Summary
В этом протоколе мы описываем метод микропипеткой непосредственно применять контролируемых силой к ядру в живой клетке. Этот assay позволяет допроса ядерных механических свойств в живых, адэрентных клеток.
Abstract
Механические свойства ядра определяют свой ответ на механических сил, созданных в клетках. Поскольку ядро молекулярно непрерывный с цитоскелета, методы необходимы для зонда его механического поведения в адэрентных клеток. Здесь мы обсуждаем прямой силы зонд (DFP) как инструмент для применения силы прямо к ядру в живых адэрентных клеток. Мы придаем узкие микропипеткой ядерной поверхности с всасывания. Микропипеткой переводится от ядра, который вызывает ядро деформируется и перевести. Когда восстановление сил равна силе всасывания, ядро отсоединяется и упруго расслабляет. Потому что давление всасывания точно известно, известно на поверхности ядерных сил. Этот метод показал, что нано-силы достаточно, чтобы деформировать и перевести ядро в адэрентных клеток и определены цитоскелетных элементов, которые включают ядро противостоять силам. DFP может использоваться для рассечения вклад сотовой и ядерных компонентов ядерных механических свойств в живых клетках.
Introduction
Патологий, таких как рак включают изменения в ядерной форма и структура1,2, которые обычно сопровождаются «размягчения» ядра3,4. Ядерные устойчивость к механической деформации обычно характеризуются применения силы для изолированных ядер5.
Ядро в клетках молекулярно подключен к цитоскелета компоновщик Nucleoskeleton и цитоскелета (линк) комплекс6,,78,9. В результате ядро механически интегрирована с цитоскелета и через ячейки субстрат спайки, внеклеточного матрикса. Механически зондирования ядра внутри адэрентных клеток может обеспечить понимание этой механической интеграции. Методы для манипулирования ядер в живых клетках включают микропипеткой аспирации10,11и атомно-силовой микроскопии12,,1314. Мы недавно описал прямой силы зонд (DFP), который применяется непосредственно на ядро в живых адэрентных клеток15механических сил.
Здесь мы приводим порядок использования микроинъекции системы, которая обычно доступна в микроскопии средств для применения известных, нано-механической силы непосредственно к ядру в адэрентных клеток. Femtotip (0,5 мкм диаметром микропипеткой наконечник) установлен и подключен к системе микроинъекции трубку. Кончик, расположены под углом в 45° по отношению к поверхности культуры блюдо, опускается до прилегающих к ядерной поверхности. Трубка затем отключен и открыт для атмосферы, которая создает отрицательное давление всасывания на поверхности ядерной и уплотнения кончик микропипеткой против ядерной поверхности. Через перевод кончика микропипеткой ядро деформируется и в конечном итоге (в зависимости от масштабов применения силы), отделен от микропипеткой. Этот отряд возникает, когда восстановление (сопротивления) сил, оказываемое ядро и ячеек, равное всасывающее усилие микропипеткой. Анализ может выполняться путем измерения смещения ядра, длина штамм (уравнение 1), или площадь штамм (рис. 1A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка клетки для изображений
Примечание: Прямой силы зонд (DFP) может использоваться для любого типа адэрентных клеток. Здесь фибробласты мыши низ 3T3 используются в качестве модели клеточная линия для этого протокола.
- Культура низ 3T3 фибробластов клетки в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) дополнена бычьим сывороточным доноров 10% и 1% пенициллин-стрептомицином на 35-мм стекла дно блюдо до желаемой confluency. Сохранить клетки при 37 ° C и 5% CO2.
- Убедитесь в том покрыть все 35-мм стекла дно блюда с 5 мкг/мл фибронектина (или аналогичных ECM белков), перед посевом низ 3T3 клетки для воображения.
Примечание: Клетки должны полностью распространяться и сторонником на блюдо для эксперимента. Не существует каких-либо ограничений с точки зрения confluency для работы метода DFP.
- Убедитесь в том покрыть все 35-мм стекла дно блюда с 5 мкг/мл фибронектина (или аналогичных ECM белков), перед посевом низ 3T3 клетки для воображения.
- Непосредственно перед экспериментом Вымойте клетки дважды с PBS, следуют один мыть с полный рост среднего.
- Добавьте 3 мл полный рост средних блюдо дно стекла.
