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Bioengineering

Monitoreo no destructivos del desarrollo Degradable andamio base ingeniería de tejido vascular mediante tomografía de coherencia óptica

doi: 10.3791/58040 Published: October 3, 2018

Summary

Un protocolo paso a paso para ensayos no destructivos y período largo supervisar el proceso de remodelado vascular y la degradación de andamio en cultura en tiempo real de biodegradables poliméricos basados en andamio tejido-dirigida vasos sanguíneos con el estímulo pulsátil usando la tomografía de coherencia óptica se describe aquí.

Abstract

Ingeniería injertos vasculares con propiedades estructurales y mecánicas similares a los vasos sanguíneos naturales se espera que la creciente demanda de bypass arterial. Caracterización de la dinámica de crecimiento y proceso de remodelación de polímero degradable basada en andamio tejido-dirigida vasos sanguíneos (TEBVs) con el estímulo pulsátil es crucial para la ingeniería de tejido vascular. Técnicas de imagen ópticas se destacan como herramientas poderosas para el control de la vascularización del tejido diseñado que permite proyección de imagen de alta resolución en tiempo real cultura. Este trabajo demuestra un no destructivo y rápido en tiempo real imágenes estrategia para controlar el crecimiento y remodelación de TEBVs en la cultura a largo plazo mediante el uso de tomografía de coherencia óptica (OCT). Se evalúa la morfología geométrica, incluyendo proceso de remodelación vascular, grueso de pared y comparación de espesor TEBV en momentos diferentes de la cultura y la presencia del estímulo pulsátil. Por último, OCT proporciona posibilidades prácticas para la observación en tiempo real de la degradación del polímero en los tejidos reconstrucción bajo estimulación pulsátil o no y en cada segmento vascular, por en comparación con la evaluación de la degradación de polímero utilizando exploración electrónica microscopic(SEM) y microscopio polarizado.

Introduction

Ingeniería de tejido de los vasos sanguíneos (TEBVs) es el material más prometedor como un ideal del injerto vascular1. Para el desarrollo de injertos para ser clínicamente útil con propiedades estructurales y funcionales similares como vasos nativos, múltiples técnicas han sido diseñadas para mantener la función vascular2,3. Aunque ha habido barcos diseñados con tasas de permeabilidad aceptable durante la implantación y en el estudio clínico de fase III4, cultura a largo plazo y alto costo también muestran la necesidad de supervisar el desarrollo de TEBVs. Comprensión de los procesos de crecimiento, remodelación y adaptación de extracelular matrix(ECM) en TEBVs en el entorno de quimio-mecánica de biomimética puede proporcionar información crucial para el desarrollo de la ingeniería de tejido vascular.

La estrategia ideal para seguir el desarrollo de la ingeniería vasos de pequeño diámetro5 debe ser no destructiva, estéril, longitudinal, tridimensional y cuantitativa. Esta modalidad de proyección de imagen, incluso cambios antes y después del trasplante vascular podrían evaluarse TEBVs bajo condiciones de cultivo diferentes. Se necesitan estrategias para describir características de los recipientes de vida diseñado. Técnicas de imagen ópticas permiten la visualización y cuantificación de deposición de tejidos y biomateriales. Otras ventajas son la posibilidad de activar el tejido profundo y sin etiqueta de imagen con alta resolución6,7. Sin embargo, las moléculas específicas de la imagen y equipo óptico menos accesible para la supervisión en tiempo real es un obstáculo práctico importante, que ha limitado la amplia aplicación de la microscopía óptica no lineal. Tomografía de coherencia óptica (OCT) es un método óptico con modalidad de proyección de imagen intravascular como una herramienta clínica utilizada para guiar la terapia intervencionista cardiaca8. En la literatura el método de OCT fue divulgado como una forma de evaluar el espesor de pared de TEBVs9,10, juntada con modalidades de proyección de imagen positivas para la investigación de ingeniería de tejido vascular. Considerando que la dinámica de los diseñado vascular no se observó crecimiento y remodelación.

En este manuscrito, detallamos la preparación de biodegradables TEBVs poliméricos basados en el andamio para la cultura de cuatro semanas. Células de músculo liso vascular de arterias umbilicales humanas (HUASMCs) se amplió y sembradas en un andamios de ácido (PGA) poroso poliglicólico degradables en el biorreactor. Polímeros biodegradables papel en un sustrato temporal para ingeniería de tejidos y tienen una cierta degradación tasa de11. Para asegurar a un partido apropiado entre andamio degradación y formación de tejido de neo, andamios ECM y PGA son factores cruciales para la remodelación vascular eficaz. El sistema de perfusión simula el microambiente biomecánico de vasos nativos y mantiene una deformación constante bajo el estímulo de presión.

