I detta protokoll beskriver vi en mikropipett metod för att direkt tillämpa en kontrollerad kraft till kärnan i en levande cell. Denna analys kan förhör av nuclear mekaniska egenskaper i cellen levande, vidhäftande.
De mekaniska egenskaperna av kärnan avgör dess svar på mekaniska krafter genereras i celler. Eftersom kärnan är molekylärt kontinuerlig med cytoskelettet, behövs metoder att undersöka dess mekaniska beteende i vidhäftande celler. Här diskuterar vi direkt tvång sonden (DFP) som ett verktyg för att applicera kraft direkt till kärnan i en levande fastsittande cell. Vi lägger en smal mikropipett på nukleära ytan med sug. Mikropipett översätts från kärnan, som orsakar kärnan att deformera och översätta. När återställa styrkan är lika med sugstyrka, kärnan lossnar och slappnar elastiskt. Eftersom sugtrycket är just känd, är kraften på nukleära ytan känd. Denna metod har avslöjat att nano-skala krafter räcker för att deformera och översätta kärnan i vidhäftande celler, och identifierade cytoskeletal element som gör att kärnan att motstå krafter. DFP kan användas att dissekera bidrag av cellulära och nukleära komponenter till nuclear mekaniska egenskaper i levande celler.
Sjukdomar såsom cancer innebära ändringar av nukleära form och struktur1,2, som vanligen åtföljs av en ‘mjukgörande’ av nucleus3,4. Nukleära motståndskraft mot mekanisk deformation karaktäriserats generellt genom att tillämpa en kraft på isolerade atomkärnor5.
Kärnan i celler är molekylärt ansluten till cytoskelettet av Linker av Nucleoskeleton och cytoskelettet (LINC) komplexa6,7,8,9. Som ett resultat, är kärnan mekaniskt integrerad med cytoskelettet och genom cell-underskikt sammanväxningar, extracellulärmatrix. Mekaniskt sondera kärnan inuti vidhäftande celler kan ge insikt i denna mekaniska integration. Metoder att manipulera kärnor i levande celler inkluderar mikropipett aspiration10,11, och atomic force microscopy12,13,14. Vi har nyligen beskrivit en direkt tvång sond (DFP) som gäller mekaniska krafter direkt på kärnan i en levande fastsittande cell15.
Här, beskriver vi förfarandet för ett Mikroskop system som är allmänt tillgänglig i mikroskopi faciliteter att tillämpa en känd, nano-skala mekanisk kraft direkt till kärnan i en fastsittande cell. En femtotip (0,5 µm diameter mikropipett spets) är monterade och anslutna till Mikroskop systemet av ett rör. Spetsen, placerad i en 45° vinkel i förhållande till ytan av kultur skålen, sänks tills anslutning till nukleära ytan. Röret är sedan kopplas bort och öppnade till atmosfären, vilket skapar ett sug undertryck på nukleära yta och förseglar mikropipett spetsen mot kärnkraft ytan. Genom översättning av mikropipett spetsen, är kärnan deformerade och så småningom (beroende på omfattningen av kraft tillämpas), fristående från mikropipett. Här lossnar uppstår när de återställa (motstånd) krafter, som utövas av kärnan och cell, lika sug kraften som tillförs av en mikropipett. Analys kan utföras genom att mäta förskjutningen av kärnan, den längd stammen (ekvation 1), eller området stammen (figur 1A).
Mätning mekanisk integrering av kärnan med cellskelettet är en utmaning för mest aktuella metoder, såsom mikropipett aspiration16, eftersom de kräver antingen isolerade atomkärnor (där kärnan är frikopplade från cytoskelettet) eller kärnor i suspenderade celler (där extracellulära krafter, såsom dragkraft styrkor, är frånvarande). Kraft har tillämpats till kärnan genom att tillämpa biaxiell stam celler anhängare till en membran17,<sup class="…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av NIH R01 EB014869.
FluoroDish | WPI | FD35 | |
SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |