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Biochemistry

समुद्र Lamprey Pheromones की पहचान परख का उपयोग-निर्देशित भिंन

Published: July 17, 2018 doi: 10.3791/58059
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Fisheries and Wildlife, Michigan State University

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल को अलग और संरचना, घ्राण शक्ति, और ख्यात फेरोमोन यौगिकों के सागर lampreys के व्यवहार प्रतिक्रिया की विशेषता प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

परख निर्देशित भिंन एक चलने दृष्टिकोण है कि शारीरिक और व्यवहार परख के परिणामों का उपयोग करता है अलगाव और एक सक्रिय फेरोमोन यौगिक की पहचान गाइड है । इस विधि रासायनिक संकेतों है कि पशु प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला में pheromones के रूप में कार्य के सफल लक्षण वर्णन में हुई है । सागर lampreys व्यवहार या शारीरिक प्रतिक्रियाओं मध्यस्थता pheromones का पता लगाने के लिए olfaction पर निर्भर करते हैं । हम ख्यात pheromones के मंज़ूर कार्यों के लिए मछली जीवविज्ञान के इस ज्ञान का उपयोग करें और अलगाव और सक्रिय फेरोमोन घटकों की पहचान गाइड । क्रोमैटोग्राफी को निकालने, ध्यान केंद्रित करने, और वातानुकूलित पानी से अलग यौगिकों का प्रयोग किया जाता है । इलेक्ट्रो-olfactogram (EOG) रिकॉर्डिंग का निर्धारण करने के लिए आयोजित की जाती हैं जो भिन्न घ्राण प्रतिसादों को बाहर लाना. दो विकल्प भूलभुलैया व्यवहार परख तो अगर कोई भी गंध अंश का यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है व्यवहार से सक्रिय है और एक वरीयता प्रेरित । Spectrometric और स्पेक्ट्रोस्कोपी तरीके आणविक वजन और संरचनात्मक जानकारी प्रदान करने के लिए संरचना elucidation के साथ सहायता करते हैं । शुद्ध यौगिकों की EOG और व्यवहार परख के साथ की पुष्टि की है । भूलभुलैया में मनाया व्यवहार प्रतिक्रियाओं अंततः एक प्राकृतिक स्ट्रीम सेटिंग में उनके समारोह की पुष्टि करने के लिए एक क्षेत्र की स्थापना में मान्य किया जाना चाहिए. इन परख 1 करने के लिए एक दोहरी भूमिका निभाते हैं) अंश प्रक्रिया गाइड और 2) की पुष्टि करें और आगे अलग घटकों की अधिकता को परिभाषित । यहां, हम एक समुद्र lamprey फेरोमोन पहचान के प्रतिनिधि परिणामों की रिपोर्ट है कि उदाहरण देना परख की उपयोगिता-निर्देशित भिंन दृष्टिकोण । समुद्र lamprey pheromones की पहचान विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि इसकी फेरोमोन संचार प्रणाली का एक मॉडुलन Laurentian महान झीलों में इनवेसिव समुद्र lamprey को नियंत्रित करने के लिए विचार किया विकल्पों में से एक है । इस विधि को आसानी से taxa की एक व्यापक सरणी में रासायनिक संचार की विशेषताएं और जलजनित रासायनिक पारिस्थितिकी पर प्रकाश डाला अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

Pheromones विशिष्ट रासायनिक व्यक्तियों द्वारा जारी संकेत है कि उंहें खाद्य स्रोतों का पता लगाने में सहायता कर रहे हैं, शिकारियों की पहचान, और मध्यस्थता के सामाजिक बातचीत के विशिष्ट1। कीड़ों में फेरोमोन संचार अच्छी तरह से2अध्ययन किया गया है; हालांकि, जलीय हड्डीवाला pheromones की रासायनिक पहचान और जैविक कार्य के रूप में बड़े पैमाने पर अध्ययन नहीं किया गया है । पहचान और pheromones के समारोह का ज्ञान जारी की धमकी दी प्रजातियों की वसूली की सुविधा के लिए लागू किया जा सकता है3,4 या नियंत्रण कीट प्रजातियों5,6। इन तकनीकों के आवेदन अलगाव और आवश्यक के लक्षण वर्णन सक्रिय फेरोमोन घटकों ।

फेरोमोन पहचान प्राकृतिक उत्पाद रसायन विज्ञान की एक शाखा है । फेरोमोन अनुसंधान में प्रगति आंशिक रूप से फेरोमोन अणुओं की प्रकृति के कारण खुद को सीमित किया गया है । Pheromones अक्सर अस्थिर और छोटी मात्रा में जारी कर रहे हैं, और केवल कुछ नमूना तकनीक अस्थिर7,8 या पानी में घुलनशील यौगिकों9की मिनट की मात्रा का पता लगाने के लिए मौजूद हैं । pheromones की पहचान करने के लिए दृष्टिकोण शामिल 1) ज्ञात यौगिकों, 2) metabolomics के एक लक्षित स्क्रीनिंग, और 3) परख निर्देशित भिंन । ज्ञात यौगिकों की लक्षित स्क्रीनिंग pheromones के रूप में कार्य करने के लिए परिकल्पना शारीरिक प्रक्रियाओं के उत्पादों द्वारा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चयापचय परीक्षण । इस दृष्टिकोण क्योंकि शोधकर्ताओं केवल ज्ञात और उपलब्ध यौगिकों का परीक्षण कर सकते है सीमित है । हालांकि, यह सुनहरी में सेक्स हार्मोन की सफल पहचान के परिणामस्वरूप है कि pheromones10,11,12के रूप में कार्य करते हैं । Metabolomics एक दूसरी फेरोमोन पहचान दृष्टिकोण है कि एक जैविक प्रणाली13के भीतर संभावित छोटे अणु चयापचय उत्पादों को अलग है । दो समूहों के चयापचय प्रोफाइल की तुलना (यानी, एक सक्रिय बनाम एक निष्क्रिय निकालने) एक संभावित चयापचय प्रोफ़ाइल की पहचान है जिसमें से metabolite शुद्ध है सक्षम बनाता है, संरचना का आविर्भाव है, और 14की पुष्टि की है । विशिष्ट मिश्रण के जटिल योगों के Additive या synergistic प्रभाव अधिक metabolomics के साथ पता लगाया जा करने के लिए संभावना है क्योंकि चयापचयों एक साथ के बजाय भागों13की एक श्रृंखला के रूप में माना जाता है । फिर भी, metabolomics के कार्यांवयन सिंथेटिक संदर्भ की उपलब्धता पर निर्भर करता है क्योंकि परिणामी डेटा उपंयास संरचनाओं के elucidation की सुविधा नहीं है ।

परख-निर्देशित भिंन एक एकीकृत, चलने दृष्टिकोण है कि दो क्षेत्रों spans: रसायन विज्ञान और जीव विज्ञान है । इस दृष्टिकोण शारीरिक और व्यवहार परख के परिणाम के लिए अलगाव और एक सक्रिय फेरोमोन यौगिक की पहचान गाइड का उपयोग करता है । एक कच्चे तेल निकालने एक रासायनिक संपत्ति (यानी, आणविक आकार, ध्रुवीकरण, आदि) और इलेक्ट्रो-olfactogram (EOG) रिकॉर्डिंग और के साथ परीक्षण द्वारा fractionated है/ विक्रियाशील घटकों को भिन्नीकरण और EOGs के इन कदमों को दोहराने से दिखलाई पड़ जाती है और/ शुद्ध सक्रिय यौगिकों की संरचनाओं spectrometric और स्पेक्ट्रोस्कोपी विधियों, जो आणविक वजन और संरचनात्मक जानकारी प्रदान करने के लिए यौगिक का एक खाका संश्लेषित किया जा उत्पादन के द्वारा आविर्भाव होते हैं । परख निर्देशित भिन्नीकरण अद्वितीय रासायनिक कंकाल है कि जैव सिंथेटिक रास्ते से भविष्यवाणी की जाने की संभावना नहीं है के साथ विविध चयापचयों और संभावित उपंयास pheromones उपज कर सकते हैं ।

