Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e caracterizar a estrutura, potência olfativa e resposta comportamental de compostos putativos feromônio de lampreias do mar.
Abstract
Fracionamento de bioensaio guiada é uma abordagem iterativa que usa os resultados de bioensaios fisiológicos e comportamentais para guiar o isolamento e a identificação de um composto ativo do pheromone. Esse método resultou na caracterização bem sucedida dos sinais químicos que funcionam como pheromones em uma grande variedade de espécies animais. Lampreias do mar dependem de olfato para detectar feromônios que medeiam respostas comportamentais ou fisiológicas. Nós usamos este conhecimento da biologia de peixes para postular funções de feromônios putativos e guiar o isolamento e a identificação dos componentes do feromônio ativo. Cromatografia é usada para extrair, concentrar e separar compostos da água condicionada. Electro-olfactogram (EOG) gravações são conduzidas para determinar quais frações eliciam respostas olfativas. Ensaios comportamentais labirinto 2-escolha são usados para determinar se qualquer uma das frações odoríferas também são comportamentalmente ativo e induzir uma preferência. Métodos de espectroscopia e espectrometria fornecem a informações estruturais para ajudar com a elucidação da estrutura e peso molecular. A bioatividade dos compostos puros é confirmada com EOG e ensaios comportamentais. As respostas comportamentais observadas no labirinto, em última análise devem ser validadas em um cenário de campo para confirmar sua função em um cenário de fluxo natural. Estes bioensaios desempenham um papel duplo para 1) orientar o processo de fracionamento e 2) confirmar e definir mais a bioatividade dos componentes isolados. Aqui, nós relatamos os resultados representativos de uma identificação de feromônio de lampreia do mar que exemplificam a utilidade da abordagem orientada por bioensaio de fracionamento. A identificação das feromonas de lampreia do mar é particularmente importante porque uma modulação do seu sistema de comunicação de feromônio está entre as opções consideradas para controlar a lampreia invasiva em grandes lagos Laurentian. Esse método pode ser facilmente adaptado para caracterizar a comunicação química em uma ampla gama de táxons e lançar luz sobre ecologia química transmitidas pela água.
Introduction
Os Pheromones são sinais químicos específicos lançados por indivíduos que ajudam-los em localizar fontes de alimentos, detecção de predadores e mediando as interações sociais de coespecíficos1. Comunicação de feromônio de insetos tem sido bem estudados2; no entanto, a identificação química e função biológica de feromônios de vertebrados aquáticos não foram estudados como extensivamente. Conhecimento da identidade e função dos feromônios liberados podem ser aplicadas para facilitar a recuperação de espécies ameaçadas,3,4 ou controle de pragas espécie5,6. A aplicação destas técnicas exige o isolamento e caracterização dos componentes bioativos de feromônio.
Identificação de feromônio é um ramo da química de produtos naturais. Progresso na pesquisa de feromônio tem sido parcialmente limitado devido à natureza das moléculas do pheromone próprios. Feromônios são muitas vezes instáveis e lançado em pequenas quantidades, e apenas algumas técnicas de amostragem para detectar quantidades minuciosas de voláteis7,8 ou compostos hidrossolúveis9existirem. Abordagens para identificar os pheromones incluem 1) uma seleção de alvo de compostos conhecidos, 2) metabolómica e fracionamento 3) guiada por bioensaio. Uma seleção de alvo de compostos conhecidos testes disponíveis comercialmente subprodutos metabólicos de processos fisiológicos, a hipótese de funcionar como feromônios. Esta abordagem é limitante porque os investigadores só podem testar compostos conhecidos e disponíveis. No entanto, resultou na identificação bem sucedida dos hormônios sexuais no goldfish que funcionam como pheromones10,11,12. Metabolómica é uma segunda abordagem de identificação de feromônio que distingue os produtos metabólicos de potencial pequena molécula dentro de um sistema biológico13. Uma comparação dos perfis metabólicos de dois grupos (ou seja, um ativo contra um extrato inativo) permite a identificação de um perfil metabólico potencial de que o metabólito é purificado, a estrutura é elucidada e a Bioatividade é confirmada14. Efeitos aditivos ou sinérgicos de complexas formulações de misturas específicas são mais prováveis a serem detectadas com metabolomics porque metabólitos são considerados juntos, ao invés de como uma série de frações13. Ainda, a implementação da metabolómica baseia-se na disponibilidade de referências sintéticas porque os dados resultantes não facilitam a elucidação de estruturas novas.
