Summary
Nous présentons ici un protocole visant à isoler et de caractériser la structure, puissance olfactive et réaction de composés de phéromones putatifs de la lamproie marine.
Abstract
Fractionnement guidée par essai biologique est une approche itérative qui utilise les résultats des essais biologiques physiologiques et comportementales pour guider l’isolement et l’identification d’un composé actif de phéromone. Cette méthode a entraîné la caractérisation réussie des signaux chimiques qui fonctionnent comme des phéromones dans un large éventail d’espèces animales. La lamproie marine se fient olfaction pour détecter les phéromones qui médient réponses comportementales et physiologiques. Nous utilisons cette connaissance de la biologie des poissons à proposer des fonctions de phéromones putatifs et pour guider l’isolement et l’identification des composantes de l’actif de phéromone. La chromatographie est utilisée pour extraire, se concentrer et de séparer les composés de l’eau conditionnée. Électro-olfactogramme (EOG) enregistrements sont effectuées pour déterminer quelles fractions provoquer des réponses olfactifs. Tests comportementaux labyrinthe deux choix sont ensuite utilisés pour déterminer si une des fractions odorantes sont également actif sur le plan comportemental et induire une préférence. Méthodes spectrométriques et spectroscopiques fournissent le poids moléculaire et l’information structurale pour aider à l’élucidation de la structure. L’activité biologique des composés purs se confirme avec EOG et tests comportements. Les réponses comportementales observées dans le labyrinthe en fin de compte doivent être validés qu’en milieu de terrain pour confirmer leur fonction dans un cadre de cours d’eau naturel. Ces essais biologiques jouent un rôle double pour 1) guider le processus de fractionnement et 2) confirmer et préciser la bioactivité des composants isolés. Ici, nous rapportons les résultats représentatifs d’une identification de phéromone de la lamproie marine qui illustrent l’utilité de l’approche guidée par bioessai fractionnement. L’identification des phéromones de la lamproie marine est particulièrement importante parce qu’une modulation de son système de communication de phéromone est parmi les options envisagées pour contrôler la lamproie de mer envahissante dans les Grands Lacs laurentiens. Cette méthode peut être facilement adaptée pour caractériser la communication chimique dans un large éventail de taxons et de faire la lumière sur l’écologie chimique d’origine hydrique.
Introduction
Les phéromones sont des signaux chimiques spécifiques, libérés par les personnes qui les aident à localiser les sources de nourriture, détecter les prédateurs et médiation des interactions sociales de leurs congénères1. Communication de la phéromone chez les insectes a été bien étudiée2; Cependant, l’identification chimique et la fonction biologique des phéromones de vertébrés aquatiques n'ont pas été étudiées aussi largement. Connaissance de l’identité et la fonction des phéromones libéré peuvent être appliquées pour faciliter la récupération des espèces menacées,3,4 ou contrôle antiparasitaire espèces5,6. L’application de ces techniques nécessite l’isolement et la caractérisation des composants bioactifs de phéromone.
Identification de la phéromone est une branche de la chimie des produits naturels. Progrès dans la recherche de phéromone a été partiellement limité en raison de la nature des molécules phéromones eux-mêmes. Les phéromones sont souvent instables et publié en petites quantités, et seulement quelques techniques d’échantillonnage existent pour détecter des quantités infimes de volatiles7,8 ou des composés solubles dans l’eau9. Méthodes pour identifier les phéromones comprennent 1) un dépistage ciblé des composés connus, métabolomique) 2 et 3) guidée par bioessai fractionnement. Un dépistage ciblé des composés connus les tests disponibles dans le commerce des sous-produits métaboliques des processus physiologiques hypothétiquement fonctionnent comme des phéromones. Cette approche est limité parce que les chercheurs peuvent tester uniquement composés connus et disponibles. Toutefois, il a conduit à l’identification réussie des hormones sexuelles chez le poisson rouge qui fonctionnent comme phéromones10,11,12. La métabolomique est une deuxième approche d’identification de phéromone qui distingue les produits métaboliques potentiels de petites molécules dans un système biologique13. Une comparaison des profils métaboliques des deux groupes (c.-à-d., un actif contre un extrait inactif) permet l’identification d’un profil métabolique potentiel de qui le métabolite est épuré, la structure est élucidée et les bioactivité est confirmé14. Effets additifs ou synergiques des formulations complexes des mélanges spécifiques sont plus susceptibles d’être détectés avec la métabolomique, parce que les métabolites sont considérés ensemble plutôt que comme une série de fractions13. Pourtant, la mise en œuvre de la métabolomique repose sur la disponibilité des références synthétiques parce que les données qui en résulte ne facilitent pas l’élucidation des nouvelles structures.
