평가 하는 방법론을 설명 Xenopus 애벌레. 우리는 후 각 기반 동작 분석으로 후 각 전구의 glomeruli에 연 접 칼슘 반응의 vivo에서 측량의 조합 개요. 메서드 후 각 신경 시 냅 스 연결의 rewiring 공부 transection 결합 될 수 있다. 실험은 중앙 신 경계 세포에서 GFP 기자 표현 야생-타입 및 유전자 변형 동물을 사용 하 여 표시 됩니다. 유전자 변형된 tadpoles를 설명 하는 방식의 응용 분자 기초 척추 동작을 정의 하는 분열에 대 한 유용할 수 있습니다.

Introduction

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Xenopus tadpoles 신경 시스템의 정상적인 기능을 공부 하는 우수한 동물 모델을 구성 합니다. 투명성, 완전히 시퀀스 게놈1,2, 그리고 수술, electrophysiological 및 이미징 기법에 대 한 접근은 신경 기능 vivo에서3 조사 허용 Xenopus 애벌레의 독특한 속성 . 이 동물 모델의 여러 실험 가능성의 일부 올챙이 감각 및 모터 시스템4,,56에 수행 하는 철저 한 연구에 의해 설명 됩니다. 정보 처리 시 냅 스 수준에서의 여러 측면을 연구 하는 특히 적합된 신경 회로 Xenopus 올챙이 후 각 시스템7입니다. 첫째, 그것의 시 냅 스 연결은 잘 정의 된: 후 각 수용 체 신경 (ORNs) 후 각 전구에 프로젝트 및 냄새 지도 생성 하기 위해 glomeruli 내의 셀 mitral/술의 dendrites와 시 냅 스 연락처 설정. 둘째, 그것의 ORNs 후 각 경로8의 기능을 유지 하기 위해 전 생애에 걸쳐 신생에 의해 지속적으로 생성 됩니다. 그리고 셋째, 때문에 후 각 시스템 훌륭한 재생 능력을 보여줍니다, Xenopus tadpoles 수 있습니다 완전히 절제9후 그들의 후 각 전구를 개혁.

이 논문에서 우리 생활 tadpoles에 후 각 glomeruli의 이미징 행동 실험 연구 후 각 통로의 기능을 결합 하는 방법을 설명 합니다. 여기서 설명 하는 방법은 후 각 신경 transection10후 후 각 전구에 사 연결의 기능 회복을 공부 하 사용 되었다. Xenopus tadpoles에서 얻은 데이터는 척추 동물의 진화 후 각 처리 이므로 보존.

X. tropicalis 를 사용 하 여 설명 하는 방법 exemplified 하지만 그들은 X에서 쉽게 구현할 수 있습니다. laevis. 성인 X. laevis의 더 큰 크기에도 불구 하 고 두 종의 올챙이 단계 동안 현저 하 게 유사 하다. 주요 차이점은 게놈 수준에서 상주합니다. X. laevis allotetraploid 게놈 및 긴 생성 시간 (약 1 년)에 의해 주로 결정 가난한 유전자 추적성을 표시 합니다. 반대로, tropicalis 엑스는 더 짧은 생성 시간 (5-8 개월)와 2 중 게놈 유전자 수정 의무가. 대표적인 실험 동물 야생-타입 및 3 개의 다른 유전자 변형 라인에 대 한 설명 된다: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) 및 tubb2:GFP (X. laevis).

현재 작업에 설명 된 방법론 Xenopus 필드에 유전 진행 함께 고려 되어야 한다. 단순 하 고 쉬운 구현 기술 제시의 그들이 이미 설명된 돌연변이11, CRISPR-Cas9 기술12에 의해 생성 된 Xenopus 라인 평가 하는 데 특히 유용 합니다. 우리는 또한 수술 Xenopus tadpoles에 액세스할 모든 실험실에서 구현할 수 있는 후 각 신경 transect를 사용을 설명 합니다. 연 접 칼슘 응답을 평가 하는 데 사용 하는 접근 하 고 후 각 기반 동작 임에도 불구 하 고 적절 한 비용에 사용할 수 있는 특정 장비를 요구. 방법론 연구 그룹에서 그들의 사용을 촉진 하는 간단한 형태로 제시 하 고 개선을 구현 하거나 다른 기술, 즉, 조직학 또는 유전 접근에 협회에 의해 더 복잡 한 분석의 기초를 설정할 수 있습니다.

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Protocol

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모든 절차는 바르셀로나의 대학에서 동물 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

참고: X. tropicalisX. laevis tadpoles 표준 방법13,14따라 reared 있습니다. 올챙이 물 물 역삼 여 상업 소금 ( 재료의 표참조)를 추가 하 여 준비가 되어 있습니다. 전도도 µS ∼700 및 ∼1, X. tropicalisX. laevis tadpoles에 대 한 400 µS 각각 조정 됩니다. 애벌레는 자연 교배 또는 체 외 수정에14에 의해 얻어질 수 있다. 배아는 2 %L-시스테인 준비 0.1 x 마크의 수정 Ringers (MMR)에 dejellied. MMR (mM)에 포함 하는 1 x: 100 NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0.1 EDTA, pH 7.8. 애벌레는 2-3 일 (단계 25) 후 올챙이 물 2 L 탱크 전송 됩니다. Tadpoles Nieuwkoop-페이 버 (NF) 기준15의 40 단계에 도달, 그들은 5 리터 탱크에 배치 하 고 10의 밀도 유지 동물/L. 온도 일정 하 게 유지 23-25 ° C와 18-20 ° C에서 X. tropicalisX. laevis 에 대 한 tadpoles, 각각. NF 기준의 48-52 단계에서 발견 하는 동물 실험에 사용 됩니다.

