Summary
In questo protocollo, descriviamo un metodo micropipetta per applicare direttamente una forza controllata al nucleo in una cellula vivente. Questo test permette di interrogatorio di proprietà meccaniche nucleari nella cellula viva, aderente.
Abstract
Le proprietà meccaniche del nucleo determinano la sua risposta a forze meccaniche generate nelle cellule. Poiché il nucleo è molecolarmente continuo con il citoscheletro, metodi sono necessari per sondare il suo comportamento meccanico in cellule aderenti. Qui, discutiamo la sonda di forza diretta (DFP) come strumento per applicare la forza direttamente al nucleo in una cellula aderente vivente. Noi attribuiamo una micropipetta stretta per la superficie nucleare con aspirazione. La micropipetta è traslata lontano il nucleo, che fa sì che il nucleo di deformare e tradurre. Quando la forza di ripristino è uguale alla forza di aspirazione, il nucleo si stacca e rilassa elasticamente. Poiché la pressione di aspirazione è noto con precisione, la forza sulla superficie nucleare è noto. Questo metodo ha rivelato che le forze su scala nanometrica sono sufficienti per deformare e tradurre il nucleo in cellule aderenti e identificati gli elementi del citoscheletro che consentono il nucleo resistere alle forze. La DFP può essere utilizzata per sezionare i contributi di componenti cellulari e nucleare nucleare proprietà meccaniche in cellule viventi.
Introduction
Patologie come il cancro coinvolgono alterazioni nucleare forma e struttura1,2, che sono generalmente accompagnati da un 'addolcimento' del nucleo3,4. Nucleare resistenza alla deformazione meccanica è stata caratterizzata generalmente applicando una forza di nuclei isolati5.
Il nucleo in cellule è molecolarmente collegato al citoscheletro dal Linker di Nucleoskeleton e citoscheletro (LINC) complesso6,7,8,9. Di conseguenza, il nucleo è integrato meccanicamente con il citoscheletro e, attraverso le adesioni cellula-substrato, la matrice extracellulare. Meccanicamente sondando il nucleo all'interno di cellule aderenti può fornire la comprensione in questa integrazione meccanica. Metodi per manipolare i nuclei in cellule viventi includono micropipetta aspirazione10,11e a forza atomica microscopia12,13,14. Recentemente abbiamo descritto una sonda di forza diretta (DFP) che si applica forze meccaniche direttamente sul nucleo in un vivente cellulari aderenti15.
Qui, descriviamo la procedura per l'utilizzo di un sistema di microiniezione che è comunemente disponibile in strutture di microscopia di applicare una forza meccanica di nano-scala nota, direttamente al nucleo in una cellula aderente. Un femtotip (punta della micropipetta diametro di 0,5 µm) è montato e collegato al sistema di microiniezione di un tubo. La punta, posizionata ad un angolo di 45° rispetto alla superficie della piastra di coltura, si abbassa fino a adiacente alla superficie nucleare. Il tubo viene quindi disconnesso e aperto all'atmosfera, che crea una pressione negativa di aspirazione sulla superficie nucleare e sigilla la punta della micropipetta contro la superficie nucleare. Attraverso la traduzione della punta della micropipetta, il nucleo è deformato e alla fine (a seconda della grandezza della forza applicata), staccato dalla micropipetta. Questo distacco si verifica quando le forze antagoniste (resiste), esercitate dal nucleo e cella, uguale la forza di aspirazione applicata dalla micropipetta. Analisi può essere effettuata misurando lo spostamento del nucleo, il ceppo di lunghezza (equazione 1), o il ceppo di zona (Figura 1A).
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Protocol
1. preparare le celle per l'Imaging
Nota: La sonda di forza diretta (DFP) può essere utilizzata per qualsiasi tipo di cellula aderente. Qui, fibroblasti NIH 3T3 del mouse sono usati come la linea cellulare modello per questo protocollo.
