Flow cytometric analyse har vist sig værdifuld for undersøger renkulturer og overvågning af mikrobielle samfund dynamics. Vi præsenterer tre omfattende arbejdsprocesser, prøveudtagning til analyse af data, for renkulturer og komplekse samfund i klare medium såvel som i udfordrende matricer, henholdsvis.
Undersøgelsen af renkulturer og overvågning af mikrobielle samfund dynamics er afgørende for at forstå og styre naturlige økosystemer og tekniske anvendelser drevet af mikroorganismer. Næste generation sekventering metoder er almindeligt brugt til at løse microbiomes, men de er generelt ressourcen og tiden intensivt og levere det meste kvalitative oplysninger. Flow cytometric microbiome analyse ikke lider under disse ulemper og kan give relative subcommunity mængder og absolut celle numre på linje. Selv om det ikke levere direkte fylogenetiske oplysninger, kan det forbedre analyse dybde og opløsning af sekventering metoder. I skarp kontrast til medicinske anvendelser i både forskning og rutinemæssig indstillinger, er flowcytometri stadig ikke meget udbredt for microbiome analyse. Manglende oplysninger om prøven forberedelse og data analyse rørledninger kan oprette en adgangsbarriere for forskere udfordringer microbiome analyse, vil ofte være lærebog flow flowcytometri applikationer. Her præsenterer vi tre omfattende arbejdsgange for renkulturer, komplekse samfund i klart medium og komplekse samfund i udfordrende matricer, henholdsvis. Vi beskriver enkelte stikprøver og fiksering procedurer og optimeret farvning protokoller til de respektive prøve sæt. Vi uddybe cytometric analyse med en kompleks forskning centreret og en ansøgning fokuseret bænken øverste enhed, beskrive cellen sortering fremgangsmåde og foreslår data analyse pakker. Vi desuden foreslå vigtige eksperimentelle kontrol og anvende de præsenterede arbejdsprocesser til de respektive prøve sæt.
Mikroorganismer spiller en afgørende rolle i mange aspekter af menneskers live. De er de vigtigste biotiske faktorer af planeter kulstof, kvælstof, fosfor og svovl cykler1og fungere som nedværdigende2,3 samt syntese4 biokatalysatorer i forskellige industrier, såsom spildevandsrensning 5 eller bioteknologi-6. De udgør selv den human microbiome, som direkte påvirker menneskers sundhed og stofskifte7,8. Oplysninger om struktur og funktion og dynamiske opførsel af mikroorganismer, som svar på deres nærområder, er derfor nødvendigt, hvis vi skal forstår fuldt ud og manipulere disse systemer. Næste generation sequencing (NGS) er den etablerede teknologi til at løse microbiome struktur og funktion9. Analyse og evaluering af NGS data kan ikke give kvantitative oplysninger, og er stadig dyrt, tidskrævende og på ingen måde klar til at levere on-site resultater inden for ydeevne korridorer. Nogle bakterier vise generation tider under 1 h og forårsage konstant skiftende Fællesskabets strukturer i visse miljøer10. Efter sådanne dynamik, ville ved hjælp af sekventering metoder overstige mest videnskabelige labs finansielle og arbejdsstyrke kapacitet.
Derimod kan flowcytometri give Fællesskabet fingeraftryk svarende til NGS data, samtidig bevare en højere tid, arbejdskraft og omkostninger effektivitet. Vi præsenterer her, flow cytometric teknikker kan følge mikrobielle samfund dynamics på linjen på det enkelte celle niveau. I modsætning til NGS, flowcytometri giver ikke fylogenetiske tilhørsforhold eller oplysninger om funktionelle gener, men leverer kvantitative celle numre. Bruger flowcytometri, kan mikrobielle samfund løses i subcommunities med særskilte lysspredningen og fluorescens egenskaber (forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) giver indikationer af Cellestørrelse og granulering, henholdsvis). Den præsenterede tilgang udnytter overvejende celle størrelse – og DNA beløb relaterede oplysninger, der er knyttet til bestemte celletyper og fysiologiske (vækst) stater. DNA indhold kvantificeres ved hjælp af UV-overgearet 4′, 6-diamidino-2′-phenylindole (DAPI) farvestof, der bindes til A-T rige regioner af DNA og kan selv løse forskellige kromosomale niveauer. Ved at kombinere DAPI fluorescens og FSC kan mere end 50 subcommunities udmærkede og overvåges for at ændre mængder over tid11. Subcommunity overflod variationer kan være korreleret med ændringer i de mikro-miljømæssige omgivelser, såsom pH og produkt titers12, med globale parametre, såsom vejr13,14, eller i tilfælde af gut eller spyt microbiomes med visse medicinske behandlinger15. Disse korrelationer afsløre centrale subcommunities ansvarlig for særlige funktioner i den metaboliske netværk i hele Fællesskabet. De centrale subcommunities kan derefter specifikt forfremmet eller undertrykt ved at ændre de omkringliggende mikro-miljøer, eller sorteret for efterfølgende sekventering15 eller proteom undersøgelse16.