1입니다. 후 각 신경의 transection

  1. 0.02%의 anesthetizing 솔루션 준비 실 온에서 올챙이 물 50 mL에 MS-222.
  2. 수술 후 동물의 복구를 허용 하도록 물 올챙이와 작은 탱크 (1-2 패)을 준비 합니다.
  3. 셀 루 로스 질적 필터 종이 (4 cm x 3 cm, 참조 테이블의 재료)의 직사각형 조각 잘라.
  4. 0.02 %MS-222 솔루션에서 셀 룰 로스 질적 필터 종이의 2 개의 습식 및 해 범위에서 그들을 배치.
  5. 탱크에서 한 올챙이 선택 하 고 anesthetizing 솔루션에 몰입할. 동물 2-4 분 이내 수영을 중지 하 고 핀셋을 사용 하 여 꼬리 수준에서 적용 하는 기계적 자극에 반응 하지 않습니다.
  6. 필터 종이 사각형 조각에 마 취 올챙이 놓습니다. 뇌 구조를 구상 될 수 있다 그래서 그것의 등 쪽 면이 위쪽으로, 동물을 놓습니다.
    1. 욕실이 위 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 하나 또는 두 후 각 신경 (실시 하는 시험의 종류)에 따라 잘라. 신경 손상의 내부 통제를 필요로 하는 실험에 대 한 단일 신경 transect
    2. 행동 실험에 대 한 후 각 전구에 도착 하는 모든 odorant 정보를 억제 하기 위해 두 신경 transect. 후 각 신경의 단면 효율 해 범위;에서 쉽게 관찰 될 수 있다 그러나, 착 색 또는 동물 위치 요인 제한 될 수 있습니다.
      참고: (선택 사항) 절차의 타당성을 증명 하는 가장 좋은 방법은 사용 하 고 그들의 신 경계에 형광 기자를 표현 하는 유전자 변형 tadpoles (대표 결과 참조). 이 목표에 그것은 형광 (그림 1)를 갖춘 절 개 범위를 사용 해야 합니다. 야생-타입 동물을 사용할 수만 있다면 CM diI와 추적을 사용할 수 있습니다. CM-diI 코 캡슐에 0.3 M 자당에서 준비의 0.5 mg/mL 해결책 주입 프로토콜 2 (아래 참조)을 따릅니다. 준비 및 CM diI의 스토리지에 대 한 자세한 내용은 16 을 참조 하십시오. 주 구멍에서 염료의 누출을 최소화 해야 합니다. 이 목표를 사출 압력 및 micropipettes의 개통 수정할 필요가 있다. 嗅의 사 계층의 수준에서 형광 CM diI의 신청 후 분명 24 시간 된다. 현재 작업을 사용 하 여 CM diI로 그냥 인증 transection 절차; 그러나,이 방법은 또한 전통적인 조직학 절차를 사용 하 여 후 각 glomeruli의 형태학 정보를 얻기 위해 사용할 수 있습니다.
  7. 복구 탱크에 동물을 전송 합니다. Tadpoles는 일반 수영 동물의 ~ 1% 예상 된다 출혈의 존재에 대 한 주의 깊은 검사 수술 대상이 수행 ~ 10 분 이내 복구 해야 합니다.
  8. 0.2 %MS-222 솔루션에 부상된 동물 안락사

2. 형광 칼슘 지표와 후 각 수용 체 신경의 라벨

  1. 12%를 포함 하는 솔루션 준비 칼슘 녹색-1-dextran ( 재료의 표참조), 0.1% 트라이 톤 X-100, 1 mM NaCl17. 그것은 한 달 이내에 사용 하는 경우-80 ° C 또는-20 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
  2. 팁 채용 ~ 1-2 µ m (패치 클램프 실험을 위해 사용 하는 microelectrodes에 유사한 직경)와 유리 펫 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 microinjection에 대 한 준비 ( 재료의 표참조).
  3. Microinjections의 볼륨 보정. 0.15-0.3의 주입 볼륨을 얻기 위하여 압력과 주입 시간을 조정, 증류수를 사용 하 여 µ L.
    참고: 간단한 절차 1 µ L의 물으로 가득 피 펫을 빈 하는 데 필요한 펄스의 수를 계산에 구성 되어있습니다. 일반 매개 변수는 30 psi와 50 ms 주입 시간 압력.
  4. microinjector에는 피 펫을 놓고 ~ 2 µ L 칼슘 그린 1 dextran 솔루션의 함께 로드 합니다.
  5. 준비 단계 1.1 1.6 올챙이.
  6. 코 캡슐의 주요한 강에는 피 펫의 끝을 이동 합니다.
    참고: 그림 2Xenopus 올챙이에서 후 각 통로의 위치를 설명 하 참조 하십시오.
  7. 2.3에서 얻은 설정을 사용 하 여, 퍼프의 몇 가지를 제공 합니다. 코 캡슐에 염료 존재를 제한 합니다.
  8. 올챙이 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 2-3 분 휴식, 건조를 피하고 동물의 더 꼬리 부분에 0.02 %MS-222 솔루션의 방울을 부 어 보자.
  9. 복구 탱크에 동물을 전송 합니다.
    참고: 그것은 정상적인 수영을 복구 한다 ~ 10 분 내에서 동물의 조작 부상을 일으킬 수 있습니다.
  10. 0.2 %MS-222 솔루션을 사용 하 여 주입 후 정상적인 수영 동작 15 분을 복구 하지 tadpoles 안락사
  11. 주입 후 당일 嗅의 사 계층의 수준에서 형광을 관찰 합니다.

3. 연 접 응답의 라이브 이미징 Tadpoles의 준비

  1. 실험을 수행 하기 전에 24-48 h 코트 실리콘 탄성 중합체 (예: Sylgard)와 35 m m 직경의 4-6 접시. 탄성 중합체 생산은 일단은 올챙이 맞게 직사각형 잘 조작.
    참고: X. tropicalis tadpoles NF 단계 48-52에서 발견에 대 한 일반적인 크기는 10 x 4mm입니다.
  2. 1mm 아미노산 솔루션 tadpoles 위한 odorant 자극 역할 160 µ M의 100 mL를 준비 합니다. 솔루션에는 여러 가지 아미노산 혼합물 포함 될 수 있습니다: 메티오닌, 신, 히스티딘, 아르기닌, 리 진. 아미노산 (mM)에서 이루어진 Xenopus 벨의 솔루션에서을 희석: 100 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 포도 당, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7.8. 그 pH는 7.8에서 유지 됩니다 확인 하십시오.
  3. 아미노산 솔루션의 20 mL로 높은 저수지를 채우십시오. 폴 리 에틸렌과 저수지를 연결 튜브 28 G 모 세관 튜브를 코 캡슐 위에 배치 ( 재료의 표참조).
    참고: 모 세관 튜브는 micromanipulator에 마운트되어 ( 재료의 표참조). 공기 방울 결 석 해야 관류 시스템에서.
  4. 일시적인 정밀 솔레노이드 핀치 밸브 ( 재료의 표참조)의 트랜지스터-트랜지스터 논리 (TTL) 컨트롤을 사용 하 여 아미노산 솔루션 적용을 달성. 자극은 TTL 펄스 ( 재료의 표참조)을 생성 하는 데 사용 됩니다. TTL 펄스의 지속 시간을 변경 하 여 odorant 솔루션을 제공 하는 임시 정밀 검사 즉,., 0.1 ~ 1 s.
  5. Xenopus 벨의 솔루션의 100 mL에 다른 높은 저수지를 채우십시오.
  6. Anesthetize는 올챙이 고 해 범위 (단계 1.1 1.6)에서 그것을 배치.
  7. 영상에는 올챙이 준비 합니다. 흰둥이 tadpoles 사용할 수 있는 경우 3.9 단계로 진행, 영상 (단계 3.8) 손상 melanocytes을 포함 하기 때문에 그렇지 않으면 嗅 위의 피부를 제거.
    참고: 동물의 착 색에 따라 실험을 수행 하는 방법은 두 가지가 있습니다. 알 비 노 동물을 사용 하는 것이 바람직합니다. 알 비 노 변종 X. laevis 에 대 한 사용할 수 있으며 최근 흰둥이 X. tropicalis 라인 CRISPR Cas9 12 또는 TALENs18에 의해 생성 된.
  8. 욕실이 위를 사용 하 여, 중앙 신경 시스템의 가장자리에 올챙이 피부에는 측면 절 개를 확인 합니다. 확인 컷 嗅 결코 tectum, 시 신경의 위치에 의해 쉽게 확인 될 수 있습니다의 위치를 도달 하는 고 수준에서 여야 한다.
  9. 핀셋을 사용 하 여 잘라 피부를 꼬 집 고 신 경계를 통해 그것을 끌어. 후 각 전구 위에 melanocytes의 부재에 의해 성공적인 제거를 확인 합니다. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 0.02 %MS-222 솔루션의 붓는 드랍 스에 의해 동물 촉촉한 유지.
  10. 코팅된 접시의 우물에는 올챙이 배치 ( 재료의 표참조). 동물의 위 높은 진공 기름 코팅 유리 coverslip 넣어. 꼬리의 끝에 tectum의 상단을 충당 하기 위해 coverslip 위치.
  11. 유지는 후 각 전구 및 placodes extracellular 매체에 노출. 움직이지는 올챙이 이미징 동안 유지. Xenopus 벨 solutioncontaining 100 µ M tubocurarine 페 트리 접시를 채워 ( 재료의 표참조) 근육 수축 방지 하기 위해.
    참고: Tubocurarine 보다 6 개월 이상-80 ° C에서 aliquots에 저장 됩니다.
  12. 똑바로 현미경 올챙이 들고 접시를 놓습니다. 동물을 위해 살아 있는 유지 하 Xenopus 벨의 솔루션의 지속적인 관류에 대 한 폴 리 에틸렌 튜브 ( 재료의 표참조)을 사용 하는 접시와 함께 Xenopus 벨의 솔루션을 포함 하는 저수지를 연결 > 1 h.
    참고: 미니 마그네틱 클램프 ( 재료의 표참조)는 매우 안정적으로 접시에 튜브를 연결 하는 유용 합니다. 관류와 흡입 튜브 ~ 180 ° 각도에 위치 해야 합니다.
  13. Xenopus 벨의 솔루션 perfusing를 시작 합니다. 실험을 통해 요리 상수에서 솔루션의 수준을 유지 합니다. 지속적으로 혈관을 통해 혈액 순환을 관찰 하 여 올챙이 생존 능력을 평가 합니다.