2. микроскопии и захвата изображений
Примечание: Перевернутый флуоресцентным микроскопом (или эквивалент) с микроманипулятор, установленной в сторону руку, согласно рекомендациям изготовителя. Микроскоп должен быть оснащен климатическая камера для поддержания температуры при 37 ° C и уровень CO2 на 5%. Требуется также микроманипулятор и microinjector, прилагается к Микроскоп. 40 x погружения нефти / 1,3 NA или 60 x / 1,49 NA (или эквивалентные цели) рекомендуются для экспериментов. Микроскоп должен быть установлен на таблицы изоляции вибрации.
Рисунок 1 . Ядерные деформации и фокусировки микроскопа
A. Максимальная ядерной деформации и ослабление ядерной деформации. Перед вычислением максимальная ядерной деформации, краям задней ядерных форм были впервые совпало исправить перевод деформированных ядра. Форму ядра на данный момент микропипеткой Совет отряда был накладывается на первоначальный ядерной форме перед вытягивать. Разница в районе между двумя фигурами была измерена как Δ1. Максимальная ядерной деформации был определен как ΔА1 разделенных оригинальный ядерной области. Аналогичным образом, второй параметр, ΔA2, могут быть определены путем наложения окончательного устойчивого состояния ядерной форму после микропипеткой отряд на ядерной форме оригинала. B. фокус ячейки на плоскости A, а затем переместите фокальной плоскости до плоскости B найти микропипеткой наконечник. Во время визуализации, микропипеткой было переведено вправо (направление оранжевая стрелка). Эта цифра была изменена от Нилам и др. 15. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Включите microinjector за производителя протокол.
- С помощью капельницы масло погружения, примените одну каплю масла погружения поверх объектива.
- Плотно закрепите блюдо в держатель мыльница и загрузить держатель мыльница на сцену.
Примечание: Клетки должна поддерживаться на 37 ° C и 5% CO2 на протяжении всего эксперимента. - Отрегулируйте высоту цель довести клетки в фокус (плоскости A, рис. 1B).
- Перемещения микроскопа найти ячейку интерес.
- Вращайте джойстика на микроманипулятор для перемещения держателя накапайте в верхнее положение. Загрузите микропипеткой наконечник диаметром 0,5 мкм на держатель пипетки.
- Избежание клеточной адгезии к микропипеткой, предварительно лечить микропипеткой наконечник с 0.3 мг/мл PLL-g-PEG решение за 1 час при комнатной температуре. Тест для адгезии, прикасаясь микропипеткой ядро без каких-либо давление всасывания и затем переводить микропипеткой от ядра. От полного отсутствия ядерного деформации и перевода можно выделить отсутствие прилипания.
Примечание: Пожалуйста, следуйте производство предложения следует открыть пакет.
- Избежание клеточной адгезии к микропипеткой, предварительно лечить микропипеткой наконечник с 0.3 мг/мл PLL-g-PEG решение за 1 час при комнатной температуре. Тест для адгезии, прикасаясь микропипеткой ядро без каких-либо давление всасывания и затем переводить микропипеткой от ядра. От полного отсутствия ядерного деформации и перевода можно выделить отсутствие прилипания.
- Поднять объективных фокальной плоскости выше плоскости A и в верхней части ячейки B самолет, регулируя точного управления (рис. 1B, шаг 2.4).
- Установите микроманипулятор для грубой управления. Медленно довести микропипеткой вплоть до плоскости B, наблюдая за силуэт микропипеткой, до тех пор, пока микропипеткой поставляется полностью в фокус.
- После того, как кончик микропипеткой находится в фокусе, установите микроманипулятор для точного управления.
- Нижняя цель в экваториальной плоскости клетки (плоскости A, рис. 1B) и Нижняя микропипеткой около 15 мкм выше плоскости A (рис. 1B, пунктирная микропипеткой).
- Установка компенсации давления (Pc) на microinjector до требуемого давления; Подождите несколько секунд для давления для стабилизации.
Примечание: Уставка оптимального давления зависит от типа ячейки и конкретными целями эксперимента. В большинстве случаев 300 гПа бы хорошей отправной точкой. - Убедитесь, что микропипеткой не забиты с помощью параметра Clean на панели микроманипулятор и проверку, чтобы убедиться, что воздушные пузыри возникают от кончика микропипеткой.
- Вставьте наконечник в клетку, постепенно понижая микропипеткой, до тех пор, пока кончик слегка касаясь поверхности ядерного.