Fracionamento de bioensaio guiada é uma abordagem integrada, iterativa que se estende por dois campos: Biologia e química. Essa abordagem usa os resultados de bioensaios fisiológicos e comportamentais para guiar o isolamento e a identificação de um composto ativo do pheromone. Um extrato bruto é fracionado por uma propriedade química (i.e., tamanho molecular, polaridade, etc.) e testado com gravações de electro-olfactogram (EOG) e/ou em um bioensaio. Os componentes bioativos são selecionados para fora, repita essas etapas de fracionamento e EOGs e/ou bioensaios. As estruturas de compostos ativos puros são elucidadas por métodos espectroscópicos e espectrometria, que fornecem o peso molecular e informações estruturais para produzir um modelo do composto para ser sintetizado. Fracionamento de bioensaio guiada pode produzir diversos metabólitos e potencialmente romance feromônios com esqueletos químicos únicos que não são susceptíveis de ser prevista a partir as vias biossintéticas.
Aqui, descrevemos o protocolo de fracionamento de bioensaio guiada usado para isolar e caracterizar a bioatividade dos compostos de feromônio sexual masculino lampreia do mar. A lampreia (Petromyzon marinus) é um modelo ideal de vertebrados para estudar comunicação feromônio porque estes peixes dependem fortemente de detecção olfativa de sugestões químicas para mediar sua história de vida anádroma composta por três fases distintas: larvas, juvenis e adultos. Larvas de lampreia escavam os sedimentos dos córregos de água doce, sofrem uma drástica metamorfose e transformam em juvenis que migram para um lago ou oceano, onde eles parasitar peixe grande anfitrião. Após desanexação do peixe hospedeiro, os adultos migram volta em fluxos de desova, guiado pelos feromônios migratórios lançados por larvas de fluxo-residente15,16,17,18,19 . Machos maduros ascender para a desova, liberar um feromônio de multi-componentes sexo atrair companheiros, spawn intermitentemente para aproximadamente uma semana, e depois morrer de15,20. A identificação de feromônios lampreia é importante porque uma modulação do sistema de comunicação de feromônio é entre as opções consideradas para controlar as lampreias do mar invasivas no Laurentian grandes lagos21.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 e 02/17-031-00).
1. coleta e extração de lampreia condicionado água
- Lugar sexualmente maduras masculinas lampreias do mar (15-30 animais) em um tanque fornecido com 250 L de água de Lago Huron aerada 16-18 ° c, mantida
- Colete a água macho-condicionado ao longo de cada noite de junho a julho.
Nota: lampreias do mar morrer naturalmente após a desova. Se um peixe está chegando neste momento da sua vida, substituí-lo com um macho maduro fresco. - Extrai a água condicionada pela extração de fase sólida.
- Mergulhe a resina em metanol por 4h antes de carregá-lo em uma coluna. Carregar a resina na coluna e, em seguida, bomba de 10 L de água através da coluna para eliminar o solvente orgânico.
- Passe a condicionado água do tanque segurando o peixe através do sistema de bombeamento para o topo da coluna. A água passa por uma cama de 2 kg de resina de troca iônica poliméricos moderadamente polares (ex.., resina Amberlite XAD-7 HP), contida em uma série de quatro colunas de vidro 2,5 L-capacidade. Manter altas velocidades de carga entre 400 e 600 mL/6 min. eluir os metabolitos com 10 L de metanol seguido imediatamente de 5 L de acetona.
Atenção: Esta etapa utiliza metanol e acetona. Ambos são inflamáveis e venenosos.
Nota: O residual em pool pode ser armazenado a-80 ° C até mais processada.
- Reative a coluna após 1 semana de enriquecimento, lavando-o com água (aproximadamente 10 L).
- Remover o solvente orgânico (a mistura de metanol e água) e o extrato da colheita por evaporação rotatória por 5h sob pressão reduzida (abaixo dos 300 mbar) a 40 ° C. Concentre-se o resíduo de água por liofilização secador de congelamento por 48 h a-20 ° C até secar.
2. isolamento de piscinas de fração com cromatografia
- Mergulhe o gel de silicone (230-400 mesh) na fase inicial de móvel de 30 min. transferência do gel com o solvente (suspensão) para uma coluna de vidro. Abra a válvula da coluna para permitir que a fase móvel passar. Permitir que o gel de silicone precipitar e formar uma cama de sílica gel.
- Homogeneizar os extratos com gel de silicone (70-230 mesh) e carregá-los na coluna de cromatografia líquida sobre a cama de sílica gel. Elui-los com um gradiente de 95% CHCl3 (clorofórmio) / MeOH (metanol) para 100% MeOH, 2,5 L de volume total. Recolha o eluente em frascos individuais (cada 10 ml).
Atenção: O clorofórmio utilizado nesta etapa é um reagente venenoso. - Guia o agrupamento dos eluentes em 20 frações por análise de cromatografia (TLC) uma camada fina.