Men mikrobielle samfund flowcytometri er ikke endnu bredt etableret på grund af en forholdsvis lav antal flow cytometric enheder i stand til at løse mikrobielle populationer eller Fællesskaber korrekt. Endvidere kan manglen erfaring, Fællesskabets analyse rørledninger og effektiv datavurdering udgøre en adgangsbarriere for forskere microbiome analyse udfordringer. Vi har etableret omfattende arbejdsprocesser for at løse disse problemer. For at illustrere deres almene gyldighed, vil vi præsentere dem på tre eksemplariske prøve sæt (supplerende fil 1-S1), nemlig jeg) en ren kultur (PC) for bioteknologiske applikationer vokset i definerede klart medium (Pseudomonas putida KT 2440 på glukose), ii) en kompleks lab Fællesskabet i klare medium (aktiveret slam Fællesskabet (ASC) i syntetisk spildevand) og iii) et kompleks samfund fra naturlige miljøer i en tætte matrix (biogas Fællesskabet (BC) i majsensilage).
Flere faktorer påvirke protokol valg for hver af disse prøve sæt. Dyb indefrysning afkald på brugen af giftige kemikalier, men er for det meste begrænset til lab miljøer på grund af brugen af flydende nitrogen for chok frosting. Formaldehyd stabilisering og efterfølgende ethanol fiksering tillader bulk prøvetagning uden behov for alikvot forberedelse og har vist sig for at være stabilt over lange perioder. Protein-rige prøver såsom humant spyt15 kan dog problematisk, fordi protein flocs, denaturized af formaldehyd, kan forårsage ugunstige signal til støj forhold. Prøven tørring vil tage mest tid (ca. 1 time i alt) procedurerne i denne sammenligning, men kan udføres på stedet uden giftige kemikalier. Det giver stabile pellets i rør, som nemt kan sendes uden køling eller yderligere fare forholdsregler. Derudover har masser af alternative fiksering metoder blevet foreslåede11. Vi anbefaler for at teste opløsning og fiksering stabilitet af forskellige protokoller, når vi indfører et nyt sample sæt.
Vi brugte to forskellige flow cytometers til at analysere sæt: i) et meget sofistikeret og dyrt, forskning centreret celle sorteringsanlæg og ii) en ansøgning fokuseret bænk top analyzer, som synes at være mere passende for on-site program5. F.kr blev målt med bænk top analyzer, mens PC og ASC blev målt med celle sorteringsanlæg. Analysen af de tre eksemplarisk eksempel indstiller kræves forskellige procedurer for optimeret reproducerbarhed, prøve stabilitet og workflow bekvemmelighed. Følgende protokol vil angive afsnittene for de tre forskellige systemer.
En vellykket analyse af mikrobielle populationer og samfund kræver godt tunet cytometers, et passende valg af celle parametre og en pålidelig arbejdsproces fra prøveudtagning og fiksering til måling og data evalueringen. Markerede celle parametre skal se de tilgængelige excitation bølgelængder. Vi bruger og anbefaler DAPI, som er meget følsomme ved lave koncentrationer; men skal være ophidset af en UV-laser, der ikke består normalt i standard forskellige set-ups. Andre farvestoffer, såsom SYBR Green jeg, også pletten hele befolkninger eller samfund men generelt levere ringere resolutioner. Vi anbefaler ikke brug af fisk procedurer eller levedygtighed test i mikrobielle samfund. Disse tilgange er umuligt at kvantificere, kontrollere og styre, fordi deres virkninger på enkelte arter i Fællesskabet er usikker. De kan ikke pålideligt testet, så længe en betydelig andel af de typiske Fællesskaber er stadig ikke tilgængelig som en ren kultur.