- Cellule di cultura NIH 3T3 del fibroblasto dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) completati con 10% siero bovino di donatore e 1% penicillina-streptomicina su un fondo di 35 mm vetro piatto fino al confluency di desiderata. Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% CO2.
- Assicurarsi di ricoprire tutti i piatti di fondo di vetro 35mm con 5 µ g/mL di fibronectina (o proteina simile ECM), prima della semina di cellule NIH 3T3 per l'imaging.
Nota: Le cellule devono essere pienamente diffuso e aderente sul piatto per l'esperimento. Non ci sono vincoli in termini di confluenza per utilizzare il metodo DFP.
- Assicurarsi di ricoprire tutti i piatti di fondo di vetro 35mm con 5 µ g/mL di fibronectina (o proteina simile ECM), prima della semina di cellule NIH 3T3 per l'imaging.
- Immediatamente prima dell'esperimento, lavare le cellule due volte con PBS, seguita da un lavaggio singolo con il mezzo di crescita completa.
- Aggiungere 3 mL di terreno di crescita completa il piatto di fondo di vetro.
2. microscopia e acquisizione di immagini
Nota: Un invertito fluorescenza Microscopio (o equivalente) con micromanipolatore installato per il braccio di lato, secondo le raccomandazioni del produttore. Il microscopio deve anche essere dotato di una camera climatica per mantenere la temperatura a 37 ° C e il livello di CO2 al 5%. È necessario anche un micromanipolatore e microinjector collegato al microscopio. Un olio immersione 40x / 1.3 NA o 60x / 1,49 NA (o obiettivi equivalenti) sono raccomandati per gli esperimenti. Il microscopio deve essere montato su un tavolo di isolamento delle vibrazioni.
Figura 1 . Microscopio di messa a fuoco e di deformazione nucleare
A. massima deformazione nucleare e rilassamento della deformazione nucleare. Prima di calcolare la deformazione massima nucleare, i bordi posteriori delle forme nucleare erano in primo luogo ha coinciso per correggere per la traduzione del nucleo deformato. La forma del nucleo al momento del distacco di punta della micropipetta è stata sovrapposta la forma nucleare iniziale prima di tirare. La differenza nell'area tra le due forme è stata misurata come Δun1. La massima deformazione nucleare è stata definita come ΔA1 diviso per l'area nucleare originale. Allo stesso modo, un secondo parametro, ΔA2, può essere definito mediante la sovrapposizione della forma nucleare finale allo stato stazionario dopo distacco micropipetta della forma nucleare originale. B. lo stato attivo della cella al piano A e quindi spostare il piano focale fino a piano B per trovare la punta di una micropipetta. Durante la formazione immagine, la micropipetta è stato tradotto a destra (direzione della freccia arancione). Questa figura è stata modificata da Neelam et al. 15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Accendere il microinjector secondo il protocollo del produttore.
- Con un contagocce di olio di immersione, applicare una sola goccia di olio per immersione in cima la lente dell'obiettivo.
- Fissare saldamente il piatto nel titolare del piatto e caricare il titolare di piatto sul palco.
Nota: Le celle devono essere mantenute a 37 ° C e 5% di CO2 in tutto l'esperimento. - Regolare l'altezza dell'obiettivo di portare le cellule a fuoco (aereo A, Figura 1B).
- Spostare il tavolino del microscopio per trovare una cella di interesse.
- Ruotare il joystick sul micromanipolatore per spostare il supporto di dispensare alla posizione superiore. Caricare la micropipetta di punta di diametro 0,5 µm al supporto per dispensare.
- Per evitare l'adesione delle cellule per la micropipetta, pre-trattare la punta della micropipetta con 0,3 mg/mL di soluzione di PLL-g-PEG per 1 h a temperatura ambiente. Test per adesione toccando la micropipetta al nucleo senza alcuna pressione di aspirazione, e quindi tradurre la micropipetta dal nucleo. L'assenza di adesione possa essere individuata da una completa mancanza di deformazione nucleare e traduzione.