यहां, हम परख निर्देशित भिन्नीकरण प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए अलग और पुरुष समुद्र lamprey सेक्स फेरोमोन यौगिकों की गैर-सक्रियता विशेषताएं । समुद्र lamprey (Petromyzon marinus) फेरोमोन संचार का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श हड्डीवाला मॉडल है क्योंकि इन मछलियों रासायनिक cues के घ्राण का पता लगाने पर भारी भरोसा करने के लिए अपने anadromous जीवन तीन अलग चरणों के शामिल इतिहास मध्यस्थता: लार्वा, जुवेनाइल, और वयस्क । समुद्र lamprey लार्वा मीठे पानी धाराओं की तलछट में चिपमंक, एक कठोर कायापलट से गुजरना, और वे बड़े मेजबान मछली परजीवी जहां एक झील या महासागर के लिए पलायन कि किशोरों में बदलना । मेजबान मछली से अलग करने के बाद, वयस्कों वापस नदियों में स्थानांतरित, प्रवासी धारा द्वारा जारी pheromones द्वारा निर्देशित-निवासी लार्वा15,16,17,18,19 . परिपक्व पुरुषों को पैदा करने के आधार पर चढ़ना, एक बहु घटक सेक्स फेरोमोन साथियों को आकर्षित करने के लिए, पड़े लगभग एक सप्ताह के लिए अंडे, और फिर मरने15,20। समुद्र lamprey pheromones की पहचान महत्वपूर्ण है क्योंकि फेरोमोन संचार प्रणाली का एक मॉडुलन Laurentian ग्रेट झील21में इनवेसिव समुद्र lampreys को नियंत्रित करने के लिए माना जाता विकल्पों में से एक है ।

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Protocol

सभी तरीकों यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और मिशिगन राज्य विश्वविद्यालय के उपयोग समिति (AUF # 03/14-054-00 और 02/17-031-00) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. संग्रह और समुद्र Lamprey वातानुकूलित पानी की निकासी

  1. वातित झील हुरॉन पानी की २५० एल के साथ आपूर्ति की एक टैंक में यौन परिपक्व पुरुष सागर lampreys (15-30 पशु) प्लेस 16-18 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा ।
  2. जून से जुलाई तक प्रत्येक रात में नर-वातानुकूलित पानी एकत्र करें ।
    नोट: समुद्र lampreys स्वाभाविक रूप से अंडे के बाद मर जाते हैं । यदि एक मछली अपने जीवन में इस बिंदु के निकट है, यह एक ताजा परिपक्व पुरुष के साथ बदलें ।
  3. ठोस चरण निष्कर्षण द्वारा वातानुकूलित पानी निकालें ।
    1. यह एक कॉलम में लोड करने से पहले 4 ज के लिए मेथनॉल में राल सोख । कॉलम में राल लोड, तो कॉलम के माध्यम से पानी की 10 एल पंप के लिए कार्बनिक विलायक खत्म ।
    2. पंप प्रणाली कॉलम के शीर्ष करने के लिए के माध्यम से मछली पकड़ टैंक से वातानुकूलित पानी दर्रा । पानी मामूली ध्रुवीय बहुलक आयन के 2 किलो के एक बिस्तर के माध्यम से गुजरता है-विनिमय राल (जैसे, Amberlite XAD-7 HP राल), चार २.५ एल की एक श्रृंखला में समाहित-क्षमता ग्लास कॉलम । ४०० और ६०० मिलीलीटर के बीच लोड गति बनाए रखें/Elute के 10 l के साथ चयापचयों को मेथनॉल के तुरंत बाद 5 l से एसीटोन.
      चेतावनी: यह चरण मेथनॉल और एसीटोन का उपयोग करता है । दोनों ज्वलनशील और जहरीले हैं ।
      नोट: जमा अवशिष्ट पर संग्रहीत किया जा सकता-८० ° c जब तक आगे की कार्रवाई की ।
  4. यह पानी (लगभग 10 एल) के साथ धुलाई से संवर्धन के 1 सप्ताह के बाद कॉलम को पुनः सक्रिय करें ।
  5. कार्बनिक विलायक (मेथनॉल और पानी का मिश्रण) को हटा दें और कम दबाव के तहत 5 एच के लिए rotatory वाष्पीकरण से निकालने (३०० mbar के तहत) ४० डिग्री सेल्सियस पर फसल । पानी के अवशेषों को फ्रीज ड्रायर lyophilization द्वारा ४८ घंटे के लिए ध्यान केंद्रित-20 ° c जब तक सूखी ।

2. क्रोमैटोग्राफी के साथ अंश ताल का अलगाव

  1. सिलिका जेल (२३०-४०० मेष) भिगोने के लिए प्रारंभिक मोबाइल चरण में 30 मिनट के लिए एक गिलास कॉलम के लिए विलायक (निलंबन) के साथ जेल स्थानांतरण । मोबाइल चरण के माध्यम से जाने के लिए अनुमति देने के लिए कॉलम के वाल्व खोलो । सिलिका जेल को तेज करने और सिलिका जेल बिस्तर बनाने की अनुमति दें ।
  2. अर्क सिलिका जेल (७०-२३० मेष) के साथ अच्छी तरह से मिश्रण है और उन्हें सिलिका जेल बिस्तर पर तरल क्रोमैटोग्राफी कॉलम में लोड । Elute उंहें एक ढाल के साथ ९५% CHCl3 (क्लोरोफॉर्म)/MeOH (मेथनॉल) से १००% MeOH, २.५ एल कुल मात्रा में । eluent को व्यक्तिगत शीशियों (प्रत्येक 10 मिलीलीटर) में इकट्ठा करें ।
    चेतावनी: इस चरण में प्रयुक्त क्लोरोफॉर्म एक जहरीला एजेंट है ।
  3. एक पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) विश्लेषण द्वारा 20 भागों में eluents के पूलिंग गाइड ।
    1. पूर्व लेपित सिलिका जेल प्लेटों पर टीएलसी प्रयोग शुरू लाइन पर नमूना लागू करने और प्लेट के विकासशील सॉल्वैंट्स में शुरू लाइन विसर्जित करके (CHCl3 के अनुपात से मेथनॉल के लिए ध्रुवीयता चुनें-0%) एक सील गिलास में) टैंक.
    2. ०.३-०.८ से लेकर एक प्रतिधारण कारक (आरएफ) के साथ सभी टीएलसी धब्बे बनाने के लिए विलायक विकसित करने के अनुपात का चयन करें ।
    3. के बाद विकासशील विलायक अंत लाइन तक पहुंचता है, टैंक के बाहर थाली ले, और विलायक के लिए 10 मिनट प्रतीक्षा को लुप्त हो जाना ।
    4. २५४ एनएम पर यूवी प्रकाश के तहत पहले धब्बे कल्पना और फिर उंहें एक क्रोमैटोग्राफी स्प्रेयर द्वारा 5% anisaldehyde (20 μL) के एक अंलीय मेथनॉल समाधान के साथ छिड़काव और उंहें ८५ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए हीटिंग द्वारा दाग ।
      नोट: टीएलसी प्लेट पर रंगीन धब्बे अंश में मुख्य घटक का संकेत देते हैं ।
    5. स्पॉट रंग और मुख्य घटक के आरएफ समानता के आधार पर 20 भागों के लिए eluent का मिश्रण ।
  4. कम दबाव के तहत rotatory वाष्पीकरण द्वारा एक अवशेष को अंश ध्यान (३०० mbar सॉल्वैंट्स की संपत्ति के अनुसार) ४० डिग्री सेल्सियस पर लगभग 30 मिनट के लिए ।