Kritiske trin i protokollen omfatte prøvetagnings-og fiksering samt celle sortering. Prøvetagningen kan blive kompliceret af tendensen af visse renkulturer og mikrobielle samfund til at aggregere til flocs eller overholde partikler af prøvematrixen. Det er vigtigt at sprede disse aggregater og separate celler i en prøve før at indføre dem til flow cytometric analyse til at sikre pålidelige resultater. Protokollerne præsenteres forberedelse var optimeret for at aktivere enkelt celle analyse. En sidste 50 µm filtrering er udført før måling til at fjerne enhver resterende aggregater og forhindre 70 µm dysen af celle sorteringsanlæg og flow kuvette af Analyseværktøjet fra tilstopning. Celle flocs fra renseanlæg er især rigelige, robust og vitale funktion af systemet. Vi undersøgte de planktoniske og slam baseret mikrobielle samfund i forskellige tanke af et fuldskala renseanlæg, til at teste den etableret protokol. Slammet danner celle aggregater var klart spredes og Fællesskabets sammensætning forblev stabil. Derudover udstillet planktoniske og slam-baseret samfund bemærkelsesværdig lighed mellem dem i alle tre stikprøven tanke (figur 8, supplerende fil 1-S10). Disse resultater blev kontrolleret af sammenlignende 16S rDNA-amplikon sekventering af en frisk-, en formaldehyd behandlede-, en formaldehyd og ethanol fikseret-, og sorterede prøve10. Ikke desto mindre kan særdeles udfordrende miljøprøver, som stærke biofilm og bakterier vokser i tæt forbundne kæder, være umuligt at sprede. Jordprøver kan være særligt problematisk, som de allestedsnærværende partikler vises i histogrammet og kan sløre cellerne af lutter overflod. I sådanne tilfælde skal traditionelle sekventering metoder anvendes.
Fiksering stabilitet af hver ny prøve sæt skal testes før designe eksperiment at sikre resultatet gyldighed. God fiksering stabilitet muliggør også poolede farvning og måling af flere eksempelpunkterne for tiden på en enkelt dag. Det giver desuden replikering målinger og retrospektiv celle sortering af afgørende tidspunkter efter konklusion og afsluttende evaluering af forsøget. Fiksering stabilitet af ren kultur blev bekræftet over 28 dage (figur 9). For on-site eksperimenter herunder prøve transport, bør fiksering stabilitet testes over længere perioder (i dette tilfælde 60 dage for Fællesskabets aktiveret slam 195 dage for Fællesskabets biogas, supplerende fil 1-S9).
Farvning er normalt ikke problematisk, men skal styres med en biologisk standard at tillade anvendelsen af bioinformatic evalueringsværktøjer. Vi brugte den forlorne stamme E. coli BL21 (DE3), som blev fikseret efter ASC protokol og oplagret til brug i alle farvning batch.
Bortset fra DAPI, SYBR Green jeg har været anvendt med succes til at løse mikrobielle samfund for flere år14,23,24,25,26. SYBR Green jeg kan løse Fællesskaber i høj- og lav nukleinsyre undersæt (HNA og LNA) ved hjælp af levende celler i en online modus. DAPI, men er mere specifik i sin binding til DNA og gør det muligt at skelne mellem over 50 subcommunities i én prøve sæt men kræver en fiksering skridt før farvning.
Celle sortering er et fremragende træk ved denne tilgang og kan anvendes, hvis visse subcommunities er yderligere interesse. Det skal understreges, at hverken PFA-(udført for kun 30 min) eller ethanol behandling eller DAPI farvning10 havde en negativ virkning på efterfølgende 16S amplikon sekvensering. Potentielle påvirkninger af fiksering og farvning procedurer på subcommunity metagenome analyser stadig nødt til at blive testet.
En masse oplysninger om Fællesskabets funktioner og trend dynamik kan opnås uafhængigt af den sortering tilgang når de vedrører bioinformatik værktøjer, der kan løse community funktionerne på en virtuel celle ved celle niveau og forbinde disse funktioner med abiotiske parametre.
For nylig en række nye Bioinformatik evalueringsværktøjer, alle nyttige for både SYBR grøn jeg og DAPI tilgange, er blevet udviklet for at løse cytometric Fællesskabet mønstre. Disse er FlowFP27, pakker anvendes i denne undersøgelse (flowCHIC20, flowCyBar28), en deconvolution model etableret med ferskvand Fællesskaber29 og et værktøj bruges til at diskriminere stammer ifølge deres fysiologiske egenskaber30. Derudover cytometric mangfoldighed kan være beslutsom25 og endda stabilitet egenskaber af mikrobielle samfund kan nu følges op med en online-værktøj10.