Nota: Si prega di seguire suggerimenti di fabbricazione per aprire il pacchetto.
- Per evitare l'adesione delle cellule per la micropipetta, pre-trattare la punta della micropipetta con 0,3 mg/mL di soluzione di PLL-g-PEG per 1 h a temperatura ambiente. Test per adesione toccando la micropipetta al nucleo senza alcuna pressione di aspirazione, e quindi tradurre la micropipetta dal nucleo. L'assenza di adesione possa essere individuata da una completa mancanza di deformazione nucleare e traduzione.
- Sollevare il piano focale obiettivo sopra A aereo e parte superiore della cella per piano B regolando il controllo fine (Figura 1B, vedere il punto 2.4).
- Impostare il micromanipolatore controllo grossolana . Portare lentamente la micropipetta giù per piano B guardando per la silhouette della micropipetta, fino a quando la micropipetta viene completamente messa a fuoco.
- Una volta che la punta della micropipetta è a fuoco, impostare il micromanipolatore controllo bene .
- Abbassare l'obiettivo per il piano equatoriale della cellula (aereo A, Figura 1B) e abbassare la micropipetta a circa 15 µm sopra piano A (Figura 1B, micropipetta tratteggiata).
- Impostare la pressione di compensazione (Pc) su microinjector alla pressione desiderata; attendere alcuni secondi per la pressione si stabilizzi.
Nota: Il set point di pressione ottimale dipende dal tipo di cellula sia gli obiettivi specifici dell'esperimento. Per la maggior parte dei casi, 300 hPa sarebbe un buon punto di partenza. - Garantire che la micropipetta non sia intasata utilizzando l'impostazione pulite sul pannello micromanipolatore e controllo per assicurarsi che le bolle d'aria emergere dalla punta della micropipetta.
- Inserire la punta nella cella abbassando gradualmente la micropipetta fino a quando la punta è leggermente toccando la superficie nucleare.
Nota: Quando si abbassa la micropipetta, la silhouette della punta della micropipetta diventerà chiara come essa viene messa a fuoco. Prima la micropipetta tocca il nucleo, sollevare l'obiettivo messa a fuoco e allineare la punta della micropipetta con nucleo (stessa coordinata x-y, z-piano superiore). Tornare il fuoco al piano equatoriale del nucleo (aereo A, Figura 1B) e abbassare gradualmente la punta della micropipetta. - Creare una guarnizione tra la punta della micropipetta e la membrana nucleare scollegando il tubo di alimentazione di pressione dal sistema di microiniezione, aprendo così l'estremità del tubo micropipetta all'atmosfera. Questo passaggio crea una pressione negativa uguale a Pc sulla superficie nucleare.
- Acquisire immagini con il software di raccolta immagini di microscopi. Impostare un'acquisizione avi (video) o nd-acquisizione (immagini) del software di raccolta di immagine.
Nota: Per qualsiasi imaging l'acquisizione di software, è istituito da formazione immagine video in tempo reale o acquisizioni di time-lapse immagine con un intervallo di tempo breve. - Attiva/disattiva per le fluorescenti corrispondente canale di imaging (cioè, GFP, RFP, ecc.) e iniziare la formazione immagine.
- Tradurre la punta della micropipetta lontano dal corpo della cella (a destra, Figura 1B) finché il nucleo non si stacca dalla micropipetta.
Nota: Tirare la punta lungo la direzione x positiva (a destra nel campo visivo). Il tasso di trazione può essere programmato e controllato da computer o il joystick può essere spostato manualmente. Non abbiamo trovato alcuna correlazione tra la trazione tasso e deformazione nucleare15 suggerendo una risposta prevalentemente elastica per forzare.