El objetivo del protocolo presentado es describir una estrategia relativamente sencilla y no destructiva para la proyección de imagen de TEBVs y monitoreo a largo plazo de la cultura. Este protocolo puede ser utilizado para la visualización de cambios morfológicos y mediciones del espesor de los vasos diseñados bajo condiciones de cultivo diferentes. Además, el análisis de la degradación de los materiales polímero-basados en lo andamios de la ingeniería del tejido se pueden realizar para la identificación. Mediante la combinación de métodos de exploración electrónica microscopic(SEM) y polarizada microscopio utilizado en este protocolo, correlación y cuantificación de la distribución de la matriz extracelular y la degradación de la PGA se pueden hacer, que puede facilitar la evaluación del andamio degradación combinada con proyección de imagen de OCT.

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Protocol

1. degradable PGA andamio base tejido-dirigida cultura de los vasos

  1. Fabricación de andamios de PGA
    1. Coser la malla de la PGA (19 mm de diámetro y 1 mm de espesor) alrededor de la tubería del silicón esterilizada por óxido de etileno (17 cm de longitud, diámetro de 5,0 mm y 0,3 mm de espesor) con sutura 5-0.
    2. Coser de politetrafluoroetileno (ePTFE, 1cm de longitud) con una sutura de 4-0 en cada extremo de la malla de la PGA y comprometidos por 2 mm.
    3. Inmersión de andamios de la PGA con la mano en 1 mol/L NaOH durante 1 min para ajustar la estructura espacial de la malla y poner en remojo con agua de cultivo de tejidos grado tres veces de 2 minutos cada uno. Suavemente pat seco el andamio con un papel cada vez. Luego secar los andamios en una campana con un soplador para 1 h.
  2. Montaje del biorreactor y la ensambladura de Y para proyección de imagen de OCT
    1. Remoje el biorreactor cilíndrico de vidrio self-developed (10 cm de diámetro y 11,7 cm de altura con cuatro labios interior y cuatro brazos laterales fuera del reactor como se muestra en la figura 1), andamios de PGA, tubo de silicona (diámetro exterior de 5 m m, grueso de 0.3 mm), biocompatibles tubos, conectores, barra de agitación y equipos para el montaje de un tanque de etanol de 95% para 2 h.
    2. Tire el andamio de la PGA a través de los brazos laterales del biorreactor conectado a un lado con un conector como a otro lado con el Unión Y solía entregar guía de OCT. Montar otro andamio de PGA en el biorreactor de la misma manera. Por favor refiérase a la figura 1.
    3. Ajuste de ePTFE para labios de biorreactor apretando con suturas de 4-0.
    4. Ponga el biorreactor en el depósito de etanol para 1 h y secar durante la noche en la campana con el ventilador en.
  3. Siembra de HUASMCs y acondicionado de biorreactor estática
    1. Aislante HUASMCs de arterias umbilicales humanas mediante técnicas estándar de explante.
    2. Ampliar y mantener las células en el medio de crecimiento de células de músculo liso se compone de medio DMEM, 20% de suero fetal bovino, 2,36 mg/mL HEPES, 100 U/mL de penicilina G, prolina μg/mL 50, 20 μg/mL alanina, glicina μg/mL 50, 1.5 μg/mL de CuSO4, ácido ascórbico de 50 μg/mL , 10 ng/mL del factor de crecimiento básico del fibroblasto y factor de crecimiento derivado de plaquetas de 10 ng/mL.
    3. HUASMCs de semilla en una concentración de 5 x 106 células/mL en el medio de cultivo anterior en los andamios de la PGA.
    4. Poner un stir bar (1,5 cm de longitud) en el biorreactor. Inserte un tubo de alimentación (5 mm de diámetro, 15 cm de longitud) y tres segmentos de tubo corto (5 mm de diámetro, 7 cm de longitud) para el intercambio de gases a través de la tapa del tapón de silicona.
    5. Instale filtros de 0,22 μm PTFE a cada cambio tubo y el casquillo de la una heparina para el tubo de alimentación. Ajustar la barra de agitación con una velocidad de agitación de 13 rondas por minuto. Montar el biorreactor de vidrio, tapa del tapón de silicona y andamio de PGA en el sistema de cultivo.
    6. Permite HUASMCs a adherirse para 45 min inclinándose el biorreactor cada 15 min con el soporte, a la izquierda y derecha. Los puertos de reactor y las juntas se sellan con la película de parafina.
    7. Conecte el Luo-sois la bomba, bolsa de PBS, el conductor con tubos biocompatibles como el sistema de perfusión. Abrir la unidad para llenar los tubos con PBS.
    8. Lugar el biorreactor general en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 ° C. Llene el compartimiento de la cultura con 450 mL de medio de cultivo HUASMCs.
    9. Presione el botón stop y apague el dispositivo de la impulsión. Crecen los sembrados andamios bajo cultura estática durante una semana.
    10. Cambiar el medio de cultivo cada 3-4 días aspirando la mitad del medio a través del tubo de alimentación y volver a llenar el reactor con una cantidad equivalente de medio fresco de cultivo antiguo.
  4. Preparación del sistema de perfusión para la proyección de imagen de OCT
    1. Bombean líquidos en la bolsa de PBS para circular a través de tubos biocompatibles y de vuelta a la bolsa.
    2. Abrir la potencia del controlador y regular el valor de la bomba con una frecuencia de 60 latidos por minuto y de la salida la presión sistólica de 120 mmHg. Ajustar los parámetros mecánicos según las necesidades del cultivo vascular ingeniería de tejidos.
    3. Haga clic en el botón ejecutar para trabajar el sistema de perfusión. Proporcionar el estímulo pulsátil fijo anterior a los vasos durante 3 semanas presurizando iterativamente biocompatible tubos10,12 después de 1 semana de la cultura estática.