Således har flow cytometric analyser en kæmpe fordel, når det kommer til hurtig evaluering af mikrobielle samfund og mulige abiotiske parameter korrelationer. Der er dog stadig begrænsninger til metoden. Det kan ikke anvendes virkelig online med værktøjet flowCyBar, på grund af den erfarne baserede gate indstilling procedure. Desuden, ville udviklingen af skræddersyede, let at bruge flow cytometers stærkt videre spredning af flow cytometric microbiome analyse tilgang. Første skridt i denne retning er gennemført28.
Fremtidige anvendelser af mikrobielle flowcytometri kan forestillede i mikrobiel økologi, da det giver mulighed for høj frekvens overvågning inden for rækkevidde af bakteriel generation gange og det har vist sig at økologiske paradigmer er gældende for cytometric data5 ,10. Metoden er meget nyttigt for rutinemæssige screeninger af naturlige miljøer som obligatorisk drikkevand kontrolelementerne i Schweiz31. Det kan også være et værdifuldt redskab til medicinske applikationer som menneskelige15 eller animalske32 microbiome screening. Derudover kan seneste udvikling i bioinformatik aktiverer mikrobielle flowcytometri til at være en integreret sensor i proceskontrollen af administrerede mikrobielle systemer. Mikrobielle samfund flowcytometri giver også en screeningsværktøj til celle sortering, som giver mulighed for højere opløsning genomisk undersøgelser af specifikke EF undersæt.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender taknemmeligt Michael Jahn og Yuting Guo for den procedure og datasæt af ren kultur og det aktiverede slam samfund, henholdsvis. Vi takker yderligere Katrin Mörters til at analysere biogas Fællesskabet prøver. Dette arbejde blev finansieret af Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (FNR, projektet Biogas-Fingerprint Nr. 22008313) på vegne af det tyske Forbundsministerium for fødevarer og landbrug (BMEL), det centrale innovationsprogram for små og mellemstore virksomheder (ZIM) af det føderale ministerium økonomi-og energi (BMWi) (INAR-ABOS, 16KN043222), Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU, Project On-demand Produktion von Phosphatdünger aus Reststoffen von Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), det tyske Forbundsministerium for uddannelse og Forskning (BMBF) (FZK 03XP0041G), og Helmholtz Association’s Program-orienterede finansiering (POF III R31 emne 3 bioenergi).
Milli-Q system Synthesis A10 | Merck, Darmstadt, (GER) | ||
BioPak Ultrafiltration Cartridge | Merck, Darmstadt, (GER) | CDUF BI0 01 | |
MoFlo Legacy cell sorter | Beckman-Coulter, Brea, California (USA) | ||
Innova 90C | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 334 nm – 364 nm, 100 mW | |
Innova 70C | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 488 nm, 400 mW | |
Genesis MX488-500 STM OPS | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 488 nm, 400 mW | |
Xcyte CY-355-150 | Lumentum, Milpitas, California, USA | 355 nm, 150 mW | |
Photomultiplier tubes R928 and R3896 | Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan) | ||
Summit 4.3 software | Beckman-Coulter, Brea, California (USA) | ||
1 µm FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F8815 | 350/440 blue fluorescent |
2 μm YG FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F-8827 | 505/515 yellow-green fluorescent beads |
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres | PolyScience, Niles, Illinois (USA) | 18339 | 360/407 |
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres | PolyScience, Niles, Illinois (USA) | 17458 | 360/407 blue fluorescent |
1 µmYG FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F-13081 | 505/515 yellow-green fluorescent beads |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7778-77-0 | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7447-40-7 | |
Cyflow Space | Sysmex Corporation, Kobe (Japan) | ||
UV Laser Genesis CX, | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 355 nm, 150 mW | |
H6779-32 series PMTs | Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan) | ||
FloMax software | Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER) | ||
all optical filters | Carl Zeiss, Jena (GER) | ||
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7778-77-0 | |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6781.3 | |
FlowJo 10.0.8r1 | FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) | Build number: 42398 | |
R-software v.3.4.3 | R Core Team | ||
flowCHIC | http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html | ||
flowCyBar | http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html |