3. analisi dei dati
- Eseguire l'analisi di immagine con qualsiasi software di elaborazione delle immagini base disponibile. L'entità della deformazione nucleare può essere quantificata dal ceppo di lunghezza (Ɛ) o il ceppo di zona (Figura 1A). Quantificare il ceppo di lunghezza utilizzando l'equazione 1, dove L e L0 rappresentano le lunghezze del nucleo a deformazione massima e la posizione iniziale, rispettivamente.
(Equazione 1)
(Equazione 1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La Figura 2A Mostra la forzatura di un nucleo di fibroblasto NIH 3T3 del mouse. Come la punta di una micropipetta è tradotto a destra, il nucleo si deforma e alla fine si stacca dalla punta della micropipetta. Il ceppo di lunghezza del nucleo è visto ad aumentare con l'aumento della forza di aspirazione (Figura 2B). Il bordo anteriore del nucleo (micropipetta tirando bordo) forma una protrusione nucleare ed il bordo d'uscita è spostato dalla sua posizione originale. La lunghezza della sporgenza è molto più grande lo spostamento del bordo d'uscita (Figura 2), suggerendo una stretta integrazione tra nucleo e citoplasma circostante. Le scale di tempo sono breve per rilassamento del bordo anteriore nucleare (< 1 s) e il bordo posteriore nucleare (< 2 s) (Figura 2D).
Figura 2 . Caratterizzazione della deformazione nucleare
Deformazione e lo spostamento del nucleo in una cellula viva, aderente dalla DFP. Un nucleo di NIH 3T3 del fibroblasto è stato tirato con forza nN 6. Le immagini mostrano la forma nucleare al tempo indicato. Barra della scala: 5 µm nucleare B. deformazione è stato quantificato dal ceppo di lunghezza. La deformazione nucleare aumentato con forze applicate. Barre di errore indicano errore standard della media (SEM); n > 6. C. lo spostamento all'avanguardia è maggiore lo spostamento del bordo posteriore. D. il rilassamento di sforzo di lunghezza è molto più veloce di rilassamento del bordo posteriore. P < 0,05; barre di errore indicano SEM; n = 10. Questa figura è stata modificata da Neelam et al. 15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Abbiamo usato il metodo DFP per determinare le forze citoscheletriche come contribuire al nucleare resistenza alla deformazione nella cella. Mentre nessuna differenza significativa nella traduzione o deformazione nucleare sono stata trovata dopo F-actina (di Citocalasina-D) o la rottura dei microtubuli (da nocodazole), riduzione dell'espressione del vimentin attraverso basati su siRNA atterramento provocato significativamente maggiore Traduzione nucleare e deformazione (Figura 3). Ciò suggerisce che il vimentin filamenti intermedi nei fibroblasti sono il principale elemento del citoscheletro che aiutano il nucleo resistere forza locale.
Figura 3 . Immagini fluorescenti della deformazione nucleare
DFP è stato utilizzato per determinare il contributo delle forze citoscheletriche alla deformazione nucleare. Il nucleo era macchiato con SYTO 59 colorante. Immagini fluorescenti mostrano la sovrapposizione del nucleo prima (pseudo-colore rosso,) e dopo (pseudo-colore verde,) presso la condizione indicata. CTRL, cellule di controllo; CYTO-D, le cellule trattate con Citocalasina-D; NOC, cellule trattate con nocodazole; SCRAM, cellule trasfettate con siRNA strapazzato; Vim siRNA, cellule trasfettate con siRNA targeting per il vimentin. Questa figura è stata modificata da Neelam et al. 15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'integrazione meccanica del nucleo con il citoscheletro di misura è una sfida per i metodi più attuali, ad esempio micropipetta aspirazione16, perché richiedono entrambi nuclei isolati (dove il nucleo è disaccoppiato dal citoscheletro) o nuclei in cellule sospese (dove le forze extracellulari, quali le forze di trazione, sono assenti). Vigore è stato applicato al nucleo applicando deformazione biassiale a aderente celle a una membrana17,18; Tuttavia, questa tecnica è limitata dal fatto che la forza sul nucleo è sconosciuta. Forza atomica (AFM) la microscopia sonde sono stati utilizzati per far rientrare il nucleo in cellule intatte; Questi offrono il vantaggio che essi rivelano le proprietà meccaniche del nucleo mentre esso è integrato con il citoscheletro. Per aggiungere le tecniche esistenti in vivo per caratterizzare il nucleo12,13,14, abbiamo sviluppato un metodo semplice e robusto per sondare meccanicamente il nucleo in una cellula aderente vivente, mentre rimane integrato al citoscheletro circostante. Una caratteristica fondamentale di questa tecnica è che la forza sul nucleo è precisamente conosciuta e controllata.