Fractionnement guidée par essai biologique est une approche intégrée et itérative qui s’étend sur deux domaines : chimie et biologie. Cette approche utilise les résultats des essais biologiques physiologiques et comportementales pour guider l’isolement et l’identification d’un composé actif de phéromone. Un extrait brut est fractionné par une propriété chimique(p. ex., taille moléculaire, polarité, etc.) et testé avec enregistrements électro-olfactogramme (EOG) et/ou dans un test biologique. Les composants bioactifs sont éliminés en répétant ces étapes de fractionnement et EOGs et/ou biologiques. Les structures des composés actifs purs ont été dégagés par les méthodes spectrométriques et spectroscopiques, qui assurent le poids moléculaire et l’information structurale pour produire un modèle de ce composé à être synthétisé. Guidée par bioessai fractionnement peut produire divers métabolites et potentiellement roman phéromones avec des squelettes chimiques uniques qui ne risquent pas d’être prédites par les voies de biosynthèse.
Nous décrivons ici le protocole de fractionnement guidée par essai biologique utilisé pour isoler et de caractériser la bioactivité de la lamproie de mer mâle sex pheromone composés. La lamproie marine (Petromyzon marinus) est un modèle idéal de vertébrés pour étudier la communication phéromonale parce que ces poissons s’appuient fortement sur la détection olfactive des signaux chimiques d’arbitrer leur histoire de vie anadrome composé de trois étapes distinctes : les larves, juvénile et adulte. Larve de la lamproie marine se terrent dans les sédiments des cours d’eau douce, subissent une métamorphose radicale et de transforme en juvéniles qui migrent d’un lac ou l’océan où ils parasitent les poissons de la grande hostie. Après avoir détaché du poisson hôte, les adultes migrent vers des ruisseaux frayères, guidé par les phéromones migrateurs publiés par flux résident larves15,16,17,18,19 . Les mâles matures montent sur les frayères, libérer une phéromone de sexe multi-composants pour attirer des compagnons, frayer par intermittence pendant environ une semaine et puis mourir15,20. L’identification des phéromones de la lamproie marine est importante parce qu’une modulation du système de communication phéromone est parmi les options envisagées pour contrôler les lamproies marines envahissantes dans les Grands Lacs laurentiens21.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité de Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 et 02/17-031-00).
1. collecte et Extraction de la lamproie marine conditionné eau
- Place maturité sexuelle masculine la lamproie marine (15-30 animaux) dans un réservoir fourni avec 250 L d’eau gazeuse de lac Huron maintenue à 16-18 ° C.
- Recueillez l’eau conditionné par l’homme tout au long de chaque nuit de juin à juillet.
Remarque : la grande lamproie marine naturellement meurent après la ponte. Si un poisson est presque ce point dans sa vie, remplacez-le par un mâle adulte fraîche. - Extrait de l’eau conditionnée par extraction en phase solide.
- Faire tremper la résine dans le méthanol pendant 4 h avant de les charger dans une colonne. Charger la résine dans la colonne, puis pompe 10 L d’eau par le biais de la colonne afin d’éliminer le solvant organique.
- Passer l’eau conditionnée du réservoir tenant le poisson via le système de pompage vers le haut de la colonne. L’eau traverse un lit de 2 kg de résine échangeuse d’ions polymériques modérément polaire (par exemple., résine Amberlite XAD-7 HP), contenus dans une série de quatre colonnes de verre 2,5 L-capacité. Maintenir des vitesses de chargement entre 400 et 600 mL/6 min. éluer les métabolites avec 10 L de méthanol, suivie immédiatement de 5 L d’acétone.
ATTENTION : Cette étape utilise méthanol et acétone. Les deux sont inflammables et toxiques.
Remarque : Le résidu regroupé peut être stocké à-80 ° C jusqu'à être traitées ultérieurement.
- Réactiver la colonne après 1 semaine d’enrichissement par lavage avec l’eau (environ 10 L).
- Éliminer le solvant organique (le mélange de méthanol et d’eau) et de récolter l’extrait par évaporation rotatoire pendant 5 h sous pression réduite (moins de 300 mbar) à 40 ° C. Concentrer le résidu d’eau par lyophilisation sèche-cheveux gel pendant 48 h à-20 ° C jusqu’au sec.
2. séparation de la Fraction de piscines avec la chromatographie
- Faire tremper le gel de silice (230-400 mesh) dans la phase mobile initiale pendant 30 min. transfert le gel avec le solvant (suspension) à une colonne de verre. Ouvrez le robinet de la colonne pour permettre la phase mobile à traverser. Laisser le gel de silice à précipiter et former un lit de gel de silice.
- Bien mélanger les extraits avec gel de silice (70-230 mesh) et de les charger dans la colonne de chromatographie en phase liquide au-dessus du lit de gel de silice. Éluer les avec un dégradé de 95 % CHCl3 (chloroforme) / MeOH (méthanol) et 100 % MeOH, 2,5 L de volume total. Recueillir l’éluant dans des flacons individuels (chacune 10 ml).
ATTENTION : Le chloroforme utilisé lors de cette étape est un réactif toxique. - Guide de la mise en commun des solvants en 20 fractions par une chromatographie sur couche mince (CCM).
- Réaliser l’expérience de TLC sur plaques de gel de silice revêtus en appliquant l’exemple sur la ligne de départ et en immergeant la ligne de départ de la plaque dans les solvants en développement (choisir la polarité par le ratio de CHCl3 au méthanol de 0-100 %) dans un verre scellé réservoir.