3. इलेक्ट्रो-olfactogram (EOG) रिकॉर्डिंग की पहचान करने के लिए सुगंधित अंशों/

  1. borosilicate ग्लास केशिकाओं खींचो (बाहरी व्यास: १.५ मिमी; भीतरी व्यास: ०.८६ मिमी; लंबाई: १०० मिमी) के साथ एक micropipette खींचने हीटर स्तर ६५ करने के लिए सेट के साथ.
  2. स्कोर और एक हीरे की इत्तला दे दी ग्लास कटर के साथ केशिका की नोक पर खोलने में कटौती और यह पिघला हुआ ०.४% के साथ ०.९% खारा में आगर भरें । केशिकाओं की नोक पर खोलने के व्यास में लगभग 10 µm होना चाहिए ।
  3. खींच केशिका इलेक्ट्रोड चरणों से ३.१-३.२ और ठोस राज्य इलेक्ट्रोड धारकों के साथ पूर्व गढ़े एजी/AgCl छर्रों ( सामग्री की तालिकादेखें) 3 एम KCl एक micropipette का उपयोग कर के साथ भरें ।
    नोट: केशिका या इलेक्ट्रोड धारक में किसी भी हवा के बुलबुले को उखाड़ फेंक ।
  4. इलेक्ट्रोड धारकों में खींच इलेक्ट्रोड डालें ।
  5. एक volumetric कुप्पी में 10-2 एम एल-arginine स्टॉक समाधान में arginine पानी (4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित) से चारकोल-फ़िल्टर्ड पानी में १०-५ एम एल-के १०० मिलीलीटर तैयार करें । 10-5 एम एल-arginine के 20 मिलीलीटर एक गिलास शीशी में स्थानांतरित करें ।
  6. एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र के लिए, 10 मिलीलीटर की 10-गुना कमजोर पड़ने वाले अंश पूल से ग्लास शीशियों में २.३ के लिए तैयार करें । दैनिक प्रयोगों से पहले ताजा कमजोरियां तैयार करें और उन्हें एक दिन के भीतर इस्तेमाल करे । एल-arginine और अंश पूल कमजोर पड़ने के काम के समाधान के गिलास शीशियों रखो एक पुनर्संचारित पानी में स्नान करने के लिए तापमान equilibrate करने के लिए अनुमति देने के लिए 8 ° c.
  7. Anesthetize के साथ lamprey 3-aminobenzoic एसिड एथिल एस्टर (MS222; १०० mg/L) और यह इंट्रामस्क्युलर gallamine के एक triethiodide इंजेक्शन के साथ स्थिर (3 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन, में ०.९% खारा) एक बाँझ सिरिंज के साथ.
    ध्यान दें: संज्ञाहरण के एक पर्याप्त गहराई कोई गिल गति, एक ईमानदार मुद्रा बनाए रखने के लिए एक अक्षमता, और अपने मौखिक डिस्क का उपयोग कर टैंक के पक्षों को कोई चूषण देख द्वारा निर्धारित किया जाता है । पहले और शल्य चिकित्सा के दौरान किसी भी माइक्रोबियल संक्रमण को कम करने के लिए, बाँझ दस्ताने पहनते हैं और उपयोग करने से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए जल में ७०% इथेनॉल (v:v) में विच्छेदन उपकरण सोख ।
  8. ओरिएंट एक वी के आकार का स्टैंड में anesthetized lamprey और यह एक गीला कागज तौलिया के साथ लपेटो को रोकने के लिए सुखाना ।
    नोट: गिल ओपनर्स को बाधा न करें ।
  9. परिसंचारी वातित पानी की एक ट्यूब डालें ५० मिलीग्राम/L MS222 के buccal गुहा में, प्रवाह की दर को समायोजित करें, और यह सुनिश्चित करें कि पानी गिल उद्घाटन के माध्यम से बाहर निकलने के लिए लगातार गिल सिंचाई ।
  10. एक बाँझ स्केलपेल और संदंश [त्रिविम माइक्रोस्कोप के तहत एक 1.25 x आवर्धन पर का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें)] घ्राण उपकला बेनकाब करने के लिए घ्राण कैप्सूल की सतह पर त्वचा के एक 5 मिमी2 अनुभाग को दूर करने के लिए.
  11. फ़िल्टर्ड पानी के साथ सुगंधित प्रसव टयूबिंग फ्लश और यह एक micromanipulator पर घुड़सवार वाल्व को जोड़ने । odorants प्रशासन नहीं जब सुखाना को रोकने के लिए घ्राण उपकला को फ़िल्टर्ड पानी देने के लिए micromanipulator का उपयोग घ्राण उपकला गुहा में गंध प्रसव केशिका ट्यूब प्लेस.
  12. micromanipulators पर रिकॉर्डिंग और संदर्भ इलेक्ट्रोड माउंट. नारी के पास बाहरी त्वचा पर संदर्भ इलेक्ट्रोड कम. त्रिविम माइक्रोस्कोप का उपयोग करना (1.25 x), कम रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए मुश्किल से घ्राण उपकला की सतह को छूने.
  13. 10-5 एम एल-arginine समाधान के लिए पृष्ठभूमि फ़िल्टर किए गए पानी से गंध डिलीवरी ट्यूब के ऊपर स्थानांतरण ।
  14. कंप्यूटर, एम्पलीफायर (डीसी मोड के लिए सेट), फिल्टर, और डिजिटलर पर बारी. वाल्व चालक सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, प्रक्रिया प्रोग्राम T1 के बॉक्स की जाँच करके एक 4 एस की एक नाड़ी की एकल पल्स प्रशासन के लिए, 4 एस के लिए टी की स्थापना, और 2 टी के बॉक्स की जाँच.
  15. डेटा प्राप्ति सॉफ़्टवेयर ( सामग्री तालिकादेखें) में, प्राप्ति मोड को एक उच्च-गति आस्टसीलस्कप पर सेट करें, play चिह्न पर क्लिक करके, और फिर गंध वाले पल्स को ट्रिगर करने के लिए वॉल्व ड्राइवर में प्रारंभ करें पर क्लिक करे.
    नोट: डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से 20 एस के लिए अंतर EOG प्रतिक्रिया आयाम रिकॉर्ड (3 एस से पहले, 4 एस के दौरान गंध पल्स और 13 एस इसके बाद) । रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड, संदर्भ इलेक्ट्रोड, या गंध डिलीवरी ट्यूब के पदों को पैंतरेबाज़ी करने के लिए micromanipulator का उपयोग करें L-arginine मानक और रिक्त नियंत्रण के लिए एक न्यूनतम प्रतिक्रिया के लिए एक अधिकतम प्रतिक्रिया के साथ संकेत करने के लिए शोर अनुपात में वृद्धि करने के लिए ( छान पाणी). GND के लिए एसी-डीसी एम्पलीफायर स्विच स्विचन द्वारा एम्पलीफायर जमीन जबकि इलेक्ट्रोड चलती.
  16. खाली नियंत्रण रिकॉर्डिंग शुरू, एल arginine, और फिर odorants चरण ३.६ में एक 2 मिनट के साथ कम से उच्च सांद्रता के लिए तैयार अनुप्रयोगों के बीच फ़िल्टर्ड पानी की फ्लश ।
  17. परीक्षण किया जा करने के लिए सभी odorants के लिए प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग के बाद, जमीन एम्पलीफायर और ध्यान से इलेक्ट्रोड और गंध वितरण केशिका ट्यूब वापस लेना. अनुमोदित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) विधियों के बाद, EOG प्रयोग की समाप्ति पर, lamprey (1 g/L) की ओवरडोज के साथ anesthetized MS222 को euthanize है ।
    नोट: मस्तिष्क सारगर्भित द्वारा पीछा गिल आंदोलन और दिल की धड़कन की कमी के लिए कम से कम 5 मिनट का अभाव टिप्पण द्वारा सफल इच्छामृत्यु की पुष्टि करें ।
  18. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर डेटा प्लॉट करें । odorants22 का पता लगाने की दहलीज निर्धारित करने के लिए सुगंधित भिन्न है कि खाली पानी के नियंत्रण से अधिक प्रतिक्रिया बटोरना की पहचान । अंश पूल कि ध्यान में लाना एकाग्रता पर निर्भर घ्राण प्रतिक्रियाओं कि कोरा पानी नियंत्रण से अलग है तो एक व्यवहार परख (चरण 4) में परीक्षण कर रहे हैं ।