4. 라이브의 연 접 캘리포니아2 + 변화 후 각 Glomeruli Imaging

참고: 이미징 절차 넓은 필드 현미경 검사 법에 대 한 설명 하지만 수 있습니다 쉽게 적응 confocal 현미경 수집 설정을 조정 하 여. 이미징 방진 테이블에 장착 하는 직 립 현미경에 실시 한다.

  1. 낮은 확대 목적으로 올챙이 시각화 예 5 배.
  2. 후 각 신경으로 90 ° 각도 형성 하는 1 개의 비 강 캡슐 상단 odorant 솔루션을 제공 하는 모 세관을 micromanipulator 축 이동 합니다. 후 각 전구 위에 odorant 솔루션의 흐름 왜곡 영상 소란 발생할 수 있기 때문에 피해 야 한다.
  3. Ipsilaterally는 높은 확대, 긴 작동 거리를 사용 하 여 (자극)에 따라 비 캡슐에 있는 후 각 전구 물 침수 목표 찾기: 60Xx, 0.9 없음
  4. 형광 방출 눈으로 확인 합니다. 사 구조는 분명 (그림 2B) 해야 합니다.
  5. 칼슘 이미징에 대 한 적합 한 카메라와 함께 라이브 수집을 수행 합니다. 일반적으로 256 x 256 또는 512 x 512 픽셀의 전체 후 각 전구를 포함 하는 상자를 정의 합니다. 설정 인수 프레임 속도 수집을 20-40 Hz. 기저 형광의 값은 채도의 ~ 20% 증가을 조정 한다. 5 s 비디오를 취득 합니다.
  6. 영화를 시각화 합니다. 이미지 포커스, 운동 유물과 포화 픽셀을 포함 하는 지역의 부재를 확인 하십시오. 16-비트 카메라를 사용 하는 경우 5000-20000 거리의 사 영역의 일반적인 형광 값 이어야 한다. 이미징 조건에 최적의 경우 다음 단계를 진행 합니다. 이미지 품질을 향상 또는 이득 설정을 조정 하는 데 필요한 경우 4.6 단계를 반복 합니다.
  7. 시간 경과 수집 후 각 자극에 의해 되 살려 진 응답을 시작 합니다.
    참고: 정확한 응용 프로그램 odorant 솔루션의 TTL 자극에 의해 제어 됩니다. 전형적인 실험 포함 4의 초기 기간 0.1에서 0.5 까지의 시간 자극 다음 s s와 6-10 s의 복구 기간.
  8. 시간 간격에 대 한 odorants의 반복적인 stimulations 수행 > 2 분 1-1.5 mL·min-1로 흐름 속도 설정. 이후 글로벌 관류에 모든 실험 중, 로컬로 적용된 아미노산 밖으로 세척 된다.
    참고: 요리에서 솔루션의 볼륨 ~ 3 mL 이다.
  9. 이미지 분석
    1. 응답의 검출
      1. ImageJ를 영화를 내보냅니다.
        참고: 목표는 사 지역 자극에 응답의 존재를 감지 하 고.
      2. 원시 일련의 δ/F0 영화를 형광 이미지를 변환 합니다. 다음과 같은 관계에 따라 기저 형광에 상대적인 변화를 측정: (F F0) /F0, F0 기준선 형광 레벨을 나타냅니다.
      3. 자극 하는 동안 상 상속 형광 증가 보여주는 일대 관심 (ROI)의 지역 그리고 ROI 관리자 (그림 2E)에서 그들의 위치를 기록. 사 구조 없는 지역에 배경 형광 레벨을 검출 하는 투자 수익을 그립니다.
    2. 응답 부 량이 고
      1. 형광 이미지의 원시 순서로 정의 ROIs를 배치 합니다. 각 프레임에 대 한 선택한 ROIs의 평균 회색 값을 구할. 분석 프로그램에 가져온 값의 시퀀스를 전송 (예:., 이고르 프로).
      2. 배경 형광을 빼기 고 각 ROI (그림 2F)에 대 한 δ/F0 변경 계산. ROIs 선택의 각 한 δ/F0 에 증가 플롯 합니다. (자극) 전에 기저 δ/F0 의 표준 편차를 계산 합니다.
        참고: 긍정적인 반응은 자극은 기저 값의 2 표준 편차 보다 큰 경우 δ/F0 에서 증가 하는 동안 간주 됩니다.

5. 후 각 기반 동작 분석 결과

참고: 분석 결과 수행 하기 위한 설치의 회로도 그림 3에 표시 됩니다.