- Permet de sélectionner l’image de développer un solvant pour rendre tous les TLC spots avec un facteur de rétention (Rf) variant de 0,3 - 0,8.
- Une fois le solvant de développement atteint la ligne de fond, sortez la plaque du réservoir et attendre 10 min pour le solvant s’évapore.
- Visualiser les taches tout d’abord sous ultraviolets à 254 nm et puis tache eux en aspergeant avec une solution de méthanol acide de l’Anisaldéhyde (20 μL) de 5 % par un pulvérisateur de chromatographie et en les chauffant à 85 ° C pendant 3 min.
Remarque : Les taches colorées sur la plaque de TLC indiquent le composant principal de la fraction. - Combiner l’éluant à 20 fractions basé sur la tache de couleur et de la similitude def R de la composante principale.
- Concentrer la fraction d’un résidu par évaporation dextrogyre sous pression réduite (300 mbar accordant la propriété de solvants) à 40 ° C pendant environ 30 min.
3. Electro-olfactogramme (EOG) enregistrements pour identifier les Fractions/composés odorants
- Tirez des capillaires en verre borosilicate (diamètre extérieur : 1,5 mm ; diamètre intérieur : 0,86 mm ; longueur : 100 mm) avec une micropipette extracteur avec le niveau de chauffage la valeur 65.
- Marquer et découper l’ouverture à l’extrémité du capillaire avec une fraise diamantée verre et remplissez-le avec agar fondu de 0,4 % en solution saline à 0,9 %. L’ouverture à l’extrémité du capillaire doit être environ 10 µm de diamètre.
- Remplir les électrodes capillaires extraite des escaliers 3.1 ou 3.2 et détenteurs d’électrodes à semi-conducteurs préfabriqués avec des boulettes de Ag/AgCl (voir Table des matières) avec 3M KCl à l’aide d’une micropipette.
Remarque : Déloger les bulles d’air dans le tube capillaire ou le porte-électrode. - Insérer les électrodes tirés dans le porte-électrode.
- Préparation de 100 mL de 10-5 M L-arginine dans l’eau filtrée au charbon d’une solution mère de L-arginine 10-2 M dans l’eau désionisée (conservée à 4 ° C) dans une fiole jaugée. Transférer 20 mL de la 10-5 M L-arginine, un flacon en verre.
- Pour la courbe concentration-réponse, préparer 10 mL de 10 fois les dilutions des piscines fraction de l’étape 2.3 en flacons de verre. Préparer des dilutions frais tous les jours avant les expériences et les utiliser dans une journée. Mettre les flacons en verre des solutions travail de L-arginine et des dilutions de piscine de fraction dans un bain d’eau recirculation pour permettre à la température de s’équilibrer à 8 ° C.
- Anesthésier la lamproie avec l’ester éthylique de l’acide 3-aminobenzoïque (MS222, 100 mg/L) et l’immobiliser avec une injection intramusculaire de gallamine triethiodide (3 mg/kg de poids corporel, en solution saline à 0,9 %) avec une seringue stérile.
Remarque : Une épaisseur suffisante d’anesthésie est déterminée en observant aucun mouvement des branchies, une incapacité à maintenir une posture verticale et pas de succion sur les côtés de la citerne à l’aide de son disque oral. Afin de minimiser toute contamination microbienne avant et Pendant la chirurgie, porter des gants stériles et tremper les outils de dissection dans l’éthanol à 70 % (v : v) dans l’eau désionisée pendant au moins 10 min avant utilisation. - Orientez la lamproie anesthésiée dans un support en forme de V et envelopper avec une serviette de papier humide pour éviter la dessiccation.
Remarque : Ne pas obstruer les pores branchiaux. - Insérer un tube de recirculation des eaux gazeuses contenant 50 mg/L de MS222 dans la cavité buccale, régler le débit et veiller à ce que l’eau sort par les pores branchiaux pour irriguer en permanence les branchies.
- Utiliser un scalpel stérile et forceps [sous le microscope stéréoscopique à un grossissement de X 1,25 (voir Table des matières)] pour supprimer une section de2 5 mm de la peau à la surface de la capsule olfactive pour exposer l’épithélium olfactif.
- Rincer la tubulure de livraison odorant avec eau filtrée et raccordez-le à la vanne montée sur un micromanipulateur. Placer le tube capillaire de livraison odorant dans la cavité de l’épithélium olfactif en utilisant le micromanipulateur pour livrer l’eau filtrée à l’épithélium olfactif pour empêcher la dessiccation lorsqu’on n'administre pas les substances odorantes.
- Monter les électrodes de référence et enregistrement sur les micromanipulateurs. Abaisser l’électrode de référence sur la peau externe près de la narine. En utilisant le microscope stéréoscopique (1,25 X), abaisser l’électrode d’enregistrement pour à peine toucher la surface de l’épithélium olfactif.
- Transférer l’absorption du tube livraison odorant de l’eau de fond filtré à la solution de L-arginine 10-5 M.
