Summary
Qui, presentiamo un protocollo per isolare e caratterizzare la struttura, la potenza olfattiva e la risposta comportamentale dei composti di feromone presunto di lamprede di mare.
Abstract
Frazionamento analisi biologica-guida è un approccio iterativo che utilizza i risultati delle analisi biologiche fisiologici e comportamentali per guidare l'isolamento e l'identificazione di un composto attivo feromone. Questo metodo ha provocato la riuscita caratterizzazione dei segnali chimici che funzionano come i feromoni in una vasta gamma di specie animali. Lampreda di mare si basano su olfatto per rilevare i feromoni che mediano le risposte comportamentali o fisiologiche. Usiamo questa conoscenza della biologia dei pesci a postulare funzioni di putativi feromoni e per guidare l'isolamento e l'identificazione dei componenti attivi di feromone. Cromatografia è usata per estrarre, concentrarsi e separare composti dall'acqua climatizzata. Electro-olfactogram (EOG) registrazioni sono condotte per determinare quali frazioni elicitare risposte olfattive. Analisi comportamentale di due-scelta labirinto vengono quindi utilizzate per determinare se uno qualsiasi delle frazioni odorose sono anche relativamente al comportamento attivo e indurre una preferenza. Spettroscopici e spettrometrici metodi forniscono il peso molecolare e strutturale informazioni per assistere con la delucidazione della struttura. La bioattività dei composti puri è confermata con analisi comportamentale ed EOG. Le risposte comportamentali osservate nel labirinto, in definitiva, devono essere convalidate in un ambiente di campo per confermare la loro funzione in un ambiente naturale flusso. Queste analisi biologiche giocano un doppio ruolo per 1) guida il processo di frazionamento e 2) confermare e definire ulteriormente la bioattività di componenti isolati. Qui, segnaliamo i risultati rappresentativi di un'identificazione del feromone di lampreda di mare che esemplificano l'utilità dell'approccio frazionamento analisi biologica-guida. L'identificazione di feromoni lampreda di mare è particolarmente importante poiché una modulazione del suo sistema di comunicazione di feromone è fra le opzioni considerate per controllare la lampreda di mare dilagante in grandi laghi Medicea Laurenziana. Questo metodo può essere facilmente adattato per caratterizzare la comunicazione chimica in una vasta gamma di taxa e gettare luce sull'ecologia chimica a base acquosa.
Introduction
I feromoni sono specifici segnali chimici rilasciati dagli individui che li aiutano nell'individuazione di fonti di cibo, rilevamento di predatori e mediare le interazioni sociali di conspecifici1. Comunicazione di feromone negli insetti è stato ben studiato2; Tuttavia, l'identificazione chimica e funzione biologica dei feromoni di vertebrati acquatici non sono stati studiati come ampiamente. Conoscenza dell'identità e della funzione dei feromoni rilasciati possono essere applicati per facilitare il recupero di specie minacciate3,4 o controllo dei parassiti specie5,6. L'applicazione di queste tecniche richiedono l'isolamento e la caratterizzazione dei componenti bioattivi feromone.
Identificazione di feromone è una branca della chimica dei prodotti naturali. Progresso nella ricerca di feromone è stato parzialmente limitato a causa della natura delle molecole feromone stesse. I feromoni sono spesso instabili e rilasciato in piccole quantità, ed esistono solo alcune tecniche di campionamento per rilevare piccole quantità di volatili7,8 o9di composti solubili in acqua. Approcci per identificare i feromoni includono 1) uno screening mirato di composti conosciuti, 2) metabolomica e frazionamento 3) analisi biologica-guida. Uno screening mirato di composti noti test disponibili in commercio sottoprodotti metabolici dei processi fisiologici supposti per funzionare come i feromoni. Questo approccio è limitante perché i ricercatori possono testare solo composti noti e disponibili. Tuttavia, ha provocato l'identificazione riuscita degli ormoni sessuali nel pesce rosso che la funzione come feromoni10,11,12. Metabolomica è un secondo metodo di identificazione di feromone che contraddistingue i prodotti metabolici piccola molecola potenziale all'interno di un sistema biologico13. Un confronto dei profili metabolici dei due gruppi (cioè, un attivo contro un estratto inattivo) consente l'identificazione di un profilo metabolico potenziale da cui il metabolita viene purificato, la struttura è stata chiarita e la bioattività è confermata14. Effetti additivi o sinergici delle complesse formulazioni di miscele specifiche sono più probabili essere rilevato con metabolomica poiché i metaboliti sono considerati insieme, piuttosto che come una serie di frazioni13. Ancora, l'implementazione della metabolomica si basa sulla disponibilità di riferimenti sintetici perché i dati risultanti non facilitano la delucidazione di nuove strutture.