  1. 1.57 m m 마약과 x 1.14 m m 아이디 튜브 6-잘 접시의 각의 위쪽 부분에 맞게 작은 구멍을 확인 합니다. 튜브를 삽입 하 고 에폭시 접착제를 사용 하 여 봉인 ( 재료의 표참조).
    참고: 수정 된 접시 수 재사용 여러 번 증류수와 철저 한 세척 후.
  2. 메티오닌, 신, 히스티딘, 아르기닌, 리 신 (자세한 내용은 3.2 단계 참조)를 포함 하는 아미노산 솔루션 50 mL를 준비 합니다. 농도 범위는 160 µ M에서 1 m m입니다. 높은 저수지에 솔루션의 20 mL를 배치 합니다.
  3. 분석 결과 전에 적어도 12 h tadpoles 피드 하지 마십시오. 그들의 주택 탱크에서 6 tadpoles를가지고 고 odorants에 노출을 최소화 하기 위해 깨끗 한 올챙이 물 2 L에 넣어.
  4. 백색 LED transilluminator (그림 3)에 수정된 6 웰 스 접시를 놓습니다.
  5. 포함 하는 매니폴드를 사용 하 여 아미노산 솔루션 저수지를 관류 후미 커플 ( 재료의 표참조). 관류 시스템을 확인 하 고 공기 방울을 제거. 6 우물을 동시에 입력 합니다. ~ 30 odorant 솔루션의 ≥5 mL의 배달 있도록 저수지의 높이 조정 s.
    참고: 각각 4 번 잘 더블 증류수 odorant 솔루션에 노출 후 씻어.
  6. 각 채우기 올챙이 물 10ml와 잘. 장소 1 올챙이/음. 휴식을 > 3 분.
  7. 이미지 수집을 설정 합니다. ≥5 Hz. 연결 컴퓨터에 카메라에서 이미지를 취득할 수 있는 기존의 CCD 카메라를 사용 합니다. 여기, 선 소프트웨어에 의해 제어 하는 Zeiss MRC5 카메라를 사용 하지만 다른 동일한 구성을 사용할 수 있습니다. 프레임 속도를 증가 필요한 경우 픽셀 binning 적용 됩니다. 이미지는 전체 6-잘 접시를 표시 해야 합니다.
  8. 시작 이미지 수집의 영화 포함 되도록 기저 (30 s), 자극 (25-35 s) 및 복구 (30-60 s) 기간.
  9. 화상 후 6 웰 스 접시에서 탱크 동물을 반환 합니다.
  10. ImageJ 운동에 관련 된 여러 매개 변수를 제공 하는 wrMTrck19,20 같은 플러그인을 사용 하 여 영화를 분석 합니다.
  11. 분석을 위해 이미지를 준비 하려면 먼저 35 x 35mm(그림 4)의 직사각형 ROI를 그려서 잘을 선택 합니다. 전체 시퀀스의 최대 투영을 계산 하 여 배경 이미지를 얻을. 그것은 올챙이 없이 잘의 이미지를 표시 한다.
  12. 원시 영화에서 최대 투영을 뺍니다. 생성 된 32 비트 영화에 임계 처리를 수행 하 고 wrMTrck 플러그인 적용. 안정적으로 동물의 움직임을 추적 하는 WrMTrck 매개 변수를 조정 합니다. 얻은 전송 분석 프로그램으로 X, Y 좌표.
  13. 사용 하 여 Xy 좌표를 다음 방정식을 적용 하 여 odorant 소스 (잘에서 관류 입구)에 유클리드 거리를 계산.
    Equation 1
    여기서 운영 체제 냄새 소스 위치를 나타냅니다 하 고 태 드 주어진된 시간에 올챙이 위치를 나타냅니다. 자세한 내용은 그림 4 참조 하십시오.

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Representative Results

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이 문서에서는 Xenopus 올챙이 후 각 시스템의 기능 vivo에서 연구를 수행 하기 위해 두 가지 보완 방법의 조합 소개: 나) 생활의 glomeruli 이미징 연 접 캘리포니아2 + 하는 방법 변경 tadpoles는 형광 칼슘 표시기, 및 ii를 사용 하 여) 냄새 유도 행동 분석 결과 특정 waterborne odorants에 대 한 응답을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 접근 부상10후 후 각 처리의 복구를 평가 하기 위해 고용 되어, 이후 transecting 후 각 신경에 대 한 간단한 방법은 또한 설명 합니다.

후 각 경로의 transection Xenopus tadpoles
절차의 타당성을 증명 하는 방법은 두 가지 있습니다. 둘 다 형광 기자를 사용 하 여 후 각 신경의 시각화에 의존 합니다. 한 가지 방법은 그들의 신 경계에 형광 단백질을 표현 하는 유전자 변형 tadpoles를 기반으로 합니다. 두 권장 신경 β-tubulin 발기인에서 GFP를 표현 하는 X. laevis tubb2b-GFP와 X. tropicalis NBT GFP (그림 1, 테이블의 자료를 참조). CM diI 야생-타입 동물을 사용할 수 있는 경우에 사용할 수 있습니다 (단계 1.8 참조). 그림 1 tubb2 GFP X. laevis tadpoles의 이미지를 보여준다. 이미지는 단일 후 각 신경 transected 되었다 4 개의 다른 동물에서. 컷 절 개 범위에서 명백 해야 한다. 유전자 변형 라인을 사용의 장점은 후 각 신경의 시간 동안 지켜질 수 있다입니다. 연속 관측을 하 고, photodamage를 방지 하기 위해 형광 빛에 노출을 최소화 하는 것이 좋습니다. 단일 후 각 신경의 단면 내부 제어 필요, 예를 들면, 일반적으로 개발된 vs 마켓 사 단위를 비교 하는 경우 유용 합니다. 두 후 각 신경의 단면 목표 정보의 전송을 억제 완전히는 때 적용 되어야 한다.

후 각 자극에 연 접 응답의 이미징 라이브
칼슘 그린 1 dextran와 ORNs의 올바른 레이블 widefield 현미경 검사 법을 사용 하 여 嗅그림 2(A)의 수준에서 관찰할 수 있습니다. Glomeruli 명백한 (그림 2B) 이며, 초점 비행기를 이동 하 여 여러 계층에 분산 표시 되어야 합니다. 사 구조의 형태 수 있습니다 더 나은 해결 될 confocal 현미경 대신 사용 하는 경우 (그림 2C). 레이블이 glomeruli 수 염료 통풍 관 후 각 상피의 수준에 따라 다릅니다. 따라서,이 절차는 모든 사 단위의 시각화를 허용 하지 않습니다. 더 강렬한 형광 얼룩 사 영역의 보여주는 동물 때문에 더 많은 ORNs 라는 포함 된 이미징 실험을 수행 하기 전에 선택 되어야 합니다. 이 책략 실험 처리량을 증가 하기 위하여 적극 추천 하 고 형광 램프를 장착 해 범위에서 수행 해야 합니다. 동물을 분류 사 단위를 표시 하지 않습니다 하거나 형광 사 계층의 특정 영역에 제한 보여 거부 합니다. 연 접 캘리포니아2 + 응답 대로 염색 후 1 일에서 관찰할 수 있습니다. 이미징 실험 수행에 대 한 그것은 높은 수 가늠 구멍, 일반적으로 ≥0.9의 목표를 사용 하는 것이 좋습니다.

연 접 칼슘 수준의 증가 ORNs의 아미노산에 수지상 손잡이 노출 evoked 수 있습니다. 그것은 코 캡슐 위에 odorant 솔루션을 제공 하는 모 세관을 위치 해야 합니다. 그것은 모 세관의 끝을 방해할 수 또는 ORNs의 기계적 자극을 발생 하기 때문에 접촉 하지 않도록 주의 해야 합니다. 연 접 칼슘 수준에 일시적인 증가 자극 ≥0.1 s (그림 2D)에 대 한 관찰 될 수 있다 그리고 정확한 후 각 변환의 지표. 그것은 또한 낮은 카메라 이득 기저 칼슘 수준을 시각화 하는 것이 중요입니다. ORNs의 연 접 맨끝 높은 형광 증가 표시 하 고 그것은 신호 포화를 피하기 위해 필수적입니다. 높은 시간 해상도 widefield 현미경 달성 될 수 있다. 예를 들어 전자 곱한 CCD 카메라를 사용 하 여, 그것은 50hz의 프레임 속도 얻을 수 또는 더 높은입니다. Confocal 현미경 검사 법의 사용 시간적 해상도 줄어들지만 사 구조의 더 나은 정의 허용 한다.