4. दो विकल्प भूलभुलैया व्यवहार परख व्यवहार सक्रिय अंशों की पहचान करने के लिए/

  1. Acclimate भूलभुलैया में रिलीज पिंजरे में यौन परिपक्व महिला समुद्र lamprey ( अनुपूरक चित्रा 1देखें) 5 मिनट के लिए । भूलभुलैया में नदी के पानी का प्रवाह दर बनाए रखें
    नोट: भूलभुलैया वार्निश समुद्री ग्रेड लकड़ी और उपायों लंबाई में ६.५ मीटर और १.२ मीटर लंबाई में एक विभक्त २.७ मीटर को मापने के साथ चौड़ाई में से बनाया गया है ऊपर अंत में दो चैनलों में भूलभुलैया अलग । पानी को भूलभुलैया में अस्थाई तौर पर डायवर्ट किया गया है । पानी की गहराई ०.१९ मीटर पर बनाए रखा जाना चाहिए और वेग ०.०७ मी ± ०.०१ पर बनाए रखा जाना चाहिए ।
  2. समुद्र lamprey जारी है और समय की संचयी राशि lamprey प्रयोगात्मक और नियंत्रण चैनल में खर्च करता है प्रत्येक 10 मिनट के लिए नदी के पानी से युक्त रिकॉर्ड.
    नोट: यदि समुद्र lamprey के लिए प्रयोगात्मक और नियंत्रण चैनल में प्रवेश करने में विफल रहता है इस 10 मिनट के दौरान ंयूनतम 10 एस, परीक्षण अंत, के रूप में यह निष्क्रियता या मजबूत पक्ष पूर्वाग्रह का एक संकेत है ।
  3. परीक्षण उत्तेजना लागू करें (यानी, 10 पर एक ख्यात फेरोमोन-12 मीटर ५०% मेथनॉल/जल में भंग) बेतरतीब ढंग से सौंपा प्रयोगात्मक चैनल के लिए और वाहन (५०% मेथनॉल/जल) नियंत्रण चैनल के लिए सिकुड़नेवाला का उपयोग २०० मिलीलीटर की लगातार दरों पर पंपों 5 मिनट के लिए/
    नोट: जांच सीमा के रूप में इलेक्ट्रो-olfactogram रिकॉर्डिंग के साथ निर्धारित परीक्षण उत्तेजना के एकाग्रता व्यवहार परीक्षण के लिए प्रारंभिक एकाग्रता के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  4. एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए परीक्षण उत्तेजना और वाहन लागू करें और समय की संचई राशि रिकॉर्ड lamprey प्रयोगात्मक और नियंत्रण चैनल में खर्च करता है ।
  5. अगले परीक्षण के शुरू होने से पहले 10 मिनट के लिए पानी के साथ भूलभुलैया फ्लश । दोहराएं चरण ४.१-४.४ के साथ कम से 7 lampreys यदि पर्याप्त परीक्षण उत्तेजना उपलब्ध है ।
  6. प्रत्येक परीक्षण के लिए22 वरीयता के सूचकांक की गणना और एक Wilcoxon पर हस्ताक्षर किए रैंक परीक्षण का उपयोग कर महत्व का मूल्यांकन ।
    नोट: अनुक्रमणिका परिणाम सकारात्मक या नकारात्मक हो सकते हैं जो किसी एकल संख्या में है । वरीयता के सूचकांक के एक सकारात्मक मूल्य आकर्षण इंगित करता है, जबकि वरीयता संकेत प्रतिकारक के सूचकांक का एक नकारात्मक मूल्य । यदि वरीयता के सूचकांक शूंय से काफी अलग है, अंश सक्रिय समझा जाता है ।
    Equation
    यहाँ
    Bc = गंध आवेदन से पहले नियंत्रण चैनल में परीक्षण lamprey द्वारा खर्च समय,
    बीई = समय से पहले प्रयोगात्मक चैनल में खर्च, गंध आवेदन,
    एकसी = गंध आवेदन के बाद नियंत्रण चैनल में बिताया समय है, और
    एकई = समय के लिए प्रयोगात्मक चैनल में खर्च के बाद गंध आवेदन ।

5. सक्रिय अंशों से शुद्ध यौगिकों का क्रोमेटोग्राफिक अलगाव

  1. दोहराएँ चरण २.१-२.४ अंश पूल कि घ्राण प्रतिसाद (चरण 3) के लिए प्रेरित और व्यवहार प्रतिसाद (चरण 4) को दर्ज करने के साथ ।
  2. इसके अलावा एक Sephadex LH-20 कॉलम का उपयोग कर आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के साथ यौगिकों में सक्रिय अंशों को शुद्ध ।
    1. नमूना प्रारंभिक मोबाइल चरण में ०.५ मिलीलीटर में तैयार [CHCl3-MeOH (1:1) या MeOH १००%], इसी कॉलम में लोड एक CHCl3-MeOH (1:1) कॉलम और फिर एक MeOH (१००%) कॉलम, और उंहें elute उपज यौगिकों ।

6. मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) और नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) के साथ एक शुद्ध यौगिक की संरचना Elucidation