Frazionamento analisi biologica-guida è un approccio iterativo che si estende su due campi: chimica e biologia. Questo approccio utilizza i risultati delle analisi biologiche fisiologici e comportamentali per guidare l'isolamento e l'identificazione di un composto attivo feromone. Un estratto grezzo è frazionato da una proprietà chimica (cioè, dimensioni molecolari, polarità, ecc.) e testato con electro-olfactogram (EOG) registrazioni e/o in un'analisi biologica. I componenti bioattivi sono proiettati ripetendo questi passi di frazionamento ed EOGs e/o le analisi biologiche. Le strutture di composti attivi puri sono delucidate da metodi spettroscopici e spettrometrici, che forniscono il peso molecolare e strutturale informazioni per produrre un modello del composto da sintetizzare. Frazionamento analisi biologica-guida può produrre metaboliti diversi e potenzialmente romanzo feromoni con scheletri chimici unici che difficilmente essere predetto dalle vie biosintetiche.
Qui, descriviamo il protocollo di frazionamento analisi biologica-Guida utilizzato per isolare e caratterizzare la bioattività di lampreda di mare maschio sesso composti di feromone. La lampreda di mare (Petromyzon marinus) è un modello ideale di vertebrati di studiare comunicazione di feromone, perché questi pesci si basano molto sulla rilevazione olfattiva dei segnali chimici per mediare la loro storia di vita anadroma composto da tre fasi distinte: le larve, giovanile e adulto. Petromyzon marinus larve traforare il sedimento di corsi d'acqua dolce, subiscono una drastica metamorfosi e trasformano in novellame che migrano a un lago o un oceano dove essi parassitano pesci di host di grandi dimensioni. Dopo aver scollegato dal pesce host, gli adulti migrano indietro in flussi di deposizione delle uova, guidati dai migratori feromoni rilasciati da larve di flusso-residente15,16,17,18,19 . I maschi maturi salire verso le zone di riproduzione, rilascia un feromone sessuale multi-componente per ottenere gli accoppiamenti, in modo intermittente deporre le uova per circa una settimana e poi morire15,20. L'identificazione di feromoni lampreda di mare è importante poiché una modulazione del sistema di comunicazione di feromone è fra le opzioni considerate per controllare le lamprede di mare dilagante nel Laurentian Great Lakes21.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato della Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 e 02/17-031-00).
1. raccolta ed estrazione di lampreda di mare condizionata acqua
- Posto sessualmente maturi lamprede mare maschile (15-30 animali) in un serbatoio fornito con 250 L di acqua di Lago Huron aerata mantenuta a 16-18 ° C.
- Raccogliere l'acqua uomo-condizionato in tutto ogni sera da giugno a luglio.
Nota: lamprede di mare naturalmente muoiono dopo la deposizione delle uova. Se un pesce si avvicina a questo punto della sua vita, è possibile sostituirlo con un uomo maturo fresco. - Estrarre l'acqua condizionata di estrazione in fase solida.
- Immergere la resina in metanolo per 4 h prima di caricarli in una colonna. Caricare la resina nella colonna, quindi pompa 10 L di acqua attraverso la colonna per eliminare il solvente organico.
- Passare l'acqua condizionata dal serbatoio che tiene i pesci tramite il sistema di pompaggio alla parte superiore della colonna. L'acqua passa attraverso un letto di 2 kg di resina a scambio ionico, moderatamente polare polimerici (ad es.., resina Amberlite XAD-7 HP), contenuta in una serie di quattro colonne di vetro 2,5 L-capacità. Mantenere la velocità di carico compresa tra 400 e 600 mL/min. 6 eluire i metaboliti con 10 L di metanolo seguita immediatamente da 5 L di acetone.
Attenzione: Questo passaggio utilizza metanolo e acetone. Entrambi sono infiammabili e velenosi.
Nota: Il pool residuo sono memorizzabili a-80 ° C fino a ulteriormente elaborati.
- Riattivare la colonna dopo 1 settimana di arricchimento mediante lavaggio con acqua (circa 10 L).
- Rimuovere il solvente organico (la miscela di acqua e metanolo) e raccogliere l'estratto per evaporazione rotatorio per 5 h sotto pressione ridotta (meno di 300 mbar) a 40 ° C. Concentrare il residuo di acqua da congelare liofilizzazione essiccatore per 48 h a-20 ° C fino a secco.
2. isolamento della frazione piscine con cromatografia
- Immergere il gel di silice (230-400 mesh) nella fase iniziale mobile per 30 min. trasferimento del gel con il solvente (sospensione) per una colonna di vetro. Aprire la valvola della colonna per consentire la fase mobile passare attraverso. Lasciare che il gel di silice a precipitare e formare un letto di gel di silice.