칼슘을 바인딩 칼슘 녹색의 높은 선호도 (190 nM) 특히 작은 응답을 감지 하는 데 유용. 사 계층에서 발견 과도 세포내 칼슘 증가 변수. 일부 사 지역 인접 프로세스에도 (그림 2D) 응답 하지 않을 수 있습니다 하는 동안 δ/F0 ≥0.2에 변화를 보여줍니다. 사 단위 응답의 다양성에 기여 하는 요소는 다음과 같습니다: i) 레이블이 glomeruli, ii) 녹색, 칼슘의 세포내 농도 및 iii) 아미노산을 검출 하기 위하여 ORNs의 선택도의 전체 수. 때문에 너무 낮은 수가 레이블이 glomeruli 응답 관찰 배제 수도 있습니다, 절대적으로 많은 가능한 ORNs 라는 포함 된 동물과이 실험 수행 필요가 있다.

후 각 기반 동작
데이터 분석
후 각 기반 동작 사용자 시스템을 사용 하 여 공부 된다. 그림 3 는 분석 결과 수행 하는 데 사용 하는 장비의 그리기 회로도 보여준다. 테스트 역할을 odorants 아미노산의 존재를 감지 하는 tadpoles의 능력에 근거한 다. 5 가지 아미노산 (메티오닌, 신, 히스티딘, 아르기닌, 리 신)를 결합 한 솔루션은 자극을 위해 사용 됩니다. 솔루션은 로컬 30 동안 전달 잘 free-swimming 올챙이 포함 하는 35 m m s. 들어오는 솔루션 tadpoles의 즉각적인 응답은 운동 성 증가. 솔루션의 응용 프로그램의 초기 ∼5-10 s 동안 발생 임의의 움직임 odorants의 소스를 향해 직접 수영 뒤에 됩니다. Tadpoles는 아미노산의 전달 중 노즐 주변 몇 초 동안 유지 하 고 점차적으로 복구 ( 보조 비디오 1, 2참조) 임의의 방향으로 운동 성.

설명 된 실험 조건 허용 X. tropicalis tadpoles 단계 48-52;의 정상적인 수영 그러나, 그것은 해야 합니다 수 고려 더 큰 동물의 운동 성 35 m m 우물에 제한 될 수 있습니다. 올챙이 움직임은 CCD 카메라와 함께 기록 됩니다. 올챙이 위치 (그림 4)에서 관류 입구를 분리 하는 유클리드 거리의 감소로 odorant 솔루션에 대 한 매력을 감지할 수 있습니다. 35 x 35 mm (또는 해당 픽셀 크기)의 영역 내에서 올챙이 머리 위치 추적 후 각 기반 동작(그림 4)의 정량 분석을 취득 수 있습니다. 올챙이의 개별 플롯 이미지 분석 (그림 4B)에 의해 얻은 X Y 좌표를 사용 하 여 구성 됩니다. 추출 된 운동 성 작 비디오 이미지 재현 충실 하 게 해야 합니다.

후 각 기반 동작 실험 해석의 두 가지 가능한 방법이 있습니다. 첫 번째 방법은 zebrafishes21을 사용 하 여 이전 연구에 영감 이다. Odorants를 제공 하는 노즐 주변에 시간 측정 긍정적인 차 있는 굴곡 운동의 존재 증거. 8.75 m m 반지름 (잘 직경의 ¼에 해당)의 관심 영역 중심 솔루션 입구 odorant 소스 (그림 4A, 4 C)에 동물의 근접을 분류 하는 데 사용 됩니다. Tadpoles는 노즐 주변에 의해 정의 된 기간 동안, 즉, 15의 간격 시간 binning 아미노산 솔루션 (그림 4D)를 감지 하는 능력을 확인 수 있습니다. 개별 데이터 (그림 5A)의 분포를 그려서 tadpoles의 인구의 전반적인 동작을 얻을 수 있습니다. 1mm 또는 160 μ M (그림 5A 5B)에서 메티오닌, 신, 히스티딘, 아르기닌, 리 신의 솔루션 준비 되었을 때 긍정적인 차 있는 굴곡 운동을 감지할 수 있습니다. 동물 물 응용 프로그램 (그림 5C), 따라서 mechanosensitive 메커니즘의 참여 취소에 응답 하지 않습니다. 던의 여러 비교 비패라메트릭 반복된 측정 ANOVA를 사용 하 여 각 실험 그룹에 정의 된 간격을 설정할 수 있습니다 하는 시간 간의 차이 테스트 합니다. 15 시간 간격으로 데이터를 범주화의 단점은 s 감소 시간적 해상도입니다.

행동 반응의 시간 정보를 증가 하는 방법 냄새 소스에서 유클리드 거리의 평균 플롯 만들기입니다. 올챙이 움직임 보여 본질적인 가변성, 동물 (일반적으로 ≥40)의 인구의 평균 운동 후 각 기반 행동 보여 줍니다. 이 분석을 수행 하려면 그것은 자극의 발병 하기 전에 그룹 동물 위치 하는 데 필요한입니다. Tadpoles odorant 솔루션 우물에 들어가면 다른 위치에서 발견 된다 유클리드 거리 자극 (그림 6A, 그림7에서 포함 기준 참고) 바로 전에 0으로 설정 하려면 필요 합니다. 음수와 양수 값 따라서 나타냅니다 매력 또는 반발 냄새 소스에서 각각. 냄새에 대 한 매력 회귀 계수 ≥0.9와 선형 적합에 의해 잘 설명 되어 있습니다. 물 배달 유클리드 거리의 순 변경 0 주위에 배포 되 고 odorant 자극, 따라서 후 각 기반 동작 (그림 6B)의 부재를 나타내는 동안 라인을 맞는 수는 없습니다. 아미노산 솔루션 1와 160 µ M에서 유클리드 거리의 평균 플롯의 비교 ( 그림 6A 와 C비교) 유도 후 각 응답에 다른 지연 제안. Odorants의 소스 쪽으로 움직임을 시작 하는 데 필요한 시간 간격 짧은 때 아미노산 높은 농도에 적용 됩니다. 후 각 기반 행동의 부족 모두 후 각 신경 transected (그림 6D)와 tadpoles에서 관찰 됩니다.

복잡 한 유체 깃털의 설명된 후 각 기반 행동 분석의 한계가 이다. 이것은 시스템을 설정할 때 아미노산 솔루션 염료, 빠른 그린 등으로 대체 하는 경우 볼 수 있습니다. 컬러 솔루션의 사용 확인 깃털의 형성 및 waterborne odorants는 솔루션의 제공으로 인 한 5 미 소란에서 잘 모든 영역에 도달 보여줍니다 tadpoles의 측면 라인에서 검색 가능성이 아마 기여 가변성에 동물 운동 성 관찰 하지만 후 각 가이드 행동을 방해 하지 않습니다. 아미노산 솔루션 대신 물을 사용 하 여 실시 하는 제어 실험 공개 tadpoles 기계적 자극에서 후 각 차별 할 수 있다. 관심 (그림 5) 영역에 유클리드 거리 (그림 6)의 줄거리는 평균 소요 시간 추정 tadpoles의 유도 후 각 응답을 설명 하기 위해 두 개의 보완 방법이 있습니다.