  1. भंग और प्रारंभिक मोबाइल चरण में शुद्ध यौगिक पतला (आमतौर पर, मेथनॉल करने के लिए पानी, 1:1, v:v) उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) के एक 10 μL समाधान के रूप में लगभग 1 μg/
    1. HPLC शीशियों के लिए नमूना समाधान स्थानांतरण और उन्हें HPLC का नमूना में सेट. electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ESIMS) में नमूना (10 μL) इंजेक्षन और उच्च संकल्प electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HRESIMS) स्पेक्ट्रा एक क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमीटर23का उपयोग कर रिकॉर्ड.
  2. की भविष्यवाणी आणविक फार्मूला मास स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ्टवेयर में डाटाबेस के अनुसार ( सामग्री की तालिकादेखें)24।
    1. इंजेक्शन के नमूने के वर्णलेख खोलें और क्रोमेटोग्राफिक चोटी का चयन करके अपने बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम प्राप्त करते हैं ।
    2. इनपुट के लिए मापा द्रव्यमान आयन (एम/z) मान (4 दशमलव) उपकरण मॉड्यूल के अंतर्गत तात्विक संरचना में. सह्य पैरामीटर को पीपीएम < 5 पर सेट करें ।
    3. मापा अणु के तत्व संरचना फिट करने के लिए प्रतीक मापदंडों को समायोजित करें । सॉफ्टवेयर एक बड़े पैमाने पर विश्लेषण के आधार पर आणविक फार्मूला की भविष्यवाणी पैदा करता है ।
  3. का चयन करें deuterated सॉल्वैंट्स (६०० μL, CH3ओह-डी4 या DMSO-d6) के अनुसार प्रोटोकॉल25 नमूनों को भंग करने के लिए ।
    1. पूरी तरह से चयनित deuterated सॉल्वैंट्स में नमूना भंग करने के लिए एक एकाग्रता के साथ एक समाधान फार्म के लिए लगभग ०.१ से 10 मिलीग्राम/ 1 डी (1एच, 13सी) और 2d एनएमआर रिकॉर्ड करने के लिए एक एनएमआर ट्यूब में नमूना समाधान हस्तांतरण [१एच-1एच सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (मधुर), heteronuclear एकल क्वांटम जुटना (HSQC), heteronuclear एकाधिक बांड सहसंबंध (HMBC)] स्पेक्ट्रा पर एक ९०० मेगाहर्ट्ज एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर26.
  4. स्पिनर टरबाइन के अंदर नमूने के साथ एनएमआर ट्यूब प्लेस । नमूना ऊंचाई को मापने विंडो के बीच में है यह सुनिश्चित करने के लिए गहराई गेज का उपयोग करें । एनएमआर सॉफ्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें) और चुंबक में नमूना बदलने के लिए लिफ्ट बटन पर क्लिक करें ।
    नोट: चुंबक के ऊपर से आ रही गैस को महसूस करने के लिए चुंबक के ऊपर से एक हाथ पकड़ लें । एक ही समय में, एक सीटी ध्वनि श्रव्य होना चाहिए ।
  5. धीरे चुंबक के शीर्ष पर हवा तकिया पर नमूना जगह और एनएमआर चुंबक में नमूना उतरना करने के लिए फिर से लिफ्ट बटन धक्का ।
    नोट: नमूना सही स्थिति में है इंगित करने के लिए एक "क्लिक करें" शोर के लिए सुनो.
  6. नया डेटासेट बनाएं और एनएमआर इंस्ट्रूमेंट द्वारा अनुशंसित डिफ़ॉल्ट पैरामीटर लोड करें ( सामग्री तालिकादेखें) ।
    1. प्रकार "लॉक" स्वचालित अवरोधन प्रक्रिया को प्रारंभ करने के लिए और त्वरित पृष्ठ पर विलायक का चयन करें ।
    2. ठीक ट्यूनिंग के लिए, में हेरफेर पैनल, अनलॉक मॉडल में बटन को समायोजित, हेरफेर पैनल पर कर्सर को समायोजित, और चुंबक फिर से ताला.
    3. त्वरित आत्मा पृष्ठ पर, ट्यूनिंग प्रक्रिया करने के लिए, जो कुछ मिनट लग सकते हैं में हेरफेर कक्ष पैरामीटर समायोजित करें । आगे बढ़ने के लिए ट्यूनिंग पूर्ण होने तक प्रतीक्षा करें ।
    4. प्रॉंप्ट में "topshim" लिखकर स्वचालित shimming रूटिन प्रारंभ करें । आगे बढ़ने के लिए shimming पूरा होने तक इंतजार करें ।
    5. प्रकार "्गा" स्वत: प्राप्त लाभ समायोजन सेट करने के लिए, फिर प्रकार "d1" दालों के बीच देरी सेट करने के लिए, फिर "zg" प्रकार अधिग्रहण प्रारंभ करने के लिए, और अधिग्रहण के पूरा होने तक प्रतीक्षा करें ।
    6. डेटा संसाधित करने के लिए "ef" या "efp" टाइप करें और फिर स्वचालित चरणबद्ध के लिए "apk" लिखें । एनएमआर प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर पर डेटा की प्रक्रिया ।
  7. एनएमआर डेटा विश्लेषण की एक व्याख्या द्वारा रासायनिक संरचना स्पष्ट ।
  8. 13सी एनएमआर स्पेक्ट्रम में कार्बन संकेतों को गिनने के लिए । उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HR-MS) में अनुमानित परिणाम से मिलान आणविक सूत्र का चयन करें ।
  9. 1एच एनएमआर स्पेक्ट्रम में प्रोटॉन संकेतों को एकीकृत और कार्बन और प्रोटॉन की कनेक्टिविटी निर्दिष्ट HSQC स्पेक्ट्रम में संकेतों पर आधारित है ।
  10. 1एच-1एच मधुर और HMBC स्पेक्ट्रम में सहसंबंधों के आधार पर कार्बन कंकाल की कनेक्टिविटी असाइन करें ।
  11. अंतरिम रूप से रासायनिक संरचना27तर्कसंगत संरचना के आधार पर असाइन करें । रासायनिक संरचना डेटाबेस में अंतरिम संरचना खोजें । संदर्भ में एनालॉग के साथ अंतरिम संरचना की तुलना करें ।
  12. संबंधित कॉंफ़िगरेशन को परमाणु Overhauser प्रभाव स्पेक्ट्रोस्कोपी (NOESY) स्पेक्ट्रम के साथ असाइन करें ।
    नोट: के बाद से पहचान गुण enantiomers के स्पेक्ट्रोमेट्री और स्पेक्ट्रोस्कोपी विधियों पर प्रदर्शित समान हैं, कुछ यौगिकों के निरपेक्ष विंयास, विशेष रूप से उन 2 '-शराब और 2 '-एनएच2के साथ, एक के साथ निर्धारित किया जाना है derivatization प्रतिक्रिया. derivatization प्रतिक्रिया के बाद, अंतर स्पेक्ट्रा पर दर्शाया गया स्पष्ट असाइनमेंट अधिकांश यौगिकों28के निरपेक्ष विन्यास की सुविधा.

7. EOG और परख शुद्ध यौगिकों की पुष्टि करने के लिए कर रहे है गंध और व्यवहार सक्रिय

  1. दोहराएँ चरण ३.१-३.५.
  2. एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र के लिए, 10 मिलीलीटर की 10-गुना कमजोर पड़ने से शुद्ध यौगिकों के लिए तैयार १०-६ एम-१०-१३ एम ए १०-३ एम फेरोमोन स्टॉक सॉल्यूशन में ५०% मेथनॉल/जल-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित में आणविक वजन निर्धारित पर आधारित कदम ६.२ । L-arginine और शुद्ध यौगिकों के काम के समाधान के साथ कांच की शीशियों रखो एक पुनर्संचारी पानी स्नान करने के लिए तापमान equilibrate करने के लिए अनुमति देने के लिए 8 ° c.
  3. दोहराएँ चरण ३.७-३.१८.
  4. दोहराएँ चरण ४.१-४.२.
  5. बेतरतीब ढंग से सौंपा प्रयोगात्मक चैनल के लिए EOG पता लगाने दहलीज एकाग्रता पर शुद्ध यौगिक लागू करें और वाहन (५०% मेथनॉल/जल) नियंत्रण चैनल के लिए एक सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर २०० मिलीलीटर की निरंतर दरों पर 5 मिनट के लिए/
  6. दोहराएँ चरण ४.४-४.६.