- Realizar o experimento de TLC em placas de gel de sílica pré-revestida aplicando a amostra na linha de partida e imergindo a linha de partida da placa em solventes em desenvolvimento (escolher a polaridade pelo quociente de CHCl3 metanol de 0-100%) em um vidro fechado tanque.
- Selecione a relação de eluente tornar todas as manchas TLC com um fator de retenção (Rf) variando de 0.3 - 0.8.
- Depois que o solvente em desenvolvimento atinge a linha de fundo, tirar a placa do tanque e esperar 10 min para o solvente evapore.
- Visualizar os pontos primeiro sob luz em 254 nm e então mancha UV por pulverizá-los com uma solução ácida de metanol de Anisaldeído 5% (20 μL) por um pulverizador de cromatografia e aquecimento a 85 ° C por 3 min.
Nota: Os pontos coloridos na placa de TLC indicam o principal componente na fração. - Combine o eluente para 20 fracções baseada a cor spot e a similaridade def R do componente principal.
- Concentre-se a fração de um resíduo por evaporação rotatória sob pressão reduzida (300 mbar de acordo com a propriedade de solventes) a 40 ° C por aproximadamente 30 min.
3. Electro-olfactogram (EOG) gravações para identificar frações/compostos odoríferos
- Puxe os capilares de vidro de borosilicato (diâmetro exterior: 1,5 mm; diâmetro interno: 0,86 mm; comprimento: 100 mm) com uma micropipeta extrator com o nível do aquecedor definido para 65.
- Marcar e corte a abertura na ponta do capilar com um cortador de vidro com ponta de diamante e preenchê-lo com ágar fundido de 0,4% em soro fisiológico a 0,9%. A abertura na ponta do capilar deve ser em torno de 10 µm de diâmetro.
- Preencher os eléctrodos capilares puxados de passos 3.1-3.2 e titulares de eletrodos estado sólido pré-fabricados com pelotas de Ag/AgCl (ver Tabela de materiais) com 3 M de KCl utilizando uma micropipeta.
Nota: Desalojar quaisquer bolhas de ar no capilar ou o porta-eletrodo. - Inserir os eletrodos puxados nos porta eletrodo.
- Preparar 100 mL de 10-5 M L-arginina em água filtrada por carvão de uma solução de reserva 10-2 M L-arginina em água desionizada (armazenada a 4 ° C) num balão volumétrico. 20 ml da 10-5 M para um frasco de vidro de L-arginina.
- Para a curva concentração-resposta, prepare-se 10 mL de diluições de 10 vezes das piscinas fração da etapa 2.3 em frascos de vidro. Preparar diluições frescas diariamente antes das experiências e usá-los dentro de um dia. Colocar os frascos de vidro das soluções de trabalho de L-arginina e diluições de piscina a fração em um banho de água de recirculação para permitir que a temperatura equilibrar a 8 ° C.
- Anestesiar a lampreia com éster de ácido etil 3-aminobenzoico (MS222; 100 mg/L) e imobilizá-lo com uma injeção intramuscular de gallamine triethiodide (3 mg/kg de peso corporal, em soro fisiológico a 0,9%) com uma seringa estéril.
Nota: Uma profundidade suficiente de anestesia é determinada pela observação de nenhum movimento de gill, incapacidade de manter uma postura ereta e sem sucção para os lados do tanque usando seu disco oral. Para minimizar qualquer contaminação microbiana antes e durante a cirurgia, usar luvas estéreis e mergulhe os instrumentos de dissecação em etanol a 70% (v: v) em água desionizada pelo menos 10 minutos antes da utilização. - Orientar a lampreia anestesiada em uma barraca em forma de V e envolva-o com uma toalha de papel molhada para evitar a dessecação.
Nota: Não obstrua as aberturas de gill. - Inserir um tubo de recirculação de água gaseificada contendo 50 mg/L de MS222 na cavidade bucal, ajustar a taxa de fluxo e certifique-se de que água está saindo através das aberturas de gill para irrigar continuamente as brânquias.
- Usar um bisturi estéril e fórceps [sob o microscópio estereoscópico em uma ampliação X 1.25 (ver Tabela de materiais)] para remover uma seção2 de 5 mm da pele na superfície da cápsula olfativa para expor o epitélio olfatório.
- Lave o tubo de entrega odorante com água filtrada e conectá-lo à válvula montada sobre um micromanipulador. Coloque o tubo capilar de entrega odorante na cavidade do epitélio olfatório usando o micromanipulador para entregar a água filtrada para o epitélio olfatório para evitar a dessecação quando se administra não odorantes.
- Monte os eletrodos de referência e gravação nos Micromanipuladores. Baixe o eléctrodo de referência sobre a pele externa perto do naris. Usando o microscópio estereoscópico (1,25 X), menor o eletrodo gravação mal tocar a superfície do epitélio olfatório.