2. realizar la proyección de imagen óptica con OCT

  1. Utilice una fuente de luz para asegurar la resolución axial de 10-20μm y la profundidad de imagen de 1-2 mm para identificar la estructura del TEBV basado en el dominio de la frecuencia OCT intravascular imaging system9.
  2. Encienda el interruptor de encendido y abra el software de captura de imagen.
  3. Conectar el catéter de proyección de imagen óptica de fibra con el controlador de motor de tracción y óptico (DOC) con función de retiro automático del catéter.
  4. Establecer parámetros de tasa de adquisición de imagen de 10 fotogramas por segundo con una velocidad de retroceso automático de 10 mm/s.
  5. Conexión de catéter Y cruce casquillo de la heparina con una aguja de 18G.
  6. Coloque el catéter en el tubo de silicona e identificar la tirantez de la sutura de la malla de la PGA antes de cargar el andamio de la PGA en el biorreactor.
  7. Coloque la punta del catéter sobre la región de interés. Ajuste el dispositivo de retirada y Compruebe la calidad de imagen8.
  8. Adquisición de imágenes en 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 días en la cultura de cada TEBV individual y guardar secuencialmente con tiempo real de observación de la microestructura de la TEBV, incluyendo la morfología superficial, estructura interna y composición.
  9. Repita la medición por 3 veces obtener una medición fiable de ingeniería buques cada vez. Capturar una serie de imágenes a lo largo de la prueba utilizando el software de captura de imagen.

3. Análisis de la proyección de imagen

  1. Utilizar software de análisis de imagen para medir el espesor de la pared TEBV. Seleccione la imagen a ser analizada. Haga clic en la herramienta de seguimiento para identificar la parte interior del TEBV por el software automáticamente y manualmente esbozar el lado externo. Un diagrama de espesor aparecerá en la pantalla.
  2. Repita la medición por 5 veces obtener una medición fiable de las construcciones. El análisis de OCT fue realizado por dos investigadores independientes cegados a la información obtenida.

4. la cosecha de TEBV y el procesamiento de tejido

  1. Abierta la tapa del tapón de silicona colocado sobre el biorreactor cuando se acaba la cultura y desechar el medio de cultivo. Afloje el ePTFE de labios de biorreactor y corte los tubos de silicona desde el lado exterior de ePTFE con tijeras. Cosecha TEBVs de biorreactor y cortar en secciones para el examen de microscopia electrónica de barrido.
  2. Tomar el resto de TEBVs y cortar en secciones gruesas de 4 μm. Saque el tubo de silicona soporte y fijar las secciones con paraformaldehído al 4%. Realizar la rutina histológica tinción de Masson trichrome y Sirius rojo para examinar la morfología del colágeno y PGA10,13,14.
  3. Para evaluar el contenido de la PGA y el componente de colágeno, observar muestras histologic con Sirius rojo coloración por un microscopio polarizado. Restos de PGA son claramente delimitadas a través de birrefringencia y puede ser cuantificado el área remanente basado en el área de sección transversal10.

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Representative Results

El sistema tridimensional de la cultura consistió en una cámara de cultivo en el biorreactor y el sistema de perfusión con un ciclo cerrado de fluido10,13 (figura 1). El catéter de proyección de imagen de OCT fue insertado en el extremo distal de la Unión Y y hacia atrás en el tubo de silicona para la proyección de imagen. Proyección de imagen de OCT fue utilizado primero para delinear la caracterización estructural de biodegradables TEBVs poliméricos basados en el andamio durante el cultivo del biorreactor.