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Representative Results

परख-निर्देशित भिन्नीकरण के प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों का सारांश आरेख 1 चित्रामें दिखाया गया है. प्रोटोकॉल को अलग और संरचना, घ्राण शक्ति, और 5 ख्यात सागर lamprey pheromones (चित्रा 2) के व्यवहार गतिविधि की विशेषता के लिए कदम शामिल है । मास spectrometric और एनएमआर डेटा (चित्रा ३ और चित्रा ४) का उपयोग करते हुए petromyzene ए-बी और petromyzone ए-सी की संरचनाओं को परिपक्व पुरुष सागर lampreys२२,२९के साथ जल वातानुकूलित से आविर्भाव किया गया.

EOG रिकॉर्डिंग (चित्रा 5) से हमारे प्रतिनिधि डेटा प्रदर्शित करता है कि petromyzene a-B और petromyzone a-C सभी शक्तिशाली odorants कि वयस्क समुद्र lamprey घ्राण उपकला उत्तेजित थे और पता लगाने की कम थ्रेसहोल्ड था (चित्रा 6) . विशेष रूप से ध्यान दें, EOG रिकॉर्डिंग विश्वसनीय गंध प्रतिक्रिया रिकॉर्डिंग के लिए एक अच्छा संकेत करने के लिए शोर अनुपात में परिणाम के लिए उत्तेजना प्रसव ट्यूब के सापेक्ष घ्राण उपकला की सतह पर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की एक उचित स्थान की आवश्यकता ( चित्रा 5B). इस महत्वपूर्ण कदम का पालन नहीं किया जाता है, तो यह उच्च शोर के बीच में गंध से प्रेरित संकेत विचार करने के लिए मुश्किल हो जाएगा । EOG ट्रेस के नीचे विक्षेपन के बाद गंध जोखिम एक नकारात्मक क्षमता है । एक अच्छा EOG संकेत एक गंध एक त्वरित और तेज आधार रेखा के लिए एक वसूली के बाद प्रतिक्रिया में जिसके परिणामस्वरूप प्रशासन दिखाना चाहिए । ख्यात pheromones करने के लिए घ्राण प्रतिक्रियाओं भी 10-5 एम एल-arginine, समुद्र lamprey में एक सकारात्मक नियंत्रण गंध, के लिए रिकॉर्डिंग की अखंडता सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग भर में परीक्षण की प्रतिक्रियाओं को सामान्यीकृत किया गया था बनाए रखा ।

दो पसंद भूलभुलैया व्यवहार परख (चित्रा 7A) में, ovulation महिला सागर lampreys petromyzone ए, petromyzene ए, और petromyzene बी, और petromyzone सी से स्पंदित करने के लिए आकर्षित किया गया था । ovulation महिलाओं को petromyzone बी से स्पंदित होना दिखाई दिया; हालांकि, व्यवहार प्रतिक्रिया (चित्रा 7B) महत्वपूर्ण नहीं था । petromyzone B की सीमित मात्रा के कारण एक बड़ा नमूना आकार संभव नहीं था । ठीक से एक गंध के लिए व्यवहार प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए, यह नियंत्रण और प्रत्येक lamprey के प्रयोगात्मक चैनल के लिए इलाज पूर्वाग्रह रिकॉर्ड करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

Figure 1
चित्रा 1: pheromones के परख-निर्देशित अंश का एक फ़्लोचार्ट । यह आंकड़ा ली, Buchinger, और ली30में चित्रा 2 से अनुकूलित है । बक्से में संकेत दिया तकनीक से परिणामी रासायनिक उत्पाद ओवल में इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: petromyzene की रासायनिक संरचनाओं a-B और petromyzone a-C. यह आंकड़ा ली एट अल में आंकड़े 1 से संशोधित किया गया है । 22 , 29. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:1 डी एनएमआर स्पेक्ट्रा । 1 d एनएमआर स्पेक्ट्रा ऑफ petromyzene a: (a) द .1एच एनएमआर (९०० mhz) स्पेक्ट्रम और (B) 13C एनएमआर (२२५ mhz) स्पेक्ट्रम. यह आंकड़ा ली एट अल में समर्थन जानकारी से है । 29. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:2d एनएमआर स्पेक्ट्रा । 2d एनएमआर स्पेक्ट्रा ऑफ petromyzene ए: (क) HSQC स्पेक्ट्रम, (ख) 1एच-1एच मधुर स्पेक्ट्रम, (ग) HMBC स्पेक्ट्रम, और (घ) NOESY स्पेक्ट्रम । यह आंकड़ा ली एट अल में समर्थन जानकारी से है । 29. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: इलेक्ट्रो-olfactogram (EOG) रिकॉर्डिंग तैयारी और प्रतिनिधि ट्रेस रिकॉर्डिंग. (क) यह रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के साथ उजागर समुद्र lamprey घ्राण उपकला दिखा एक EOG तैयारी है, संदर्भ इलेक्ट्रोड, गंध प्रसव ट्यूब, और संवेदनाहारी के साथ oxygenated पानी. (ख) इस पैनल के प्रतिनिधि ट्रेस रिकॉर्डिंग अच्छा प्रदर्शन (ऊपर) या बुरा (नीचे) संकेत करने वाली शोर अनुपात से पता चलता है । एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात विश्वसनीय गंध प्रतिक्रियाओं रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक है । EOG ट्रेस के नीचे विक्षेपन के बाद गंध जोखिम एक नकारात्मक क्षमता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: इलेक्ट्रो-olfactogram (EOG) एकाग्रता-प्रतिक्रिया घटता के एक अर्द्ध लघुगणक भूखंड. Petromyzone a-C और petromyzene a और B वयस्क समुद्र lamprey घ्राण उपकला के लिए stimulatory थे और कम पता लगाने थ्रेसहोल्ड था. डेटा मतलब सामान्यीकृत EOG आयाम ± S.E.M. के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं नमूना आकार निंनानुसार थे: petromyzone a, petromyzene a, and petromyzene b (n = 7), और petromyzone b और petromyzone C (n = 5) । इनसेट प्रतिक्रिया दहलीज सांद्रता दिखा EOG प्रतिक्रियाओं का एक विस्तारित दृश्य है । यह आंकड़ा ली एट अल में चित्रा 3 से संशोधित किया गया है । 22 और ली एट अल में चित्रा 4 । 29. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: एक योजनाबद्ध और दो विकल्प भूलभुलैया के परिणाम odorants करने के लिए ovulation महिला सागर lampreys के व्यवहार प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया । (क) तीर जल प्रवाह की दिशा का प्रतिनिधित्व करता है (०.०७ एम एस-1 ± ०.०१) । हलकों गंध प्रशासन अंक प्रतिनिधित्व करते हैं । छोटे डैश्ड लाइनों ठीक जाल का प्रतिनिधित्व करने के लिए समुद्र lamprey के आंदोलन भूलभुलैया के दायरे को सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया । बड़ी डैश्ड लाइनें जल अशांति को कम करने के लिए इस्तेमाल प्रवाह बोर्डों का प्रतिनिधित्व करते हैं । धूसर आयत रिलीज़ पिंजरे का प्रतिनिधित्व करता है । स्केल बार = 1 m. यह आंकड़ा ली एट अल में आंकड़ा एस से है । 29. (ख) मादाएं petromyzone ए, petromyzene ए, और petromyzene बी की ओर आकर्षित हुई । समय lamprey पहले भूलभुलैया के प्रत्येक चैनल में खर्च और बाद में गंध जोखिम (10-12 एम) के लिए पसंद की एक सूची की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था गंध को अपनी व्यवहार प्रतिक्रिया का आकलन करें । वरीयता के सूचकांक का एक सकारात्मक मूल्य आकर्षण इंगित करता है । नमूना आकार, n, कोष्ठकों के बाहर रिपोर्ट की गई है, और कोष्ठकों में संख्या नियंत्रण की तुलना में प्रायोगिक चैनल में अधिक समय व्यतीत करने वाले परीक्षणों में महिलाओं की संख्या इंगित करता है । डेटा अर्थ ± S.E.M. के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं (* p < ०.०५; Wilcoxon साइन-रैंक टेस्ट) से पहले और बाद में गंध जोखिम व्यवहार पसंद की तुलना करने के लिए । यह आंकड़ा ली एट अल में चित्रा 4 से संशोधित किया गया है । 22 और ली एट अल में चित्रा 5 । 29. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1: भूलभुलैया की एक तस्वीर । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