- Transferi a absorção do tubo odorant entrega da água filtrada de plano de fundo para a solução de L-arginina 10-5 M.
- Ligue o computador, amplificador (definido como modo de DC), filtro e digitador. Usando o software de driver de válvula, programar o procedimento para administrar o pulso único 4 de s de odorante, marcando a caixa de T1, configuração T para 4 s e marcando a caixa de T2.
- Do software de aquisição de dados (ver Tabela de materiais), defina o modo de aquisição de um osciloscópio de alta velocidade, clique no ícone do jogo e clique em Iniciar no driver de válvula para acionar o pulso de odorante.
Nota: O software de aquisição de dados registra a amplitude de resposta diferencial EOG por 20 s (3 s antes, 4 s durante o pulso odorant e 13 s depois). Use o micromanipulador para manobrar as posições do eléctrodo de gravação, eletrodo de referência ou um tubo de entrega odorante para aumentar a relação sinal-ruído, com um máximo de resposta para o padrão de L-arginina e uma resposta mínima para o controle em branco ( água filtrada). O amplificador comutando o interruptor do amplificador AC-DC para o GND ao mover os eletrodos de terra. - Começa a gravar o controle em branco, L-arginina e então a odorantes preparado na etapa 3.6 de baixas para altas concentrações com um flush de 2 min de água filtrada entre aplicativos.
- Após a gravação de respostas para todos os odores a ser testado, o amplificador à terra e retraia cuidadosamente os eletrodos e o odorant tubo capilar de entrega. Seguindo os métodos aprovados institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC), com o término do experimento EOG, eutanásia a lampreia anestesiada com uma overdose de MS222 (1 g/L).
Nota: Verifique se a eutanásia sucesso observando a falta de movimento de gill e batimento cardíaco pelo menos 5 min, seguido por medular do cérebro. - Analisar e plotar os dados usando o software de análise. Determine o limiar de detecção de odores22 identificar frações odoríferas que eliciam respostas maiores do que o controle de água em branco. As piscinas de fração que eliciam respostas olfativas de concentração-dependente que são diferentes do que o controle de água em branco em seguida são testadas em um ensaio comportamental (passo 4).
4. dois-escolha comportamental bioensaio para identificar frações/compostos comportamentalmente activos de labirinto
- Aclimatar a lampreia feminina sexualmente madura na gaiola lançamento no labirinto (ver Figura complementar 1) 5 min. manter a taxa de fluxo de água do rio no labirinto
Nota: O labirinto é construído a partir de madeira envernizada marinho da classe e medidas 6,5 m de comprimento e 1,2 m de largura com um divisor de 2,7 m de comprimento para separar o labirinto em dois canais no montante final de medição. Água é temporariamente desviada para o labirinto. A profundidade da água deve ser mantida a 0,19 m e a velocidade deve ser mantida a 0,07 m/s ± 0,01. - Liberar a lampreia do mar e gravar a quantidade cumulativa de tempo que a lampreia gasta no experimental e canal de controle de cada rio contendo água durante 10 minutos.
Nota: Se a lampreia do mar não entrar o experimental e controlar o canal para pelo menos 10 s durante este período de 10 min, acabar com o julgamento, como esta é uma indicação de inatividade ou lado forte viés. - Aplicar o teste de estímulo (ou seja, um feromônio putativo em 10-12 M dissolvido em metanol/água deionizada de 50% de água) para o canal experimental aleatoriamente atribuído e o veículo (50% metanol/desionizada) para o canal de controle usando peristáltico bombas em taxas constantes de 200 mL/min para 5 min.
Nota: A concentração limite de deteção do estímulo teste conforme determinado com as gravações de electro-olfactogram deve ser usada como a concentração inicial, para o teste comportamental. - Aplicar o teste de estímulo e o veículo para um adicional 10 min e gravar a quantidade cumulativa de tempo a lampreia gasta o experimental e o canal de controle.
- Irrigue o labirinto com água durante 10 minutos antes do início do julgamento na próxima. Repita as etapas 4.1-4.4 pelo menos 7 lampreias se suficiente estímulo de teste está disponível.
- Calcular um índice de preferência22 para cada julgamento e avaliar o significado usando um teste de Wilcoxon rank-assinado.
Nota: O índice resulta em um número único que pode ser positivo ou negativo. Um valor positivo do índice de preferência indica atração, enquanto um valor negativo do índice de repulsão de indicações de preferência. Se o índice de preferência é significativamente diferente de zero, a fração é considerada ativa.
Aqui,
Bc = o tempo gasto por lampreia no canal de controle, antes da aplicação de odorante, teste
Be = o tempo gasto no canal experimental antes da aplicação de odorante,
C = o tempo gasto no canal de controle após a aplicação de odorante, e
Ume = o tempo gasto no canal experimental após a aplicação de odorante.