포함 기준
포함 기준 데이터 분석에 대 한 계정에도 촬영 해야 합니다. 일부 tadpoles 정현파 함수 (그림 7A) 유클리드 거리의 작의의 기준으로 설명 된다 공명 움직임을 보여줍니다. 이 동작을 표시 하는 tadpoles 모든 분석에서 삭제 해야 합니다.

동물을 odorant 솔루션의 응용 프로그램의 개시에서 최대의 배제 (> 30 m 그림 7Bm) 또는 최소 유클리드 거리 (< 5mm, 그림 7C) 노즐에서 가변성을 감소 하는 것을 허용 평균 구획. 그림 7B 에 나와 있는 예제 아미노산 솔루션에 대 한 긍정적인 차 있는 굴곡 운동입니다. 올챙이 자극의 발병에서 솔루션 입구의 최대 거리에 있습니다. 따라서,이 상대 위치만 냄새 소스에 대 한 매력을 밝힐 수 있다. 그림 7 C 는 반대 상황을 보여줍니다. 여기는 올챙이 아미노산 솔루션을 제공 하는 노즐 주변에 위치 해 있습니다. 시간 냄새 소스 근처의 부 량 표시 응답 ( 그림 5에 사용 된 방법); 그러나, 그것은 입구를 향해 그물 움직임을 표시할 수 없습니다.

요약 하자면, 후 각 기반 동작의 제안 된 분석 결과 이진 테스트를 정의합니다. 이 메서드는 odorants에 대응 하는 tadpoles의 실험적인 그룹의 능력을 감지 하 사용할 수 있습니다. 목표는 설정 복잡 한 유도 후 각 응답 간의 차이 등으로 주어진에 대 한 선호를 결정 하는 경우 추가 개선 필요는 냄새.

Figure 1
그림 1: Transection 후 각 신경의. Tubb2-GFP X. laevis tadpoles transection 단일 후 각 신경 (화살표)의 후 얻은의 대표 이미지. Tubb2-GFP tadpoles의 신경 강한 형광을 표시합니다. 신경 transection 수술 (D0) 후 즉시 분명 하다. 후 각 신경의 재 성장을 컷 (D4) 후 분명 4 일 이다. 수술 후 8 일 (D8) 제어 및 개혁된 신경 사이의 약간의 차이입니다. Tadpoles는 0.02%에 취 했다 MS-222 이미지 수집. 후 각 전구 (O.B.), 후 각 신경 (유기화학), 코 캡슐 (노스캐롤라이나), tectum (Tec), 시 신경 (Op.N). 화살표는 transected 신경의 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 아미노산 자극 시 연 접 칼슘 유입의 시각화와 칼슘 녹색 dextran 후 각 수용 체 신경의 라벨. (A) 후 각 상피, 후 각 신경 및 후 각 전구의 사 계층의 위치를 보여주는 올챙이의 가벼운 이미지를 전송. (B) widefield (wf) 현미경 검사 법에 의해 시각 후 각 전구를의 이미지. 신경 코 캡슐에 칼슘 그린 1 dextran의 응용 프로그램에 의해 표시 되었다. 형광 관찰 후 각 수용 체 신경 glomeruli 형성에서 연 접 맨끝에 해당 합니다. O.N: 후 각 신경; O.B: 후 각 전구입니다. (C) Confocal 섹션 dorsally 후 각 신경의 항목에서 전구에 있는. 후 각 glomeruli의 연 접 구성 요소 분류 됐다 B에서 칼슘 그린 1 dextran을 사용 하 여). (D) 연 접 맨끝 정도 5 다른 아미노산을 포함 하는 솔루션에 후 각 상피의 노출에 따라 그들의 칼슘 수준을 증가. 칼슘 형광 얻은 동안과 이후, 이전 1 s 자극의에서 상대적 변화. 10 다른 지역 관심사 (ROIs) 계량 δ/F0 변경 하는 데 사용의 (E) 배포. ROI11 사 층 외부 이며 형광의 배경 수준을 정의 하는 데 사용 됩니다. (F) 개별 δ/F0 응답 ROIs E에 정의 대 한). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 후 기반 동작 분석 결과. (A) 회로도 테스트에 사용 된 장비를 보여주는. 운동 성 트랙의 (B) 예 기록 90 s. 각 원 잘 포함 하는 하나의 동물을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 후 각 기반 행동의 추적. (A) 예를 들어 잘 행동 분석 결과 대 한 사용을 보여주는. 파란색 점선의 위치 X, Y 좌표 (mm) (참고 보조 비디오 1) 올챙이 움직임을 추적 하는 데 사용을 나타냅니다. 녹색 타원 솔루션 입구의 위치를 나타냅니다. 검은 점선된 라인 아미노산 솔루션을 제공 하는 튜브에 인접 영역을 나타냅니다 (대 한 자세한 내용은 텍스트 참조). (B) A에 표시 된 올챙이의 운동 성) 행동 분석 결과 중. 색으로 구분 된 흔적 (회색) 전에 동물의 위치를 나타내는 후 각 자극 (바이올렛) 후. Odorant 솔루션의 응용 프로그램 동안 움직임은 일시적인 색 그라데이션 (30 s, 파랑 빨강)에서 설명 됩니다. (C)를 사용 하 여 X, Y 올챙이 위치 관류 인렛에 올챙이 머리에서 유클리드 거리에 변화를 계산 가능 하다. 8.75 m m 보다 짧은 거리는 노즐의 인접 지역에 해당합니다. (D)의 줄거리 tadpoles 점선 A에 의해 정의 된 영역에서 소모 하는 시간). 각 점은 15 s 기간을 나타냅니다. 동물은 odorant 솔루션에 의해 매력입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : Tadpoles 아미노산에 매료 됩니다. (A) 시간 tadpoles 냄새 소스 주변으로 보냈다. 각 빈 15 s 기간 구성 되어 있습니다. 상자 플롯 중간값 (검은 가로줄), 25 ~ 75 %quartiles (상자), 및 데이터의 범위 (수염)를 나타냅니다. 1mm 아미노산 솔루션의 제공 tadpoles를 냄새 소스를 끌었다. 아미노산의 농도 160 μ M로 감소 되었다 때 (B) Tadpoles odorant 솔루션에 매료 되었다. (C) 배달 물의 동물 행동을 수정 하지 않았다. 반복된 측정 ANOVA 던와 여러 비교 테스트, p < 0.05의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 : Odorants tadpoles의 일시적인 응답. (A) 평균 시간의 기능으로 악취 소스에 유클리드 거리의 줄거리. 유클리드 거리는 각 개별 추적에서 자극 하기 전에 0으로 설정 되었습니다. 부정적이 고 긍정적인 값 각각 감소 및 냄새 소스에 거리의 증가 나타냅니다. 냄새 소스에 매력 선형 적합에 의해 기술 될 수 있다 (r2= 0.98). 물 (B) 배달 거리 냄새 소스를 수정 하지 않습니다. (C) Tadpoles 선형 적합에 의해 공개 아미노산의 160 μ M 솔루션의 응용 프로그램에 응답 (r2= 0.96). (D) Tadpoles transected 두 후 각 신경은 아미노산에 응답 하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7 : 후 각 기반 동작 분석 결과 대 한 포함 기준. (A) 일부 tadpoles 표시는 공 진 운동. 이 동작은 냄새 소스에 유클리드 거리의 줄거리를 정현파 함수의 성공적인 적합에 의해 드러났습니다. 이 활동을 표시 하는 tadpoles 테스트에서 제외 한다. (B, C) Odorants (그림 6)에 대 한 평균 시간 응답 가변성을 줄일 수 있는 방법 자극의 개시에 최소 (C) 유클리드 거리 또는 최대 (B)에 있는 동물을 제외 하는 것입니다. 빨간 점선 (30 m m와 5mm) 임계값 값을 나타냅니다. 유클리드 거리 자극 (화살표, 플롯을 왼쪽)의 보고서를 "0"을 설정 하기 전에 네거티브로 매력 또는 반발 행동 또는 양수 값 (오른쪽 플롯), 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Supplementary Video 1
보충 비디오 1: 아미노산 솔루션의 제공에 의해 발생 하는 후 각 기반 동작. 영화 잘 35 m m에서 자유롭게 수영 하는 올챙이 보여줍니다. 파란색 타원 odorant 솔루션을 제공 하는 노즐의 위치를 나타냅니다. 발병 및 자극의 끝 각각 녹색과 빨간색 점으로 표시 됩니다. 그림 4 는 관찰 하는 행동의 분석. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)