- Mescolare accuratamente gli estratti con gel di silice (70-230 mesh) e caricarli nella colonna cromatografia liquida sopra il letto di gel di silice. Eluire li con un gradiente dal 95% CHCl3 (cloroformio) / MeOH (metanolo) al 100% MeOH, 2,5 L di volume totale. Raccogliere l'eluente in fiale individuali (ogni 10 ml).
Attenzione: Il cloroformio utilizzato in questo passaggio è un reagente velenoso. - Guida la condivisione degli eluenti in 20 frazioni da un'analisi di cromatografia (TLC) di strato sottile.
- Eseguire l'esperimento di TLC su lastre di gel di silice prepatinato applicando il campione sulla linea di partenza e immergendo la linea di partenza della piastra nei solventi in via di sviluppo (scegliere la polarità per il rapporto di CHCl3 di metanolo da 100-0%) in un bicchiere sigillato serbatoio.
- Selezionare il rapporto di sviluppo di solvente per rendere tutte le macchie TLC con un fattore di conservazione (Rf) che vanno da 0,3 - 0,8.
- Dopo che il solvente in via di sviluppo raggiunge il fine linea, prendere la piastra dal serbatoio e attendere 10 min per evaporare il solvente.
- Visualizzare le macchie prima sotto UV luce a 254 nm e macchia poi loro da spruzzare con una soluzione acida metanolo di 5% anisaldeide (20 μL) di uno spruzzatore di cromatografia e loro riscaldamento a 85 ° C per 3 min.
Nota: Le macchie colorate sulla piastra TLC indicano il componente principale della frazione. - Combinare l'eluente a 20 frazioni sulla base del colore spot e la somiglianza dif R del componente principale.
- Concentrare la frazione ad un residuo di evaporazione rotatorio sotto pressione ridotta (300 mbar secondo la proprietà di solventi) a 40 ° C per circa 30 min.
3. Electro-olfactogram (EOG) registrazioni per identificare frazioni/composti odorosi
- Tirare tubi capillari in vetro borosilicato (diametro esterno: 1,5 mm; diametro interno: 0.86 mm; Lunghezza: 100 mm) con una micropipetta estrattore con il livello di riscaldamento impostato su 65.
- Punteggio ottenuto e tagliare l'apertura all'estremità del capillare con un tagliavetro a punta di diamante e riempirlo con fuso 0,4% agar in soluzione fisiologica allo 0,9%. L'apertura all'estremità del capillare dovrebbe essere circa 10 µm di diametro.
- Riempimento degli elettrodi capillari tirati da passaggi 3.1-3.2 e titolari di elettrodi a stato solido prefabbricati con pellet di Ag/AgCl (Vedi Tabella materiali) con 3M KCl utilizzando una micropipetta.
Nota: Rimuovere eventuali bolle d'aria nel capillare o il pinza porta elettrodo. - Inserire gli elettrodi tirati i portaelettrodi.
- Preparare 100 mL di 10-5 M L-arginina in acqua filtrata carbone da una soluzione madre di L-arginina 10-2 M in acqua deionizzata (conservato a 4 ° C) in un matraccio tarato. Trasferire 20 mL del 10-5 M L-arginina per un flaconcino di vetro.
- Per la curva di concentrazione-risposta, preparare 10 mL di 10 volte diluizioni delle piscine frazione dal passaggio 2.3 in flaconcini di vetro. Preparare diluizioni fresche tutti i giorni prima degli esperimenti e utilizzarli all'interno di un giorno. Mettere i flaconi di vetro delle soluzioni lavoro di L-arginina e le diluizioni di piscina frazione in un bagno di acqua a ricircolo per consentire alla temperatura di equilibrare a 8 ° C.
- Anestetizzare la lampreda con estere etilico dell'acido 3-aminobenzoic (MS222; 100 mg/L) e immobilizzare e con un'iniezione intramuscolare di gallamine triethiodide (3 mg/kg di peso corporeo, in soluzione fisiologica allo 0,9%) con una siringa sterile.
Nota: Una sufficiente profondità dell'anestesia è determinata osservando nessun movimento di gill, un'incapacità di mantenere una postura eretta e nessuna aspirazione ai lati della cisterna con relativo disco orale. Per ridurre al minimo qualsiasi contaminazione microbica prima e durante la chirurgia, indossare guanti sterili e immergere gli strumenti di dissezione in etanolo al 70% (v: v) in acqua deionizzata per almeno 10 minuti prima dell'uso. - Orientare la lampreda anestetizzata in un basamento a forma di V e avvolgerlo con un tovagliolo di carta bagnato per evitare il disseccamento.
Nota: Non ostruire le aperture branchiali. - Inserire un tubo di ricircolo acqua aerata contenenti 50 mg/L di MS222 nella cavità buccale, regolare la portata e garantire che l'acqua sta uscendo tramite le aperture branchiali per irrigare continuamente le branchie.