5. cromatografia em fase gasosa isolamento de compostos puros de frações ativas
- Repita os passos 2.1-2.4 com as piscinas de fração que induzem respostas olfativas (etapa 3) e eliciar respostas comportamentais (passo 4).
- Purifica ainda mais as frações ativas em compostos com tamanho-exclusão cromatografia usando uma coluna de Sephadex LH-20.
- Preparar a amostra em 0,5 mL na fase inicial do móvel [CHCl3- MeOH (1:1) ou MeOH 100%], carregar na coluna correspondente uma CHCl3- MeOH (1:1) coluna e, em seguida, uma coluna de MeOH (100%) e Elui-los para produzir os compostos.
6. estrutura elucidação de um composto puro com espectrometria de massa (MS) e ressonância magnética Nuclear (NMR)
- Dissolver e diluir o composto purificado na primeira fase móvel (normalmente, o metanol para água, 1:1, v: v) de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para formar uma solução μL 10 de aproximadamente 1 μg/mL.
- Transferir a solução de amostra para frascos HPLC e configurá-los para o mostruário de HPLC. Injetar a espectrometria de massa de ionização de electrospray (ESIMS) da amostra (10 μL) e gravar os espectros de espectrometria de massa (HRESIMS) de ionização electrospray de alta resolução usando um espectrômetro de massa de cromatografia23.
- Prever a fórmula molecular de acordo com o banco de dados no software do espectrômetro de massa (veja Tabela de materiais)24.
- Abra o cromatograma da amostra injetada e obter seu espectro de massa selecionando o pico cromatográfico.
- Entrada a massa medida valor de íon (m/z) (4 casas decimais) na composição elementar sob o módulo da ferramenta . Defina o parâmetro de tolerância PPM < 5.
- Ajuste os parâmetros do símbolo para caber o elemento de composição da molécula medido. O software produz uma previsão de fórmula molecular com base na análise da massa única.
- Selecione os solventes deuterados (600 μL, CH3OH -d4 ou DMSO -d6) de acordo com o protocolo25 para dissolver as amostras.
- Dissolva completamente a amostra em solventes deuterados selecionados para formar uma solução com uma concentração variando entre aproximadamente 0,1 a 10 mg/mL. Transferir a solução de amostra para um tubo NMR para gravar o 1D (1H, 13. C) e 2D-NMR [1H -1H espectroscopia de correlação (acolhedor), heteronuclear única coerência quântica (HSQC), heteronuclear correlação múltiplo de ligação (HMBC)] espectros em um espectrômetro de 900MHz NMR26.
- Coloca o tubo NMR com a amostra dentro da turbina do girador. Use o medidor de profundidade para garantir que a altura da amostra é no meio da janela de medição. Abra o software NMR (ver Tabela de materiais) e clique no botão do elevador para alterar a amostra no imã.
Nota: Mantenha uma mão por cima do íman para sentir o gás vindo de cima do ímã. Ao mesmo tempo, um som sibilante deve ser audível. - Delicadamente, coloque a amostra sobre o coxim de ar em cima do ímã e apertar o botão de levantar novamente a descer a amostra para o ímã de NMR.
Nota: Ouvi um barulho de "clique" indicar que a amostra está na posição certa. - Criar um novo dataset e carregar os parâmetros padrão recomendados pelo instrumento NMR (ver Tabela de materiais).
- Tipo de "bloqueio" para invocar o procedimento de bloqueio automático e selecionar o solvente na página de alerta.
- Para ajuste fino, no painel de Manipulate, ajustar o botão no modelo de desbloqueio , ajustar o cursor no painel de manipular e bloquear o ímã novamente.
- Na prompt de Atma página, ajuste o parâmetro no painel manipular para o procedimento de ajuste, que pode levar alguns minutos. Espere até que a afinação está concluída para prosseguir.
- Inicie a rotina automática rasamento digitando "topshim" no prompt de. Aguarde até que os shims é concluído para prosseguir.
- Tipo "rga" para definir automático recebendo ajustes de ganho e, em seguida, tipo "d1" para definir o intervalo entre pulsos e, em seguida, tipo "zg" para iniciar a aquisição e esperar até que seja concluída a aquisição.
- Tipo "ef" ou "pqe" para processar os dados e digite "apk" para eliminação automática. Processe os dados sobre o software de processamento de NMR.
- Elucidar a estrutura química por uma interpretação da análise dos dados NMR.
- Conte os sinais de carbono no espectro RMN C 13. Selecione a fórmula molecular correspondente do resultado previsto em espectrometria de massa de alta resolução (HR-MS).