मछली एक रासायनिक यौगिकों से भरा अभी तक की पहचान की दुनिया में रहते हैं । परख निर्देशित भिन्नीकरण की पहचान करने के लिए आवश्यक साबित कर दिया है और जैव सक्रिय अणुओं है कि मध्यस्थता कई रासायनिक बातचीत की विशेषता, रारे सामन31में मनाया उन लोगों के रूप में, एशियाई हाथियों३२, और समुद्र lampreys३३, ३४,३५. परख निर्देशित आंशिक रूप से एक प्रभावी दृष्टिकोण को सही पता लगाने और शुरू निकालने से शुद्ध सक्रिय यौगिक को सक्रिय यौगिकों तुच्छ है । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, की पहचान की जैव सक्रिय यौगिकों एक अद्वितीय रासायनिक कंकाल है कि जाने की संभावना नहीं है के साथ एक उपंयास यौगिक प्रकट कर सकते है ज्ञात कृत्रिम रास्ते से भविष्यवाणी की है ।

EOG रिकॉर्डिंग जो भिन्न या यौगिकों घ्राण प्रतिक्रियाओं में लाना निर्धारित करने के लिए आयोजित कर रहे हैं. कई तकनीकी विचार सही EOG रिकॉर्डिंग के साथ ख्यात pheromones के लिए घ्राण प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए आवश्यक हैं । पहला, संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति को मंजूरी दी प्रक्रियाओं के अनुसार, मछली गहराई से 3-aminobenzoic एसिड एथिल एस्टर (MS222) के साथ anesthetized और इंट्रामस्क्युलर gallamine के एक triethiodide इंजेक्शन के साथ मैटीरियल होना चाहिए । रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड एक अपर्याप्त स्थिरीकरण के कारण गिल और दिल की धड़कन के किसी भी आंदोलन का पता लगाने जाएगा, जो बिजली के शोर का एक स्रोत हो सकता है. दूसरा, घ्राण उपकला तुरंत सुखाना को रोकने के लिए विच्छेदन के बाद कोयला फ़िल्टर पानी के लिए उजागर किया जाना चाहिए. रिकॉर्डिंग और micromanipulators के साथ संदर्भ इलेक्ट्रोड के स्थान का समायोजन, बिजली के मैदान, और गंध डिलीवरी ट्यूब सकारात्मक नियंत्रण के लिए प्रतिक्रिया को अधिकतम करने में मदद कर सकते हैं गंध जबकि खाली नियंत्रण के लिए प्रतिक्रिया को कम करने ( छान पाणी). तीसरा, घ्राण उपकला में एक संवेदनशील रिकॉर्डिंग स्थान की पहचान करने के बाद, यह भिन्नता को कम करने के लिए lamellae पर एक समान स्थिति से रिकॉर्ड करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक समान स्थान से लगातार रिकॉर्ड करने के लिए, टैंक और वी के आकार का प्लास्टिक खड़े मछली पकड़ रखने के लिए, माइक्रोस्कोप, गंध वितरण ट्यूब, और एक ही स्थिति में micromanipulators । संवेदनाहारी ट्यूब प्रयोग की अवधि के लिए मछली के buccal गुहा में रहना चाहिए यह सुनिश्चित करने के लिए anesthetized रहता है । रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड विद्युत सिग्नल की एक अनियमित आधार रेखा में जिसके परिणामस्वरूप पानी की आवाजाही का पता लगा रहा है, तो हालांकि, buccal गुहा के भीतर स्थान और संवेदनाहारी की प्रवाह दर संशोधित किया जा सकता है ।

व्यवहार परख के डिजाइन परीक्षण विषय के व्यवहार पारिस्थितिकीय और ब्याज के अनुसंधान प्रश्न के अनुरूप किया जाना चाहिए । दो विकल्प भूलभुलैया व्यवहार परख अगर कोई भी गंध अंश का यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है व्यवहार से सक्रिय हैं । क्योंकि शुद्ध यौगिकों अक्सर केवल मिनट की मात्रा में उपलब्ध हैं, भूलभुलैया एक लाभदायक व्यवहार एक कम निर्वहन के कारण धारा की तुलना में परख है । हम ख्यात सेक्स के निकट स्रोत वरीयता का आकलन करने में रुचि रखते थे परिपक्व पुरुषों द्वारा जारी pheromones बंद निकटता में परिपक्व महिला साथियों को आकर्षित करने और उंहें पैदा करने के लिए एक घोंसले पर बनाए रखने की भविष्यवाणी की । व्यवहार परख के लिए एक परिपक्व पुरुषों के odorants के बीच चुनने के लिए एक ovulation महिला की प्राकृतिक परिस्थितियों को दोहराने के लिए डिज़ाइन किया गया था । इसलिए, यह हमारे व्यवहार प्रयोगों में परीक्षण के विषय के रूप में ovulation महिलाओं परीक्षण करने के लिए प्रासंगिक था । हालांकि, परीक्षण के आधार पर, अंय परीक्षण विषयों (यानी, अलग जीवन स्तर या पुरुषों) अधिक उपयुक्त हो सकता है । दो पसंद भूलभुलैया के आयामों पर रूपांतरों परीक्षण के विषय के आकार और फेरोमोन (यानी, लंबी दूरी बनाम स्रोत के पास)३६की भविष्यवाणी की सक्रिय अंतरिक्ष के आधार पर आवश्यक हो सकता है । इसी तरह, व्यवहार प्रतिक्रियाओं अक्सर एकाग्रता निर्भर हैं । जब ख्यात फेरोमोन पर लागू किया जाता है, तो एक व्यवहार प्रतिक्रिया नहीं देखा है पता लगाना थ्रेशोल्ड EOG के साथ निर्धारित एकाग्रता, फेरोमोन की एकाग्रता समायोजित करना चाहिए । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि भले ही एक यौगिक एक शक्तिशाली गंध है, यह जरूरी एक महत्वपूर्ण व्यवहार पसंद नहीं प्रेरित कर सकते हैं । अंततः, उलझन में मनाया व्यवहार प्रतिक्रियाओं ख्यात फेरोमोन के समारोह की पुष्टि करने के लिए सिंथेटिक यौगिक के साथ एक क्षेत्र की स्थापना में मान्य किया जाना चाहिए.