Figura 2 mostró el proceso de remodelado vascular dirigido a través de estas sección de imágenes de la microestructura del tejido en tiempo real. Se evaluó la morfología geométrica, como espesor de la pared, degradable contenido del PGA, comparación de espesor TEBV en momentos diferentes de la cultura, así como la presencia del estímulo pulsátil. Se observó una tendencia de disminución de espesor y dramáticamente los cambios de ingeniería tejido dentro de las primeras dos semanas de la cultura, sugiriendo señal-rico PGA degradación gradual y la estructura del nuevo tejido de suelta a apretado. A los 21 días en la cultura, la vasculatura había formado una estructura suave con matriz extracelular uniformemente distribuidos y componentes de alta señal en su mayoría se disipó. El espesor de pared de TEBVs con señal incluso aumentado gradualmente después de tres semanas de la cultura. Esta remodelación se produjo antes y los cambios morfológicos se manifiestan más evidentemente en la dinámica grupal (figura 3). Tal modo OCT permite la proyección de imagen de la morfología vascular dirigido a visualizar in situ y en tiempo real en el curso de cultura de larga duración.

Figura 4 en comparación con imágenes de OCT con hallazgos histopatológicos de TEBV después de 4 semanas de la cultura. Tinción tricrómica de Masson muestra las fibras de colágeno distribuidas en una cierta dirección junto con el remanente de la PGA en la capa media de vasos diseñados (Figura 4B). Coloración de Sirius rojo reveló restos de PGA y el componente de colágeno mediante el uso de un microscopio polarizado (figura 4). Análisis micrográfos de electrón de buques diseñados con microestructura compacta fueron comparados con la evaluación histológica (figura 4). Tomados en conjunto, las imágenes de OCT demostraron que PGA era de diferentes tamaños y estructura de la red porosa. La estructura del andamio de la PGA no tiene ningún cambio evidente e hinchado por el contacto directo con medio de cultivo en la etapa temprana de la cultura. Pero se redujo la intensidad de la señal de la PGA. Componentes de PGA fue desintegrado y reemplazado por células y matriz extracelular. Menos fragmentos fueron vistos más de cuatro semanas. Imágenes de SEM de la sección buques ingeniería demostraron la ruptura de la fibra a la extensión del tiempo de incubación. Materiales compuestos de matriz extracelular y materiales fueron en panal-como la estructura más compacta y menos transparencia.

Figure 1
Figura 1 . Esquema de tejido ingeniería sistema vascular de la cultura, que consistió en una cámara de cultivo en el biorreactor y el sistema de perfusión para la proyección de imagen de OCT. La bomba pulsátil proporciona un flujo de fluido estable simulando el microambiente biomecánico. Catéter de OCT fue retirado en el tubo de silicona en el compartimiento de la cultura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . La microestructura del tejido diseñado vasos sanguíneos durante cultura. Con el tiempo de la cultura, PGA señal-rico gradualmente degradada y la estructura del nuevo tejido apretado era de flojo. TEBVs tenía una suave matriz extracelular abundante y superficial distribuida después de cuatro semanas de la cultura. Demostró el proceso de remodelado vascular dirigido a través de imágenes transversales en tiempo real. Esta figura ha sido modificada desde Chen, w. et al. 10 el grueso del tubo de silicona utilizado aquí es 0,8 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Comparación del cambio de espesor de pared TEBV durante el remodelado vascular en grupos estáticos y dinámicos obtenidos de mediciones OCT. Barras de error indican el error estándar. Esta figura ha sido modificada desde Chen, w. et al. 10 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . Proyección de imagen de biodegradable con polímeros tejido-dirigida vasos. (A) imagen de el OCT de TEBV después de cuatro semanas de la cultura. M: medio de cultivo; S: tubo de silicona de; el grueso del tubo de silicona utilizado aquí es 0,8 mm. Flecha blanca indica TEBV. Flecha roja indica el fragmento de la PGA. (B) tinción tricrómica de Masson demostró las fibras de colágeno bien organizado junto con el contenido residual de PGA en la capa media de vasos diseñados. Barra de escala = 100 μm. (C) Sirius rojo tinción reveló PGA restos utilizando un microscopio polarizado. Flecha verde indica el fragmento de la PGA. Barra de escala: 100 μm. (D) exploración micrográfos de electrón de recipiente diseñado con microestructura compacta se demostró al comparar con evaluación histológica. Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Generar ingeniería vasos con estructural y propiedades mecánicas similares a los de nativos de los vasos sanguíneos pueden conducir a reducir el tiempo de uso clínico y es la última meta de la ingeniería vascular. Técnicas de imagen ópticas permiten la visualización de los componentes específicos vasculares ingeniería tisular, que no puede controlar construcciones individuales a través de injertos de la cultura y la exposición a un ambiente de cultura sin comprometer la esterilidad7. En este artículo, el compartimiento de la cultura se separa del sistema de perfusión. El sistema de perfusión relativamente independiente garantiza el riesgo de disminución de la contaminación durante el cultivo y la colocación de la guía de OCT. Mientras tanto este intramural imagen modalidad aprobado fácil y seguridad seguimiento de TEBVs en situs con alta resolución acerca de la histopatología, los hacen más práctica la evaluación del estado de crecimiento de TEBV y fue incluso espera utilizar antes o después de la colocación de implantes.