- Integrar os sinais de próton no espectro 1H NMR e atribuir a conectividade da e próton-carbono os sinais no espectro HSQC.
- Atribua a conectividade do esqueleto de carbono baseado no espectro HMBC e correlações no 1H -1H COSY.
- Tentativamente atribua a estrutura química baseada na estrutura lógica27. A estrutura provisória da pesquisa nos bancos de dados de estrutura química. Compare a estrutura provisória com os análogos em referências.
- Atribua a configuração relativa com o espectro Nuclear Overhauser efeito espectroscopia (NOESY).
Nota: Uma vez que as propriedades da identidade dos enantiômeros exibidos na espectrometria e métodos espectroscópicos são idênticas, a configuração absoluta de alguns compostos, especialmente aqueles com álcool 2' e 2'-NH2, tem de ser determinada com um reação de derivatização. Após a reação de derivatização, as diferenças indicadas em espectros de facilitam a atribuição inequívoca das configurações absolutas da maioria dos compostos28.
7. EOG e bioensaio para confirmar compostos puros são odoríferos e comportamentalmente ativo
- Repita as etapas 3.1-3.5.
- Para a curva concentração-resposta, prepare-se 10 mL de 10 vezes as diluições dos compostos puros de 10-6 M - 10-13 M de uma solução stock de feromônio de 10-3 M em 50% de metanol/água armazenado a-20 ° C, com base no peso molecular determinado em Passo 6.2. Colocar os frascos de vidro com as soluções de trabalho de L-arginina e os compostos puros em um banho de água de recirculação para permitir que a temperatura equilibrar a 8 ° C.
- Repita as etapas de 3.7-3.18.
- Repita as etapas 4.1-4.2.
- Aplica o composto puro na concentração limite EOG deteção para o canal experimental aleatoriamente atribuído e o veículo (50% metanol/desionizada), para o canal de controle usando uma bomba peristáltica em taxas constantes de 200 mL/min para 5 min.
- Repita as etapas de 4.4-4.6.
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Representative Results
Um diagrama Resumindo as etapas descritas no protocolo do fracionamento de bioensaio guiadas é mostrado na Figura 1. O protocolo envolve etapas para isolar e caracterizar a estrutura, a potência olfativa e a atividade comportamental de 5 putativo lampreia feromônios (Figura 2). Utilizando a espectrometria de massa e dados NMR (Figura 3 e Figura 4), as estruturas do petromyzene A-B e petromyzone A C foram elucidadas de água condicionada com macho maduro mar lampreias22,29.
Nossos dados representativos das gravações EOG (Figura 5) demonstram que petromyzene A-B e petromyzone A C eram todos odorantes potentes que estimularam o epitélio olfatório adulto lampreia do mar e tinham baixos limites de deteção (Figura 6) . Da nota particular, as gravações EOG exigem uma colocação adequada do eletrodo gravação na superfície do epitélio olfatório relativo para o tubo de entrega de estímulo para resultar em uma boa relação sinal-ruído para confiável odorant gravações de resposta ( Figura 5B). Se não for seguido este passo crítico, será difícil de discernir o sinal induzido pelo odorant entre o ruído elevado. A deflexão descendente do rastreamento EOG após a exposição de odorante é um potencial negativo. Um bom sinal EOG deve mostrar uma administração de odorante, resultando em uma resposta rápida e afiada, seguida por uma recuperação da linha de base. As respostas olfativas para os feromônios putativos também foram normalizadas para as respostas de 10-5 M L-arginina, um controle positivo odorant na lampreia do mar, testada em toda a experiência para garantir a integridade das gravações foi mantida.
No labirinto de dois-escolha comportamental ensaios (Figura 7A), ovularam femininas lampreias do mar foram atraídas para A petromyzone, A petromyzene e petromyzene B e repelido de petromyzone C. Ovulated fêmeas pareciam ser repelido do petromyzone B; no entanto, a resposta comportamental não foi significativa (Figura 7B). Um tamanho de amostra maior não foi possível devido à quantidade limitada de petromyzone B. Para avaliar correctamente a resposta comportamental a um odorante, é fundamental para gravar o viés de pré-tratamento para o controle e o canal experimental de cada lampreia.