- Allumez l’ordinateur, amplificateur (réglé sur le mode cc), filtre et numériseur. Via le logiciel pilote de vanne, de programmer la procédure pour administrer une seule impulsion de 4 s d’odorants en cochant la case de T1, affectant T 4 s et en cochant la case de T2.
- Dans le logiciel d’acquisition de données (voir Table des matières), définir le mode d’acquisition d’un oscilloscope à grande vitesse, cliquez sur l’icône du jeu et puis cliquez sur Démarrer dans le pilote de la vanne à l’impulsion de la substance odorante.
Remarque : Le logiciel d’acquisition de données enregistre automatiquement l’amplitude de réponse différentielle EOG pendant 20 s (3 s avant, 4 s pendant l’impulsion odorants et 13 s par la suite). Utilisez le micromanipulateur à manœuvrer les positions des enregistrement électrode, électrode de référence ou tube livraison odorant pour augmenter le rapport signal-bruit avec une réponse maximale à la norme de la L-arginine et une réponse minimale à la (contrôle à blanc eau filtrée). L’amplificateur de la terre en passant le commutateur AC / DC de l’ampli à GND tout en déplaçant les électrodes. - Commencer à enregistrer le contrôle à blanc, L-arginine et puis les composés malodorants préparées à l’étape 3.6 de faible à des concentrations élevées d’une chasse de 2 min d’eau filtrée entre applications.
- Après avoir enregistré les réponses à toutes les substances odorantes à tester, l’amplificateur au sol et retirer soigneusement les électrodes et le tube capillaire de livraison odorant. Suivant les méthodes institutionnelles animalier et utilisation Comité (IACUC) approuvés, à la fin de l’expérience de l’EOG, euthanasier la lamproie anesthésiée avec une surdose de MS222 (1 g/L).
Remarque : Vérifiez euthanasie réussie en notant un manque de mouvement gill et rythme cardiaque pendant au moins 5 min, suivi de décérébration le cerveau. - Analyser et tracer les données à l’aide de logiciels d’analyse. Déterminer le seuil de détection des substances odorantes22 pour identifier les fractions odorantes qui déclenchent des réponses supérieurs à la maîtrise de l’eau blanche. Les piscines de fraction qui déclenchent des réponses olfactifs concentration-dépendante qui diffèrent de celles du contrôle de l’eau vierge sont ensuite testés lors d’un test comportemental (étape 4).
4. deux choix de labyrinthe Bioassay comportemental pour identifier les Fractions/composés actifs sur le plan comportemental
- Acclimater la lamproie de mer femelle sexuellement mature dans la cage de libération dans le labyrinthe (voir figure1 complémentaire) pendant 5 min. maintenir le débit de l’eau de rivière dans le labyrinthe
Remarque : Le labyrinthe est construit à partir de bois verni de qualité marine et mesure 6,5 m de long et 1,2 m de largeur avec un diviseur de 2,7 m de longueur pour séparer le labyrinthe en deux canaux à l’extrémité amont. L’eau est temporairement déviée dans le labyrinthe. La profondeur de l’eau doit être maintenue à 0,19 m et la vitesse doit être maintenue à 0,07 m/s ± 0,01. - Libérer la lamproie et consigner le montant cumulatif des temps que la lamproie passe dans l’expérimental et le canal de commande, chaque rivière contenant de l’eau pendant 10 min.
Remarque : Si la lamproie de mer ne parvient pas à entrer dans l’expérimental et contrôler le canal pendant au moins 10 s au cours de cette période de 10 min, mettre fin au procès, puisqu’il s’agit d’une indication de partialité inactivité ou fort. - Appliquer le test stimulus (c'est-à-direune phéromone putative à 10-12 M dissous dans 50 % méthanol/désionisée) pour le canal expérimental aléatoirement assigné et le véhicule (50 % méthanol/désionisée) sur le canal de contrôle en utilisant péristaltique pompes à constants de 200 mL/min pendant 5 min.
Remarque : La concentration seuil de détection du test stimulus déterminé avec les enregistrements électro-olfactogramme devrait être utilisée comme la concentration initiale pour le test comportemental. - Appliquer le test stimulus et le véhicule pour un 10 min supplémentaire et enregistrez le montant cumulatif des temps passe la lamproie dans l’expérimental et le canal de commande.
- Rincer le labyrinthe avec de l’eau pendant 10 min avant le début de l’essai suivant. Répétez les étapes 4.1 à 4.4 au moins 7 lamproies si suffisamment test stimulus est disponible.
- Calculer l’indice de préférence22 pour chaque essai et évaluer la signification à l’aide d’un test de Wilcoxon signé-grade.
Remarque : L’index correspond à un nombre unique qui peut être positif ou négatif. Une valeur positive de l’indice de préférence indique attraction, alors qu’une valeur négative de l’indice de répulsion des indications de préférence. Si l’index de préférence est significativement différent de zéro, la fraction est réputée active.