एक परख की प्रमुख सीमा-निर्देशित भिंन है एक परख (EOG या व्यवहार) में व्यक्तिगत भागों या यौगिकों के अनुक्रमिक परीक्षण है । पिछले काम दिखाया गया है कीट सेक्स pheromones विशिष्ट अनुपात में कई घटकों के आमतौर पर मिश्रण कर रहे है३७ है कि स्वतंत्र रूप से कार्य के रूप में घटक३८ या synergistically में उपयुक्त प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए३९ मिश्रणों विशिष्ट । इसलिए, यौगिकों कि केवल सक्रिय कर रहे है जब विशिष्ट मिश्रण में मौजूद है परख के साथ अनदेखी की जा सकती है निर्देशित आंशिक क्योंकि वे मिश्रित परीक्षण की आवश्यकता के लिए की पुष्टि करने के लिए । परख के अंय सीमाओं-निर्देशित अंश में शामिल हैं: 1) शुरू सामग्री की एक बड़ी मात्रा में संरचनात्मक विश्लेषण, EOG, और व्यवहार परख के लिए पर्याप्त राशि है आवश्यक है; 2) प्रक्रिया चलने शुद्धिकरण प्रक्रिया के कारण समय लेने वाली है; और 3) मामूली या अस्थिर यौगिकों पता लगाया जा करने के लिए संभावना नहीं है । भविष्य में, परख के तकनीकी सीमाओं से कुछ पर काबू पाने निर्देशित भिंन परख के एक संकर दृष्टिकोण की आवश्यकता हो सकती है निर्देशित भिंन और metabolomics । एक संकरित दृष्टिकोण का उपयोग करना, additive या synergistic फेरोमोन प्रभाव अधिक समझदार13 और अस्थिर यौगिकों अधिक होने की संभावना है पता लगाया जा करने के लिए कर रहे हैं ।

वर्णित परख निर्देशित अंश प्रक्रिया विशेष रूप से समुद्र lamprey pheromones की पहचान के लिए बनाया गया है । हालांकि, रासायनिक संचार जानवर किंगडम1 में सर्वव्यापी है और इस प्रक्रिया को आसानी से taxa की एक व्यापक सरणी में pheromones विशेषताएं अनुकूलित किया जा सकता है । फेरोमोन पहचान और लक्षण वर्णन महत्वपूर्ण है क्योंकि pheromones व्यवहार प्रतिक्रियाओं आक्रामक प्रजातियों के नियंत्रण में या खतरनाक देशी प्रजातियों की बहाली में जिसके परिणामस्वरूप के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम अपने अनुसंधान सुविधाओं के उपयोग के लिए अमेरिका भूवैज्ञानिक सर्वेक्षण हैमंड बे जैविक स्टेशन धंयवाद और अमेरिका मछली और वंय जीव सेवा और मत्स्य पालन और महासागरों कनाडा सागर lampreys प्रदान करने के लिए के कर्मचारियों के लिए । इस अनुसंधान Weiming ली और Ke li करने के लिए महान झीलों मत्स्य आयोग से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Premium standard wall borosilicate capillaries with filament  Warner Instruments G150F-4 recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm)
Pipette puller instrument Narishige PC-10 pulls electrodes for EOGs
Diamond-tipped glass cutter Generic cut tip of electrodes for EOG
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150-4 odorant delivery tube for EOG
Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm Warner Instruments ESP-M15N recording electrode holder
Reference electrode holder E Series with handle with  Ag/AgCl pellet  for glass capillary OD 1.5 mm Warner Instruments E45P-F15NH reference electrode holder
1 mm pin Warner Instruments WC1-10 to bridge reference and recording electrode holders
2 mm pin Warner Instruments WC2-5 to bridge reference and recording electrode holders
Agar Sigma A1296 molten agar to fill electrodes
Potassium chloride (KCl) Sigma P9333 3M KCl to fill electrodes and electrode holders
Micropipette microfil World Precision Instruments MF28G-5 to fill electrodes and electrode holders
L-Arginine Sigma A5006 positive control odorant for EOG
Methanol Sigma 34860
Water bath Custom made N/A holds odorants for EOG
3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) Syndel USA Tricaine1G EOG anesthetic
Gallamine triethiodide Sigma G8134-5G EOG paralytic
1 mL syringe BD Biosciences 301025 to administer paralytic
Subcutaneous needle 26G 5/8 BD Biosciences 305115 to administer paralytic
Roller clamp World Precision Instruments 14043-20 adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth
Sodium chloride (NaCl) J.T. Baker 3624-05 for preparation of 0.9% saline
V-shaped plastic stand as specimen stage Custom made N/A holds lamprey during EOG
Plastic trough Custom made N/A holds V-shaped plastic stand during EOG
Scalpel Blades - #11 Fine Science Tools 10011-00 for EOG dissection
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools 10003-12 for EOG dissection
Straight ultra fine forceps Fine Science Tools 11252-00 for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps
Curved ultra fine forceps Fine Science Tools 11370-42 for EOG dissection, Moria MC40B
Straight pring Scissors Fine Science Tools 15003-08 for EOG dissection
Stereomicroscope Zeiss Discovery V8 for EOG dissection
Illuminator light Zeiss CL 1500 ECO for EOG dissection
Plastic tubing Generic to connect re-circulating EOG setup and water baths
Odorant delivery tubing Custom made N/A
In line filter and gasket set Lee Company TCFA1201035A
Micromanipulators Narishige MM-3 to position electrodes and odorant delivery capillary tube
Magnetic holding devices Kanetec MB-K
Valve driver Arduino custom made to control the opening of the valve for odor stimulation
Electromagnetic valve Lee Company LFAA1201618H valve for odor stimulation
NeuroLog AC/DC amplifier Digitimer Ltd. NL106 to increase the amplitude of the elictrical signal
NeuroLog DC pre-amplifier with headstage Digitimer Ltd. NL102G to increase the amplitude of the elictrical signal
Low-pass 60 Hz filter Digitimer Ltd. NL125
Digitizer Molecular Devices LLC Axon Digidata 1440A
Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software Molecular Devices LLC AxoScope version 10.4
Faraday cage Custom made N/A Electromagnetic noise shielding
Two-choice maze Custom made N/A waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner
Trash pump Honda WT30XK4A fills maze with water from nearby river
Peristaltic pump with tubing Cole Parmer Masterflex 07557-00 to adminster odorants in maze
Inverter Generator Honda EU1000i powers perstaltic pump
Release cage Custom made N/A used to acclimate lamprey in the maze
Mesh Generic used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers
Buckets (5 gallon) Generic to mix odorants
Flow meter Marsh-McBirney Flo-Mate 2000 to measure discharge
XAD 7 HP resin Dow chemical 37380-43-1 for extraction of conditioned water 
Methanol Sigma 34860 for extraction of conditioned water 
Water bath Yamato BM 200 for extraction of conditioned water 
Freeze dryer Labconco CentriVap Concentrator for extraction of conditioned water
chloroform Sigma CX1050 for isolation of fraction pools
Silica gel 70-230 mesh Sigma 112926-00-8 for isolation of fraction pools
Silica gel 230-400 mesh Sigma 112926-00-8 for isolation of fraction pools
Pre-coated silica gel TLC plates Sigma 99571 for isolation of fraction pools
anisaldehyde Sigma A88107 for isolation of fraction pools
Sephadex LH-20 GE Healthcare 17-0090-01 for isolation of fraction pools
Amberlite XAD 7 HP resin Sigma XAD7HP for extraction of conditioned water 
4, 2.5L capacity glass columns Ace Glass Inc. 5820 for extraction of conditioned water 
Acetone Sigma 650501 for extraction of conditioned water 
TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) Waters Co. N/A for structure elucidation
Binary HPLC pump Waters Co. 1525 for isolation of fraction pools/compounds
Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) Agilent N/A for structure elucidation
Rotovap drying system Buchi RII for extraction of conditioned water 
UV lamp (254 nm) Spectronics Co. ENF-240C for thin layer chromatography 

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References

  1. Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
  2. El-Sayed, A. M. The pherobase: database of insect pheromones and semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com (2009).
  3. Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
  4. Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
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Scott, A. M., Li, K., Li, W. The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation. J. Vis. Exp. (137), e58059, doi:10.3791/58059 (2018).

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