Figura 1: um fluxograma do fracionamento guiada por bioensaio de pheromones. Esta figura é uma adaptação de figura 2 no Buchinger, Li e Li30. As caixas indicam que o produto químico resultante de técnica indicada no salão oval. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: as estruturas químicas de petromyzene A-B e petromyzone A-C. Esta figura é modificada no 1 de figuras em Li et al. 22 , 29. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Espectro RMN de figura 3:1. Espectro de RMN 1D de petromyzene r: (A) espectro 1H NMR (900 MHz) e (B) a 13C NMR (225 MHz) espectro. Esta figura é das informações de apoio em Li et al. 29. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: espectro de RMN 2D. 2D spectra NMR de petromyzene r: (A), o espectro HSQC, (B) a 1H -1H COSY espectro, (C) o HMBC espectro e (D) a NOESY espectro. Esta figura é das informações de apoio em Li et al. 29. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Electro-olfactogram (EOG) gravações de rastreamento de preparação e representante de gravação. (A) esta é uma preparação EOG mostrando o epitélio olfatório expostas lampreia do mar com o eletrodo de gravação, o eletrodo de referência, o tubo de entrega odorant e a água oxigenada com a anestesia. (B), este painel mostra gravações representativas rastreamento demonstrando bom (topo) ou rácios de sinal-ruído de más (parte inferior). Uma boa relação sinal-ruído é necessária para gravações de respostas odorant confiável. A deflexão descendente do rastreamento EOG após a exposição de odorante é um potencial negativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: um enredo semilogarítmico das curvas concentração-resposta de electro-olfactogram (EOG). A Petromyzone C e petromyzene A e B foram estimulatórios para o epitélio olfatório adulto lampreia do mar e tinham limites de deteção de baixo. Os dados são apresentados como a média normalizada EOG ± amplitude no MEV mostrou Os tamanhos de amostra foram os seguintes: petromyzone A, petromyzene A e petromyzene B (n = 7) e petromyzone B e petromyzone C (n = 5). A inserção é uma visão expandida da respostas EOG mostrando resposta concentrações limiar. Esta figura foi modificada da Figura 3 em Li et al. 22 e Figura 4 em Li et al. 29. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: um esquema e os resultados do dois-escolha labirinto usado para avaliar as respostas comportamentais de ovularam femininas lampreias do mar para odorantes. (A), a seta representa a direção do fluxo de água (0,07 m s-1 ± 0,01). Os círculos representam os pontos de administração odorante. Pequenas linhas tracejadas representam malha fina utilizada para restringir o movimento da lampreia do mar para os confins do labirinto. As grandes linhas tracejadas representam fluxo placas usadas para reduzir a turbulência da água. O retângulo cinzento representa a gaiola de lançamento. Barra de escala = 1 m. Esta figura é de S1 Figura em Li et al. 29. (B) as fêmeas foram atraídas para A petromyzone, A petromyzene e petromyzene B. O tempo gasto de lampreia em cada canal do labirinto antes e após a exposição de odorante (10-12 M) foi usada para calcular um índice de preferência para avaliar sua resposta comportamental para o odorant. Um valor positivo do índice de preferência indica atração. O tamanho da amostra, n, é relatado fora dos parênteses, e o número entre parênteses indica o número de fêmeas através de ensaios que passaram mais tempo no canal experimental em comparação com o controle. Os dados são apresentados como média ± no MEV mostrou (* p < 0,05; Teste de Wilcoxon rank assinado) para comparar a preferência comportamental antes e após a exposição de odorante. Esta figura foi modificada da Figura 4 em Li et al. 22 e Figura 5 em Li et al. 29. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1: uma fotografia do labirinto. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Peixes vivos num mundo químico cheio de compostos ainda não identificados. Fracionamento de bioensaio guiadas provou essencial para identificar e caracterizar moléculas bioativas que medeiam muitas interações químicas, tais como aqueles observados em masu salmão31elefantes asiáticos32e lampreias do mar33, 34,35. Fracionamento de bioensaio guiada é uma abordagem eficaz para rastreamento com precisão e identificar que os compostos bioativos a partir do extrato para o composto ativo purificado. Usando essa abordagem, os compostos bioativos identificados podem revelar um romance composto com um esqueleto químico exclusivo que é improvável de ser prevista a partir as vias biossintéticas conhecidas.
Gravações de EOG são conduzidas para determinar quais frações ou compostos eliciam respostas olfativas. Várias considerações técnicas são imperativas para medir com precisão as respostas olfativas para os feromônios putativos com gravações EOG. Em primeiro lugar, em conformidade com o cuidado de Animal institucionais e procedimentos de Comité de uso aprovado, o peixe deve ser profundamente anestesiado com éster de ácido etil 3-aminobenzoico (MS222) e imobilizado com uma injeção intramuscular de gallamine triethiodide. O eletrodo gravação irá detectar qualquer movimento das guelras e batimento cardíaco devido a uma insuficiente imobilização, que pode ser uma fonte de ruído elétrico. Em segundo lugar, o epitélio olfatório deve ser imediatamente exposto a água filtrada em carvão vegetal após a dissecação para evitar a dessecação. Ajuste a localização do eletrodo gravação e referência com os Micromanipuladores, o aterramento elétrico e o tubo de entrega odorante pode ajudar a maximizar a resposta para o controlo positivo odorante, minimizando a resposta para o controle em branco ( água filtrada). Em terceiro lugar, depois de identificar um local de gravação sensível no epitélio olfatório, é importante para o registro de uma posição semelhante nas lamelas para minimizar a variação. Para gravar a partir de um local semelhante consistentemente, mantenha o tanque e o suporte de plástico em forma de V, segurando o peixe, o microscópio, o tubo de entrega odorant e os Micromanipuladores na mesma posição. O tubo anestésico deve permanecer na cavidade bucal do peixe para a duração da experiência para assegurar que ela permaneça anestesiada. No entanto, o posicionamento dentro da cavidade bucal e a taxa de fluxo do anestésico pode ser modificado se o eletrodo de gravação é detectar o movimento da água resultando em uma linha de base irregular do sinal elétrico.