El protocolo actual indica una estrategia de proyección de imagen fácilmente disponible, en tiempo real rápida y no destructiva para evaluar desarrollo de buque diseñado con polímeros degradables OCT basadas en catéter. Mediante la observación del proceso dinámico, algunos principales factores que afectan la ingeniería vascular, como la contaminación o una interacción del material de la célula condujo a la pérdida de tejido, pueden distinguirse con la detección temprana. Pasos críticos para asegurar la eficacia del protocolo incluyen la fabricación de andamios PGA modificados de NaOH, exitosa siembra de HUASMCs en el andamio, catéter especializado operación proceso y sistema de cultivo estéril de separación del sistema de monitoreo rápido .

Esta técnica puede utilizarse para evaluar Estados de degradación y la compleja estructura de andamios de PGA mezclados con tejido nuevo. El andamio polimérico con estructura de la red porosa se degrada poco a poco y domina el proceso de remodelado vascular en las primeras tres semanas, que son importantes para la adhesión celular y la deposición de matriz extracelular con una estructura de tres dimensiones para intercambio de nutrientes y como una señal portadora15,16. Para la cuantificación del remanente de la PGA en ingeniería recipientes claramente identificados por Sirius imágenes teñidas de rojo, el uso de microscopios polarizados17 en ingeniería vascular basada en andamio degradable tiene el potencial para convertirse en la evaluación estándar después de cultivo. Por lo tanto, la proyección de imagen de OCT combinada con microscopio polarizado podría servir de métodos cualitativos y cuantitativos para evaluar la degradación de la PGA en ingeniería vascular.

Una limitación de esta técnica es el límite de resolución para evaluar interacción de proliferación, distribución, célula-célula y célula-ECM de célula durante el remodelado vascular ingeniería. Esperamos encontrar el método adecuado para investigar la microestructura de la TEBVs a nivel celular o subcelular18 y cuantificar la cinética de crecimiento. Con análisis cuantitativo de promedio de las señales ópticas de proyección de imagen de OCT, seamos más conscientes del mecanismo de degradación del material en ingeniería vascular. Tales experimentos se están considerando para nuestros futuros estudios.

En general, nuestros resultados muestran que la OCT es un fácilmente disponible, en tiempo real rápida y no destructiva imagen estrategia para controlar el crecimiento y remodelación de TEBVs. Se utiliza para caracterizar elementos arquitectónicos estructurales y el proceso de remodelación a largo plazo de los buques diseñados. La aplicación del microscopio polarizado que proporcionan evidencia adicional para la cuantificación del remanente poliméricos en buques diseñados podría ser útil para evaluar la degradación de andamio combinada con proyección de imagen de OCT. Tomados en conjunto, el protocolo actual tiene valor promisorio de OCT para su aplicación en la ingeniería de tejido vascular.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Nos gustaría reconocer la ciencia y la tecnología de planificación de proyecto de la provincia China de Guangdong (2016B070701007) para apoyar este trabajo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PGA mesh Synthecon
silicone tube Cole Parmer
connector Cole Parmer
intravascular OCT system St. Jude Medical, Inc ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM
scanning electron microscopic Philips FEI Philips XL-30
polarized microscope Olympus Olympus BX51
sutures Johnson & Johnson
pulsatile pump Guangdong Cardiovascular Institute
LightLab Imaging software St. Jude Medical, Inc

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References

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Chen, W., Liu, S., Yang, J., Wu, Y., Ma, W., Lin, Z. Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (140), e58040, doi:10.3791/58040 (2018).More

Chen, W., Liu, S., Yang, J., Wu, Y., Ma, W., Lin, Z. Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (140), e58040, doi:10.3791/58040 (2018).

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