Ici,
Bc = le temps passé par la lamproie de test dans le canal de contrôle avant l’application de la substance odorante,
Be = le temps passé dans le canal expérimental avant l’application de la substance odorante,
Ac = le temps passé dans le canal de commande après l’application de la substance odorante, et
Une = le temps passé dans le canal expérimental après l’application de la substance odorante.
5. chromatographique isolement des composés purs de Fractions actives
- Répétez les étapes 2.1 à 2.4 avec les pools de fraction qui induisent des réponses olfactifs (étape 3) et obtenir des réponses comportementales (étape 4).
- Plus loin, purifier les fractions actives en composés avec la chromatographie d’exclusion stérique en utilisant une colonne de Sephadex LH-20.
- Préparation des échantillons dans 0,5 mL dans la phase initiale de mobile [CHCl3- MeOH (1:1) ou MeOH 100 %], charger dans la colonne correspondante, une colonne CHCl3- MeOH (1:1), puis une colonne de MeOH (100 %) et eux pour donner les composés éluer.
6. structure Elucidation d’un composé pur avec la spectrométrie de masse (MS) et de la résonance magnétique nucléaire (RMN)
- Dissoudre et de diluer la substance purifiée dans la première phase mobile (habituellement, du méthanol à l’eau, 1:1, v : v) de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) pour former une solution de 10 μL d’environ 1 μg/mL.
- Transférer la solution d’échantillon à fioles HPLC et mettez-les dans l’échantillonneur automatique de CLHP. Injecter l’échantillon (10 μL) dans la spectrométrie de masse d’ionisation par électronébulisation (ESIMS) et d’enregistrer les spectres de spectrométrie de masse (HRESIMS) d’ionisation par électronébulisation haute résolution en utilisant un spectromètre de masse de chromatographie23.
- Prédire la formule moléculaire est selon la base de données dans le logiciel de spectromètre de masse (voir Table des matières)24.
- Ouvrez le chromatogramme de l’échantillon injecté et obtenir son spectre de masse en sélectionnant le pic chromatographique.
- La masse mesurée à la valeur (4 décimales) d’ion (m/z) dans la composition élémentaire sous le module outil de l’entrée. La valeur du paramètre tolerance PPM < 5.
- Ajuster les paramètres du symbole pour s’adapter à la composition de l’élément de la molécule mesurée. Le logiciel produit une prédiction de formule moléculaire basée sur l’analyse de masse unique.
- Sélectionnez les solvants deutérés (600 μL, CH3OH -d4 ou DMSO -d6) selon le protocole25 pour dissoudre des échantillons.
- Dissoudre complètement l’échantillon dans les solvants deutérés sélectionnés pour former une solution avec une concentration variant environ de 0,1 à 10 mg/mL. Transvaser la solution de l’échantillon dans un tube de NMR pour enregistrer le 1D (1H, 13C) et RMN 2D [1H -1H spectroscopie de corrélation (COSY), hétéronucléaire simple cohérence quantique (HSQC), hétéronucléaire corrélation de liaisons multiples (HMBC)] spectres sur un de spectromètre RMN 900 MHz26.
- Placer le tube de NMR avec l’échantillon à l’intérieur de la turbine de spinner. Utilisez la jauge de profondeur pour s’assurer que la taille de l’échantillon se trouve au milieu de la fenêtre de mesure. Ouvrez le logiciel NMR (voir Table des matières) et cliquez sur le bouton d’ascenseur pour modifier l’échantillon dans l’aimant.
Remarque : Tenir une main sur le dessus de l’aimant se sentir le gaz provenant de la partie supérieure de l’aimant. Dans le même temps, un sifflement doit se faire entendre. - Doucement, placez l’échantillon sur le coussin d’air sur le dessus de l’aimant et poussez le bouton ascenseur pour descendre l’échantillon dans l’aimant de NMR.
Remarque : Écoutez un bruit de « clic » indiquer que l’échantillon est dans la bonne position. - Créez un nouveau dataset et charger les paramètres par défaut recommandés par l’instrument de NMR (voir Table des matières).
- Tapez « lock » pour appeler la procédure de verrouillage automatique et sélectionner le solvant à la page rapide.
- Pour affiner, dans le panneau de la manipulation, régler le bouton dans le modèle de déverrouillage , ajustez le curseur sur le panneau de manipuler et rebloquer l’aimant.
- À l’invite page Atma , régler le paramètre dans le panneau de manipuler à la procédure de paramétrage, qui peut prendre quelques minutes. Attendez que le tuning soit terminé pour aller de l’avant.
- Démarrer la routine de calage automatique en tapant « topshim » dans l’invite de commandes. Attendez que le calage est terminé pour aller de l’avant.
- Type « rga » pour définir automatique reçoit des réglages de gain, puis de type « d1 » pour définir l’intervalle entre les impulsions, puis type « zg » pour démarrer l’acquisition et attendez la fin de l’acquisition.
- Tapez « ef » ou « efp » pour traiter les données, puis tapez « apk » pour l’élimination automatique. Traiter les données sur le logiciel de traitement de NMR.
- Élucider la structure chimique par une interprétation de l’analyse de données RMN.