O design do ensaio comportamental deve ser adaptado para a ecologia comportamental da cobaia e a questão de pesquisa de interesse. Ensaios comportamentais labirinto 2-escolha são usados para determinar se qualquer das frações odoríferas também são comportamentalmente ativo. Porque compostos purificados, muitas vezes só estão disponíveis em quantidades diminutas, o labirinto é um bioensaio comportamental benéfico em comparação com o fluxo devido a uma descarga inferior. Estávamos interessados em avaliar a preferência de perto-fonte de feromônios sexo putativo lançado por machos maduros previstos para atrair companheiros femininos maduros nas proximidades e mantê-las em um ninho para a desova. O ensaio comportamental foi desenhado para reproduzir as condições naturais de uma fêmea ovulated escolhendo entre os odores dos machos maduros. Portanto, foi relevante testar ovularam fêmeas como a cobaia em experiências nosso comportamento. No entanto, dependendo o odorant testado, outras cobaias (ou seja, fase de vida diferente ou machos) podem ser mais apropriadas. Variações nas dimensões do dois-escolha labirinto podem ser necessárias dependendo do tamanho do assunto o teste e o espaço ativo previsto do feromônio (i.e., perto da fonte contra a longa distância)36. Da mesma forma, respostas comportamentais são muitas vezes dependente de concentração. Se a resposta comportamental não é observada quando o feromônio putativo é aplicado na concentração limiar deteção determinada com EOG, a concentração do feromônio deve ser ajustada. No entanto, deve notar-se que mesmo se um composto é um potente odorante, pode não necessariamente induzir uma significativa preferência comportamental. Em última análise, as respostas comportamentais observadas no labirinto devem ser validadas em um cenário de campo com o composto sintético para confirmar a função do feromônio putativo.
Uma grande limitação de fracionamento de bioensaio guiadas é o teste sequencial de frações individuais ou compostos em um bioensaio (EOG ou comportamento). Trabalhos anteriores tem mostrado inseto feromonas sexuais normalmente são misturas de vários componentes em proporções específicas37 que funcionam independentemente como componentes38 ou em sinergia como misturas de39 para induzir as respostas adequadas em coespecíficos. Portanto, compostos que só são ativos quando presentes em misturas específicas podem ser negligenciados com fracionamento guiada por bioensaio porque requerem combinatórias testes para confirmar a bioatividade. Outras limitações de fracionamento de bioensaio guiadas incluem: 1) uma grande quantidade de material começar é necessária ter uma quantidade suficiente para a análise estrutural, EOG e ensaios comportamentais; 2) o processo é demorado devido ao processo de purificação iterativo; e 3) minúsculos ou instáveis compostos não são susceptíveis de ser detectado. No futuro, superar algumas das limitações técnicas de fracionamento de bioensaio guiadas pode exigir uma abordagem hibridizada de fracionamento guiada por bioensaio e metabolomics. Usando uma abordagem hibridizada, efeitos aditivos ou sinérgicos feromônio são mais propensos a ser identificados13 e compostos instáveis são mais prováveis a serem detectadas.
O processo de fracionamento de bioensaio guiadas descrito é projetado especificamente para a identificação de feromonas de lampreia do mar. No entanto, comunicação química é onipresente no reino animal1 e esse processo pode ser facilmente adaptado para caracterizar os feromônios em uma ampla gama de táxons. Caracterização e identificação de feromônios são importantes porque feromônios podem ser aplicados para modular respostas comportamentais, resultando no controle de espécies invasoras ou na restauração de imperiled espécies nativas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a US Geological Survey Hammond Bay estação biológica para a utilização das suas instalações de pesquisa e o pessoal dos EUA peixe e serviço de vida selvagem e pesca e oceanos Canadá para fornecer lampreias do mar. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios da Comissão da pesca dos grandes lagos para Weiming Li e Ke Li.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades - #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
References
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