Supplementary Video 2
보충 비디오 2: 올챙이 운동 성 물 전달 중. 영화 잘 35 m m에서 자유롭게 수영 하는 올챙이 보여줍니다. 파란색 타원 MQ 물을 방출 노즐의 위치를 나타냅니다. 발병 및 끝 물 배달의 각각 녹색과 빨간색 점으로 표시 됩니다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)

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Discussion

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이 문서에 설명 합니다 생활에서 후 각 통로의 기능을 조사 하기 위해 유용한 기술 Xenopus tadpoles. 현재 프로토콜을 작동, 또는 Xenopus;에 접근이 그 실험실에 대 한 특히 유용 그러나, 그것은 또한 신경 재생 및 수리의 세포질과 분자 기초를 공부 하 고 그 연구에 대 한 흥미로운입니다. Xenopus 에서 얻은 결과 보존된 메커니즘을 식별 하기 위해 다른 척추 동물 모델에서 수집한 데이터와 결합할 수 있습니다. 설명 하는 방법을 유전자 변형된 Xenopus18,,2223 의 개발에서 유익 하 고, tadpoles24, 신 경계 질환의 실험 모델에 적용 되는 25.

재현할 수 vivo에서 데이터를 받으려면 제대로 Xenopus tadpoles 후면 키입니다. 특히, X.tropicalis 는 빈약한 주거 조건에 아주 과민 하다. 예를 들어 그들은 20 ° c 온도 용납 하지 않습니다 및 24 ~ 28 ° c.의 범위에서 물 시스템 또는 탱크에 보관 한다 그것은 또한 중요 하지 설립된 제한 위에 동물 밀도 증가, 정기적으로 피드 tadpoles 시키고 최적의 수 질13. 표준화 된 조건에 따라 동물 식민지의 관리는 생체 조건 실험의 재현성을 확보에 대 한 절대적으로 필요 합니다.

칼슘 이미징의 설명 방법은 ORNs의 정확한 후 각 변환 검출 하는 데 유용 vivo에서. 칼슘 그린 1 dextran와 ORNs의 로드 트라이 톤 X-100의 낮은 농도 사용 하 여 이전에 보고 된17으로 원형질 막의 일시적인 permeabilization에 의해 이루어집니다. microinjector만 필요 하기 때문에이 로드 방법의 주요 이점은 단순, 이다. 중요 한 단점은 한 Triton X-100 microvilli 후 각 속눈썹의 과도 제거 하면입니다. Zebrafish의 후 각 상피 치료17후 48 h 이내 다시 생성합니다. Xenopus tadpoles 재생 이후 odorants 응답 염료 (그림 2D) 로드 후 1 일 관찰 될 수 있다 더 빠른 수 있습니다. 그러나, 상세한 형태소 분석은 정확 하 게 트라이 톤 X-100 치료 후 후 각 상피의 재생 시간을 추정 하는 데 필요한.

ORNs 칼슘 그린 1 dextran와 라벨만 높은 신호 대 잡음 비율 (그림 2B2c)와 연 접 맨끝의 시각화 수 뉴런의 인구에서 효과적 이다. 배경의 거의 완전 한 부재 경우 오전 에스테 르 형태의 칼슘 염료 전체 嗅 로드에 비해 유리 하다. 형광 ORNs 수 동물 동물에서 다릅니다. 그것은 여러 가지 아미노산의 광범위 한 후 각 자극을 사용 하는 데 필요한 따라서입니다. 우리는 메티오닌, 신, 히스티딘, 아르기닌, 리 신의 솔루션을 사용 하 여 성공적인 결과를 얻었다. 다른 아미노산의 다른 조합을 또한 효과적일 수 있습니다. 칼슘 지표와 ORNs을 로드 하는 대체 방법이입니다 electroporation26, 널리 올챙이 신경27유전자 인코딩된 형광 기자를 표현 하는 데 사용 되는. Electroporation 행 해질 수 있다 상업 또는 주문 품 장비를 사용 하 여 및 뛰어난 신호 대 잡음 비율28와 신경 구조의 시각화 수 있습니다. 기술된 접근, 유사 하 게 표시 하는 세포 인구 이기종 이며 동물 동물에서 다. Transgenesis 목표 뉴런22의 정의 된 인구 조사는 경우 바람직합니다. 예를 들어 ORNs의 제한 된 그룹에 GCaMPs 같은 유전자 인코딩된 칼슘 지표의 식 운전, odorants에 대 한 연 접 맨끝의 정의 된 집합의 응답을 조사 하기 위해 매우 유용한 수 있습니다.

칼슘-그린 1 dextran을 사용 하 여 설명된 방법 연 접 터미널 기능 vivo에서 보고 합니다. 세포내 칼슘 증가의 관측의 정확한 후 각 변환 및 조미료 glomeruli의 수준에서의 출시 나타내는 것입니다. 그러나 형광에 변경의 정량 분석은,, 제한. 연 접 맨끝의 자극 micromolar 범위에 세포내 칼슘 수준을 증가 하 고 칼슘 녹색 같은 높은 선호도 칼슘 표시기의 채도에 고려 한다. 결과 그림 2 에 나와 있는 widefield 현미경 검사 법을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 이 가장 간단한 방법 이며 대부분 실험실에서 구현 될 수 있습니다. 두 광자 현미경을 사용 하 여 개선 하거나 유전자 인코딩된 형광 기자 수 연 접 기능 더 양이 많은 견적을 얻는.