- Compter les signaux de carbone dans le spectre de RMN du 13C 13. Sélectionnez la formule moléculaire est appariée dans le résultat prédit en spectrométrie de masse à haute résolution (HR-MS).
- Intégrer les signaux des protons dans le spectre de RMN H 1et affecter la connectivité du carbone et proton-basé sur les signaux dans le spectre HSQC.
- Affecter la connectivité du squelette carboné basée sur les corrélations dans la 1H -1H COSY et spectre HMBC.
- Provisoirement attribuer la structure chimique basée sur la structure logique27. La structure provisoire de la recherche dans les bases de données de structure chimique. Comparez la structure provisoire avec les analogues dans les références.
- Affecter la configuration relative avec le spectre nucléaire Overhauser effet spectroscopie (NOESY).
Remarque : Étant donné que les propriétés d’identité d’énantiomères affichées sur la spectrométrie et méthodes spectroscopiques sont identiques, la configuration absolue de certains composés, en particulier ceux avec alcool 2' et 2'-NH2, doit être déterminée avec une réaction de dérivation. Après la réaction de dérivation, les différences indiquées sur les spectres de facilitent la cession sans équivoque des configurations absolues de la plupart des composés28.
7. EOG et bioessai pour confirmer des composés purs sont odorantes et active sur le plan comportemental
- Répétez les étapes 3.1-3.5.
- Pour la courbe concentration-réponse, préparer 10 mL de 10 fois les dilutions des composés purs de 10-6 M - 10-13 M d’une solution mère de phéromone 10-3 M 50 % méthanol/eau conservés à-20 ° C selon le poids moléculaire déterminé en 6.2 l’étape. Mettre les flacons en verre avec les solutions de travail de L-arginine et les composés purs dans un bain d’eau recirculation pour permettre à la température de s’équilibrer à 8 ° C.
- Répétez les étapes 3,7-3.18.
- Répétez les étapes 4.1-4.2.
- Appliquer le composé pur à la concentration de seuil de détection EOG le canal expérimental aléatoirement assigné et le véhicule (50 % méthanol/désionisée) sur le canal de contrôle à l’aide d’une pompe péristaltique à constants de 200 mL/min pendant 5 min.
- Répétez les étapes de 4,4 à 4,6.
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Representative Results
Un schéma résumant les étapes décrites dans le protocole du fractionnement guidée par essai biologique est donné à la Figure 1. Le protocole, procédez comme pour les isoler et de caractériser la structure, la puissance olfactive et l’activité comportementale des 5 phéromones putatifs de la lamproie (Figure 2). À l’aide de la spectrométrie de masse et les données de la RMN (Figure 3 et Figure 4), les structures de petromyzene A-B et petromyzone A-C ont été élucidées de l’eau conditionnée par la lamproie marine mâles matures22,29.
Nos données représentatives de l’enregistrements EOG (Figure 5) démontrent que la petromyzene A-B et petromyzone A-C sont toutes les substances odorantes puissants qui stimulent l’épithélium olfactif de la lamproie de mer adulte et avaient de faibles seuils de détection (Figure 6) . Mention particulière, les enregistrements de l’EOG nécessitent un positionnement correct de l’électrode d’enregistrement sur la surface de l’épithélium olfactif par rapport au tube relance livraison d’aboutir à un bon rapport signal-bruit pour odorisant fiable enregistrements de réponse ( Figure 5 b). Si cette étape cruciale n’est pas respectée, il sera difficile de discerner le signal induit par la substance odorante parmi le bruit élevé. La déflexion vers le bas de la trace de l’EOG après l’exposition odorant est un potentiel négatif. Un bon signal EOG devrait montrer une administration de substance odorante résultant en une réponse rapide et forte, suivie d’une reprise de la ligne de base. Les réponses olfactifs pour les phéromones putatifs ont été également normalisées aux réponses de 10-5 M L-arginine, un odorisant contrôle positif chez la lamproie de mer, testée pendant toute l’expérience pour assurer l’intégrité des enregistrements a été maintenue.
Dans les essais comportementaux deux choix labyrinthe (Figure 7 a), les lamproies femelles étaient attirés par les petromyzone A, A de le petromyzene et petromyzene B et repoussé de petromyzone C. Ovulated femelles semblent être repoussés de petromyzone B ; Cependant, la réponse comportementale n’était pas significative (Figure 7 b). Une taille d’échantillon supérieure n’a pas été possible en raison de la quantité limitée de petromyzone B. Pour évaluer adéquatement la réponse comportementale à une odeur, il est essentiel pour enregistrer le biais de prétraitement pour le contrôle et le canal expérimental de chaque grande lamproie marine.