Applicando il DFP, stimiamo che le forze di scala nano-newton sono sufficienti a deformare e tradurre il nucleo nelle cellule viventi, aderente. Inoltre, attraverso studi sistematici dei contributi dei vari elementi del citoscheletro, abbiamo trovato che il vimentin-basato i filamenti intermedi sono il componente principale del citoscheletro cellulare responsabile di nucleo nella cella di irrigidimento 15.
Con questi esperimenti si applicano alcune raccomandazioni. È importante controllare regolarmente la punta della micropipetta per intasamento o rottura durante gli esperimenti, come entrambi intasamento della micropipetta o frattura della punta potrebbe causare modifiche sconosciute per la pressione di aspirazione applicato sulla cella. Per verificare se la micropipetta è intasata, è necessario utilizzare l'impostazione pulita sul manipolatore per applicare la massima pressione e verificare di bolle d'aria emergenti dalla punta della micropipetta. Se la punta della micropipetta è rotta o fratturata, sostituire la micropipetta prima di iniziare l'esperimento successivo. Inoltre, è importante confermare che il ceppo nucleare varia con la forza e al forza zero è zero (Vedi Neelam et al. 15). se questo non è stato osservato negli esperimenti, quindi è possibile che non specifica adesione tra la punta della micropipetta e la superficie nucleare (malgrado il trattamento con PLL-PEG) può essere responsabile di deformazione nucleare. Un'altra limitazione della tecnica è che l'inserimento della micropipetta nella cellula stessa può causare qualche disturbo locale delle strutture citoscheletriche.
È utile verificare le correlazioni tra l'entità della deformazione nucleare/traduzione e tasso di carico. Un'assenza di correlazione implicherebbe una resistenza soprattutto elastica. Si tratta infatti di quello che abbiamo trovato per essere il caso per fibroblasti nuclei15. Mentre la forza sul nucleo è noto, il metodo non consente il calcolo dei parametri come il modulo di Young. Abbiamo principalmente usato esso per sezionare i contributi di strutture cellulari per la resistenza alla deformazione nucleare e traduzione nella cella. Mentre abbiamo segnalato forme bidimensionali nucleare15,19, può essere utile quantificare la forma piena tridimensionale del nucleo nell'ambito di forza.
La pressione di aspirazione nella micropipetta è conosciuta, ma è più grande di quanto la pressione effettiva applicata per il nucleare superficiale dovuto al flusso di acqua attraverso i pori10. Tuttavia, abbiamo dimostrato che la resistenza al flusso attraverso i pori nucleari è molto più grande attraverso la micropipetta (Vedi informazioni di supporto per i calcoli in Neelam et al. 15) per la permeabilità di membrana ragionevole e dimensioni micropipetta. Di conseguenza, la pressione sulla superficie di membrana esterna dovrebbe essere uguale alla pressione di aspirazione, nonostante l'esistenza di flusso.
In conclusione, il DFP consente all'utente di quantificare la risposta meccanica del citoscheletro-nucleo integrato in una cella aderente ad una forza di nota e controllata. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per sezionare i contributi di componenti molecolari nel nucleo e nel citoplasma il comportamento meccanico del nucleo all'interno della cellula.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 EB014869.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
References
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