Примечание: При опускании микропипеткой, силуэт кончик микропипеткой станет ясно, как это происходит в центре внимания. Прежде чем микропипеткой коснется ядро, поднять объективного фокус и совместите кончик микропипеткой с ядром (же x-y координата, выше плоскости z). Вернуть фокус обратно в экваториальной плоскости ядра (плоскости A, рис. 1B) и постепенно опустите кончик микропипеткой. - Создайте уплотнение между кончиком микропипеткой и ядерной мембраны, отсоединив давления предложения трубы из микроинъекции системы, открыв тем самым конец микропипеткой трубу в атмосферу. Этот шаг создает отрицательное давление равно Pc на поверхности ядерного.
- Получение изображений с помощью программного обеспечения коллекция изображений микроскопы. Настройка avi приобретение (видео) или nd приобретение (изображения) в коллекции изображений.
Примечание: Для любых изображений, приобретение программного обеспечения, Настройка реального времени видео изображений или приобретения промежуток времени изображение с короткий промежуток времени. - Переключатель для соответствующего флуоресцентных изображений канал (т.е., GFP, ППП, и т.д.) и начать изображений.
- Перевести микропипеткой подсказка от тела клетки (справа, на рисунке 1B) до тех пор, пока ядро отсоединяется от микропипеткой.
Примечание: Вытяните кончик вдоль оси x положительные (справа в поле зрения). Вытягивая ставки могут быть запрограммированы и контролируется компьютером или джойстик может быть перемещена вручную. Мы не нашли каких-либо корреляции между потянув скорость и ядерной деформации15 предлагая главным образом упругих ответ на силу.
3. анализ данных
- Выполните анализ изображений с любой основной обработки изображений программное обеспечение, доступное. Степени ядерной деформации может быть определена количественно, длина штамм (Ɛ) или области штамм (рис. 1A). Количественно длина штамм, используя уравнение 1, где L и L0 представляют длины ядра на максимальной деформации и начальная позиция, соответственно.
(Уравнение 1)
(Уравнение 1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 2A показывает, заставляя ядра фиброцита мыши 3T3 низ. Как микропипеткой кончика перевели справа, ядро деформируется и в конечном итоге отсоединяется от кончика микропипеткой. Считается, что длина напряжение ядра с увеличением силы всасывания (рис. 2B). Передний край ядра (микропипеткой потянув край) формирует ядерной выступа и задней кромки смещается от своей первоначальной позиции. Длина выступа гораздо больше, чем перемещение задней кромкой (рис. 2 c), предлагая тесная интеграция между ядром и окружающих цитоплазму. Шкалы времени, короткий для релаксации ядерных передней кромки (< 1 s) и ядерной заднего края (< 2 s) (Рисунок 2D).
Рисунок 2 . Характеристика ядерной деформации
Деформации и смещения ядра в жизни, адэрентных клеток в DFP. НИЗ 3T3 фибробластов ядра была вытягивана с 6 nN силой. Изображения показывают ядерной форму в указанное время. Линейки: 5 мкм деформации B. ядерного была количественно оценена по длине деформации. Ядерная деформации увеличилась с прикладной силами. Планки погрешностей указывают Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM); n > 6. C. Перемещение на переднем крае больше, чем перемещение на задней кромке. D. Длина штамм релаксации гораздо быстрее, чем задней кромке релаксации. P < 0,05; планки погрешностей указывают SEM; n = 10. Эта цифра была изменена от Нилам и др. 15. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Мы использовали метод DFP для определения как цитоскелета силы способствовать ядерной устойчивость к деформации в ячейке. Хотя никаких существенных различий в ядерной деформации или перевода были найдены после F-актина (от cytochalasin-D) или нарушение микротрубочек (по Нокодазол), уменьшение виментин выражение через на основе малых интерферирующих РНК нокдаун привело к значительно большей ядерные перевод и деформации (рис. 3). Это свидетельствует о том, что промежуточные филаменты виментин в фибробласты являются основным элементом цитоскелета, которые помогают ядро сопротивление местных сил.