Figure 1 : un organigramme du fractionnement des phéromones guidée par bioessai. Ce chiffre est une adaptation de la Figure 2 en Li, Buchinger et Li30. Les cases indiquent le produit chimique résultant de la technique indiquée dans l’ovale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : les structures chimiques des petromyzene A-B et petromyzone A-C. Ce chiffre est modifié par les Figures 1 à Li et al. 22 , 29. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
RMN du chiffre 3:1. Spectres de RMN 1D petromyzene A: (A), le spectre de RMN de H (900 MHz) 1et (B) les 13RMN du 13C (225 MHz) du spectre. Ce chiffre est de renseignements à l’appui en Li et al. 29. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : les spectres de RMN 2D. Les spectres de RMN 2D de petromyzene A: (A) le spectre HSQC, (B), 1H -1H COSY spectre, (C) l’HMBC spectre et (D) la NOESY spectre. Ce chiffre est de renseignements à l’appui en Li et al. 29. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : électro-olfactogramme (EOG) enregistrement des enregistrements de trace de préparation et représentant. (A) il s’agit d’une préparation d’EOG montrant l’épithélium olfactif lamproie exposées avec l’électrode de l’enregistrement, l’électrode de référence, le tube de livraison odorante et l’eau oxygénée avec l’anesthésie. (B), ce panneau montre les enregistrements de trace représentatives démontrant bien (en haut) ou les rapports signal-bruit de mauvais (en bas). Un bon rapport signal-bruit est nécessaire pour les enregistrements de réponses fiables odorant. La déflexion vers le bas de la trace de l’EOG après l’exposition odorant est un potentiel négatif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : une intrigue semi-logarithmique des courbes concentration-réponse électro-olfactogramme (EOG). Petromyzone A-C et petromyzene A et B sont stimulatrices de l’épithélium olfactif de la lamproie de mer adulte et avaient des seuils de détection faible. Les données sont présentées comme la moyenne normalisée EOG amplitude ± S.E.M. Les échantillons étaient comme suit : petromyzone A, petromyzene A et petromyzene B (n = 7) et petromyzone B et petromyzone C (n = 5). L’encart est un affichage développé des réponses EOG montrant la réponse des concentrations de seuil. Ce chiffre a été modifié dans la Figure 3 en Li et al. 22 et la Figure 4 en Li et al. 29. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : une représentation schématique et les résultats du labyrinthe deux choix utilisé pour évaluer les réponses comportementales des lamproies femelles ovulés à odorisants. (A) la flèche représente la direction de l’écoulement de l’eau (0,07 m s-1 ± 0,01). Les cercles représentent les points d’administration odorant. Les petites lignes en pointillés représentent maille fine servant à limiter la circulation de la lamproie de mer aux confins du labyrinthe. Les grandes lignes tiretées représentent le flux de planches utilisées pour réduire la turbulence de l’eau. Le rectangle gris représente la cage de libération. La barre d’échelle = 1 m. Ce chiffre est de Figure S1 en Li et al. 29. (B) les femelles étaient attirés par les petromyzone A, A de le petromyzene et petromyzene B. Le temps passé à la lamproie dans chaque canal du labyrinthe avant et après que l’exposition odorant (10-12 M) a été utilisée pour calculer l’indice de préférence pour évaluer sa réponse comportementale à la substance odorante. Une valeur positive de l’indice de préférence indique attraction. La taille de l’échantillon, n, est signalée à l’extérieur des parenthèses et le nombre entre parenthèses indique le nombre de femelles dans les essais qui passent plus de temps dans le canal expérimental par rapport au contrôle. Les données sont présentées comme moyenne ± S.E.M. (* p < 0,05 ; Signé-rang de Wilcoxon) pour comparer les préférences comportementales avant et après l’exposition de la substance odorante. Ce chiffre a été modifié par la Figure 4 en Li et al. 22 et Figure 5 en Li et al. 29. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1 : une photographie du labyrinthe. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Poissons vivants dans un monde chimique de composés encore être identifiés. Guidée par bioessai fractionnement s’est avérée essentiel pour identifier et caractériser les molécules bioactives qui assurent la médiation de nombreuses interactions chimiques, tels que ceux observés en saumon masu31, éléphants d’Asie,32et la grande lamproie marine33, 34,35. Fractionnement guidée par essai biologique est une approche efficace de trace avec précision et pinpoint qu'extraire des composés bioactifs du démarrer à la substance active purifiée. En utilisant cette approche, les composés bioactifs identifiés peuvent révéler un roman composé avec un squelette chimique unique qui est peu susceptible d’être prédites par les voies de biosynthèse connus.