칼슘 응답의 라이브 이미징 odorant 솔루션을 제공 하는 모 세관의 적절 한 위치는 중요 하다.입니다. 그것은 코 캡슐 위에 위치 해야 하 고 항상 조직에 직접 접촉을 하지 않도록. 모두 odorant 솔루션의 올바른 배달 및는 관류의 흐름은 현미경 올챙이 배치 하기 전에 검사 되어야 한다. 모든 튜브는 관류 용 기포 검사 해야 합니다. 아미노산 솔루션의 흐름 변화 솔레노이드 밸브의 연속 개폐에 즉시 응답 해야 합니다. 지연 공기의 존재를 나타내는 있습니다. 그것은 또한 올바른 볼륨 증가 또는 감소 솔루션의 오프닝 시간을 변경한 후 배달 확인 하는 것 즉,., 0.1에서 s 1 s 또는 그 반대로. 실험적인 매개 변수 (4.6 단계)를 설정 하는 동안 낮은 빛의 강도 사용 하 여 photobleaching를 최소화.

후각이 tadpoles의 생물학에서의 중요성은 잘 설립29, 직접 Xenopus 애벌레에서 후 각 기반 동작을 평가 하는 테스트의 부족이 이다. 이 문서에서 설명 하는 방법을 동물의 큰 인구에서 냄새 자극에 대 한 응답의 탐지를 허용 하는 간단한 테스트입니다. 물에 화학 물질의 존재에 대 한 라 catesbeiana tadpoles의 odorant 감도의 최근 설명 모터 동작30후각이 커플링 복잡 한 메커니즘을 보여 줍니다. 이 문서에서 설명 하는 분석 결과 tadpoles에 후 각 기반 행동의 본질적인 가변성 계정에 걸립니다. 단일 웰 스 대신 6-잘 접시를 사용 하 여 실험 처리량을 증가 시킵니다. 다양성에 기여 하는 요인 등 기초 운동 성, 관류 입구와 깃털 odorant 솔루션에 의해 생성 된 상대 위치 많은 tadpoles를 평균 하 여 극복. 약 40 독립 측정 아미노산에 대 한 제어 매력적인 응답을 설명 하기 위해 필요 합니다.

우리는 후각이 테스트에 대 한 분석의 두 종류를 제안합니다. 첫 번째 방법은 정의 된 기간 동안 냄새 소스 근처 소요 시간 단정. 그것은 통계 분석을 위해 특히 적합 합니다. 두 번째 방법은 냄새 소스에서 유클리드 거리의 평균 줄거리에 따라 하며 odorants에 임시 응답을 설명 하기 위해 유용 합니다. 두 가지 유형의 분석 보완와 동일한 데이터에 의해 생성 된. 통역은 이진 하며 구별 동물10하지 않는에서 그 감각 odorants

Xenopus 커뮤니티에 유용할 수 있는 방법을 설명 하는 방법? 메서드는 본질적으로 야생-타입 동물에 대 한 설명, 비록 유전 가능성 Xenopus 분야에서 지속적으로 확장 하 고 계정에 취해야 한다. Vivo에서 온 응답의 결합된 연구 및 후 각 기반 동작의 존재 또한 매우 유용할 수 있습니다 정방향 또는 역방향 유전 스크린 에 의해 만들어진 Xenopus 돌연변이에 후 각 정보의 올바른 처리를 조사 하 11. 칼슘 이미징 및 행동 분석에서 제공 하는 정보를 결합할 수 있습니다. 예를 들어 선택적으로 嗅의과 립 세포에 영향을 미치는 돌연변이 ORNs의 연 접 응답을 수정 하지 것 이라고 하지만 아마 유도 후 각 동작에 악영향을 줄 것 이다.

Vivo에서 세포 및 행동에 해당 하는 응답을 연결 하는 메서드는 특히 신경 회로의 유전 해 부에 대 한 관련. 결과의 해석은 tadpoles31사 계층의 해 부 지도 제공 하는 이전 형태학 작품에 의해 주 었 수 있습니다. Xenopus tadpoles32 의 嗅 조각에서 얻은 정보는 또한 매우 중요 합니다. 칼슘 이미징 嗅 조각에서 mitral/술 셀의 후 각 처리 Xenopus tadpoles, 예를 들면 다른 아미노산33 ORNs의 감도 또는의 관련성의 근본적인 특성을 계시 했다 응답 대기 시간 후 각 정보7의 코딩에. 그러나, 뇌 조각 수많은 신경 예측의 단면 때문에 다른 신경 회로 연결 하는 복잡 한 통합 메커니즘을 재현 하는 제한 된 용량을 표시 합니다. 또한, 개별 사 단위의 속성의 특성은 아직 γ glomerulus34제외 애매. 단일 사 단위 tadpoles에 특정 동작을 결정 하는 여부의 질문 유전 도구, vivo에서 화상 진 찰 접근 및 행동 분석을 결합 하 여만 답변 됩니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 엘 정부의 드 Economía y Competitividad (MINECO;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 SAF2015-63568-R)에 의해는 유럽 지역 개발 기금 (ERDF), M. G. F. Fuortes 기념 친교, 스티븐 W. Kuffler 친교 기금로 라와 아서 Colwin 부여 여름 연구 친교 기금에서 경쟁력 있는 연구 수상에 의해 cofunded Fischbach 친교 및 해양 생물학 연구소는 국가 Xenopus 리소스 RRID:SCR_013731 (나무 구멍, MA)이이 작품의 일부 실시 했다의 위대한 세대 기금. 우리는 또한 검색 프로그램 감사 / Generalitat 드 Catalunya 제도적 지원에 대 한. 앨 러 배 마 세라 Húnter 연구원 이다입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) Tecniplast XPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich E10521
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) World Precision Instruments 501985
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) World Precision Instruments 501778
Whatman qualitative filter paper Fisher Scientific WH3030917
X. laevis tubb2-GFP National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFP European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiI ThermoFisher Scientific C-7001
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic ThermoFisher Scientific C-3713
Borosilicate capillaries for microinjection Sutter Instrument B100-75-10 O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.
Puller Sutter Instrument P-97
Microinjector Parker Instruments Picospritzer III
Sylgard-184 Sigma-Aldrich 761028-5EA
Microfil micropipettes World Precision Instruments MF28G-5
Upright microscope Zeiss AxioImager-A1
Master-8 stimulator A.M.P.I.
CCD Camera Hamamatsu Image EM
Solenoid valves Warner Instruments VC-6 Six Channel system
Dow Corning High Vacuum Grease VWR Scientific 636082B
Tubocurarine hydrochloride Sigma-Aldrich T2379
CCD Camera Zeiss MRC-5 Camera Controlled by Zen software
camera lens Thorlabs MVL8ML3 There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used
Epoxy resin RS Components
Manifold Warner Instruments MP-6 perfusion manifold
Micromanipulator for local delivery of solutions Narishige MN-153
Mini magnetic clamps Warner Instruments MAG-7, MAG-6
Polyethylene tubing Warner Instruments 64-0755 O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.

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생활 <em>Xenopus</em> Tadpoles에 후 각 통로의 기능 평가
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Terni, B., Pacciolla, P., Perelló, M., Llobet, A. Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (142), e58028, doi:10.3791/58028 (2018).More

Terni, B., Pacciolla, P., Perelló, M., Llobet, A. Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (142), e58028, doi:10.3791/58028 (2018).

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