Рисунок 3 . Флуоресцентного изображения ядерной деформации
DFP была использована для определения вклада цитоскелета силы ядерного деформации. Ядро было окрашенных краской SYTO 59. Флуоресцентного изображения показывают оверлея ядра до (красный, псевдо-цвет) и после (зеленый, псевдо-цвет) в указанные состояния. CTRL, клетки управления; Цито-D, клетках, обработанных с cytochalasin-D; НОК, клетках, обработанных с Нокодазол; КАТИСЬ, transfected клеток с платные siRNA; Vim siRNA, transfected клеток с siRNA, ориентация виментин. Эта цифра была изменена от Нилам и др. 15. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Измерительные механические интеграции ядра с цитоскелета является проблемой для наиболее текущие методы, такие как микропипеткой стремление16, потому что они требуют либо отдельных ядер (где ядро отделенных от цитоскелета) или ядер в подвесной клетки (где внеклеточного сил, таких как силы тяги, отсутствуют). Сила была применена к ядро, применяя двухосных деформации клетки приверженцем мембраны17,18; Однако этот метод ограничен тот факт, что силы на ядро неизвестна. Зондов атомно-силовой микроскопии (АСМ) были использованы для отступа ядро в нетронутым клеток; Эти предложения, то преимущество, что они показывают механических свойств ядра во время интегрирована с цитоскелета. Чтобы добавить существующие в vivo методы для характеризующие ядро12,13,14, мы разработали простой и надежный метод для механически зонд ядро в живых адэрентных клеток, пока он остается Интегрированные окружающие цитоскелета. Ключевой особенностью этого метода является что силы на ядро точно известен и под контролем.
Применяя DFP, мы оцениваем, что нано Ньютон шкалы силы достаточно, чтобы деформировать и перевести ядро в живых, адэрентных клеток. Кроме того через систематические исследования вклада различных цитоскелетных элементов, мы нашли, что на основе виментин промежуточные филаменты являются основным компонентом клеточного цитоскелета, ответственных за ужесточение ядро в ячейке 15.
Некоторые предостережения применяются с этими экспериментами. Важно регулярно проверять микропипеткой подсказка для забивания или поломки во время экспериментов, как оба засорения микропипеткой или перелом кончик приведет к неизвестным изменения всасывающее давление на ячейку. Чтобы проверить, если микропипеткой засорен, используйте параметр Clean на манипулятор применить максимальное давление и проверить наличие пузырьков воздуха, возникающих от кончика микропипеткой. Если кончик микропипеткой сломан или перелом, замените микропипеткой перед началом следующего эксперимента. Кроме того, важно подтвердить, что ядерная штамм варьируется с силой и равен нулю на нулевой силы (см. Нилам и др. 15). Если этого не наблюдается в экспериментах, то вполне возможно, что неспецифические адгезии между микропипеткой кончиком и ядерной поверхности (несмотря на лечение с PLL-PEG) могут быть ответственны за ядерной деформации. Еще одним ограничением техники является, что вставки микропипеткой в самой клетки может вызвать некоторые местные нарушения цитоскелета структур.
Это полезно для проверки соотношения степени ядерной деформации/перевод и скорость загрузки. Главным образом эластического сопротивления будет означать отсутствие корреляции. Действительно это, что мы нашли, чтобы быть для фибробластов ядер15. Хотя силы на ядро, как известно, этот метод не позволяет расчет параметров как Юнга. Главным образом мы использовали его для того чтобы рассечь взносов клеточных структур к сопротивлению к ядерной деформации и перевод в ячейке. В то время, как мы уже сообщали двумерных фигур ядерных15,19, он может быть полезным для количественного определения полной трехмерной форме ядра под силу.
Давление всасывания в микропипеткой известен, но это больше, чем фактическое давление применяется к ядерной поверхности из-за потока воды через поры10. Однако мы показали, что сопротивление потока через ядерной поры гораздо больше через микропипеткой (см. вспомогательной информации для расчетов в Нилам et al. 15) для разумного мембраны значениями μ и микропипеткой измерений. Таким образом давление на поверхности наружной мембраны должна равняться давление всасывания, несмотря на существование потока.
В заключение DFP позволяет пользователю для количественного определения механических ответ комплексной ядро цитоскелета в адэрентных клеток на известных и контролируемых силой. Этот метод может использоваться для рассечения вклад молекулярных компонентов в ядре и цитоплазме механическое поведение ядра в ячейке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH R01 EB014869.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
References
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Bank, E. M., Gruenbaum, Y. The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship. Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).
- Lammerding, J., et al. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).
- Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures. Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).
- Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins. Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).
- Tapley, E. C., Starr, D. A. Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).
- Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
- Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency. Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).
- Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope. Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).
- Pagliara, S., et al. Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency. Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).
- Liu, H., et al. In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy. ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).
- Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy. Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).
- Neelam, S., et al. Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
- Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation. Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).
- Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells. Methods. 94, 27-32 (2016).