Enregistrements d’EOG sont effectuées pour déterminer quelles fractions ou composés provoquer des réponses olfactifs. Plusieurs considérations techniques sont indispensables pour mesurer avec précision les réponses olfactifs pour les phéromones putatifs avec des enregistrements d’EOG. Tout d’abord, conformément à l’animalier institutionnel et comitologie utilisation approuvée, le poisson doit être profondément anesthésié avec l’ester éthylique de l’acide 3-aminobenzoïque (MS222) et immobilisé avec une injection intramusculaire de gallamine triethiodide. L’électrode d’enregistrement permet de détecter tout mouvement des branchies et de rythme cardiaque due à une immobilisation insuffisante, qui peut être une source d’interférences électriques. Deuxièmement, l’épithélium olfactif doit être exposé immédiatement à l’eau filtrée au charbon après la dissection afin d’éviter la dessiccation. Réajustement de l’emplacement de l’électrode de référence et enregistrement avec les micromanipulateurs, la masse et le tube de livraison odorisant peut aider à optimiser la réponse à la substance odorante contrôle positif tout en réduisant au minimum la réponse pour le contrôle à blanc ( eau filtrée). En troisième lieu, après avoir identifié un emplacement d’enregistrement sensible dans l’épithélium olfactif, il est important d’enregistrer depuis une position semblable sur les lamelles afin de minimiser les variations. Pour toujours enregistrer depuis un endroit similaire, garder le réservoir et le support en plastique en forme de V, tenant le poisson, le microscope, le tube de livraison odorants et des micromanipulateurs dans la même position. Le tube anesthésique doit rester dans la cavité buccale du poisson pendant la durée de l’expérience pour qu'elle demeure anesthésié. Toutefois, la mise en place au sein de la cavité buccale et le débit de l’anesthésique peut être modifiée si l’électrode d’enregistrement détecte le mouvement de l’eau, ce qui entraîne un niveau de référence erratique du signal électrique.
La conception de l’analyse comportementale devrait être adaptée à l’écologie comportementale de l’objet de l’essai et la question de recherche d’intérêt. Labyrinthe de deux choix comportementaux dosages est utilisé pour déterminer si l’un des fractions odorantes est également actif sur le plan comportemental. Parce que les composés purifiés sont souvent accessibles uniquement en quantités infimes, le labyrinthe est un bioessai comportement bénéfique par rapport au flux de données en raison d’une décharge inférieure. Nous étions intéressés à évaluer la préférence de proximité-source de phéromones putatifs sexe libéré par des mâles matures prévues pour attirer mature femelle s’accouple à proximité et les conserver sur un nid pour la ponte. L’analyse comportementale a été conçu pour reproduire les conditions naturelles d’une femelle ovulés en choisissant entre les composés malodorants des mâles matures. Par conséquent, il était pertinent tester les femelles comme le sujet du test dans nos expériences de comportement. Toutefois, selon la substance odorante testée, autres sujets de test (c.-à-d., stade de vie différentes ou mâles) peuvent être plus appropriés. Variations sur les dimensions du labyrinthe deux choix peuvent être nécessaires selon la taille de l’objet de l’essai et l’espace actif prédite de la phéromone (c.-à-d., près de source par rapport à longue distance)36. De même, les réponses comportementales sont souvent dépendante de la concentration. Si une réponse comportementale n’est pas observée lorsque les phéromones putatifs sont appliqué à la concentration seuil de détection déterminée avec EOG, la concentration de la phéromone devrait être réglée. Toutefois, il convient de noter que même si un composé est une substance odorante puissant, il peut induit pas nécessairement une préférence significative de comportementale. En fin de compte, les réponses comportementales observées dans le labyrinthe devraient être validées en milieu de terrain avec les composés synthétiques pour confirmer la fonction de la phéromone putative.
Une limitation majeure de fractionnement guidée par essai biologique est le test séquentiel de différentes fractions ou composés dans un essai biologique (EOG ou comportement). Travaux antérieurs ont montré l’insecte phéromones sexuelles sont généralement des mélanges de plusieurs composants à des rapports spécifiques37 qui fonctionnent indépendamment comme composants38 ou en synergie comme mélanges39 pour induire des réponses appropriées dans leurs congénères. Par conséquent, composés qui ne sont actifs que lorsqu’ils sont présents dans des mélanges spécifiques peuvent être négligées avec fractionnement guidée par essai biologique car ils nécessitent des tests pour confirmer la bioactivité combinatoires. Autres limites de fractionnement guidée par essai biologique comprennent : 1) une grande quantité de matériel de départ est nécessaire d’avoir une quantité suffisante pour l’analyse structurale, EOG et analyses comportementales ; 2) le processus prend du temps en raison du processus de purification itérative ; et 3) composés de minuscules ou instables ne risquent pas d’être détecté. À l’avenir, surmonter certaines limitations techniques de fractionnement guidée par essai biologique peut exiger une approche hybride de fractionnement bioessai guidée et la métabolomique. Grâce à une approche hybride, effets additifs ou synergiques phéromone sont plus susceptibles d’être discernées13 et composés instables sont plus susceptibles d’être détectés.
Le processus de fractionnement de biodosage guidée décrite est spécialement conçu pour l’identification des phéromones de la lamproie marine. Toutefois, la communication chimique est omniprésente dans le règne animal1 et ce processus peut être facilement adapté pour caractériser les phéromones dans une vaste gamme de taxons. Caractérisation et identification des phéromones sont importantes car les phéromones peuvent être appliquées pour moduler les réponses comportementales résultant dans le contrôle des espèces envahissantes ou le rétablissement des espèces en péril.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions l’US Geological Survey Hammond Bay Station biologique pour l’utilisation de leurs installations de recherche et le personnel du U.S. Fish and Wildlife Service et Pêches et Océans Canada pour fournir de la lamproie marine. Cette recherche a été financée par des subventions de la Commission des pêcheries des grands lacs à Weiming Li et Ke Li.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades - #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
References
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