- Utilizzare un bisturi sterile e forcipe [sotto il microscopio stereoscopico a ingrandimento 1.25 X (Vedi Tabella materiali)] per rimuovere una sezione di2 5 mm della pelle sulla superficie della capsula olfattiva per esporre l'epitelio olfattivo.
- Sciacquare il tubo di consegna odorant con acqua filtrata e collegarlo alla valvola montata su un micromanipolatore. Posizionare il tubo capillare di consegna odorant nella cavità epitelio olfattivo utilizzando il micromanipolatore per fornire acqua filtrata all'epitelio olfattivo per evitare essiccazione non somministrare odoranti.
- Montare gli elettrodi di riferimento e registrazione sui micromanipolatori. Abbassare l'elettrodo di riferimento sulla pelle esterna vicino la naris. Utilizzando il microscopio stereoscopico (1,25 X), l'elettrodo di registrazione inferiore a malapena a toccare la superficie dell'epitelio olfattivo.
- Trasferire l'assorbimento del tubo di consegna odorant dall'acqua filtrata di sfondo per la soluzione di L-arginina 10-5 M.
- Accendere il computer, amplificatore (impostato su modalità DC), filtro e digitalizzatore. Utilizzando il software del driver valvola, programmare la procedura per l'amministrazione di un singolo impulso 4 di s di odorizzante selezionando la casella di T1, impostazione T a 4 s e selezionando la casella di T2.
- Del software di acquisizione dati (Vedi Tabella materiali), impostare la modalità di acquisizione di un oscilloscopio ad alta velocità, fare clic sull'icona del gioco e quindi fare clic su Avvia nel driver della valvola per innescare l'impulso di odorizzante.
Nota: Il software di acquisizione dati registra automaticamente l'ampiezza di risposta EOG differenziale per 20 s (3 s prima, 4 s durante l'impulso di odorizzante e 13 s in seguito). Utilizzare il micromanipolatore per manovrare le posizioni della registrazione dell'elettrodo, elettrodo di riferimento o del tubo di consegna odorant per aumentare il rapporto segnale-rumore con un massimo di risposta per lo standard di L-arginina e una risposta minima per il controllo in bianco ( acqua filtrata). L'interruttore AC-DC amplificatore a GND durante lo spostamento gli elettrodi di terra dell'amplificatore. - Avviare la registrazione di controllo vuoto, L-arginina e quindi l'odorizzazione preparata al punto 3.6 da bassa ad alta concentrazione con una scala di 2 min di acqua filtrata tra le applicazioni.
- Dopo aver registrato le risposte a tutti l'odorizzazione da testare, massa l'amplificatore e ritrarre accuratamente gli elettrodi e odorant tubo capillare di consegna. Seguendo i metodi approvati istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC), al termine dell'esperimento EOG, eutanasia la lampreda anestetizzata con una overdose di MS222 (1 g/L).
Nota: Verificare successo eutanasia osservando una mancanza di movimento gill e battito cardiaco per almeno 5 min seguita da spinale al cervello. - Analizzare e tracciare i dati utilizzando software di analisi. Determinare la soglia di rilevazione di odorizzazione22 per identificare le frazioni odorose che suscitano le risposte rispetto al controllo di acqua vuota. Le piscine di frazione che suscitano le risposte olfattive dipendente dalla concentrazione che sono diverse rispetto al controllo di acqua vuota quindi sono testate in un'analisi comportamentale (passaggio 4).
4. due-scelta comportamentale analisi biologica per identificare frazioni/composti attivi relativamente al comportamento del labirinto
- Acclimatare la lampreda di mare femmina sessualmente matura nella gabbia rilascio nel labirinto (Vedi complementare figura 1) per 5 min, mantenere la portata delle acque del fiume nel labirinto
Nota: Il labirinto è costruito da legno verniciato marino del grado e misure 6,5 m di lunghezza e 1,2 m di larghezza con un divisore di 2,7 metri di lunghezza per separare il labirinto in due canali alla fine a Monte. Acqua viene temporaneamente deviato verso il labirinto. La profondità dell'acqua deve essere mantenuta a 0,19 m e la velocità dovrebbe essere mantenuta a 0,07 m/s ± 0.01. - Rilasciare la lampreda di mare e registrare l'importo cumulativo del tempo che la lampreda passa in quella sperimentale e canale di controllo ogni fiume contenente acqua per 10 min.
Nota: Se la lampreda di mare non riesce a inserire la sperimentale e di controllo canale per almeno 10 s durante questo periodo di 10 min, terminare il processo, come questa è un'indicazione di inattività o lato forte parzialità. - Applicare lo stimolo test (cioè, un feromone presunto alle 10-12 M disciolto in 50% metanolo/deionizzata) al canale sperimentale assegnato in modo casuale e il veicolo (50% metanolo/deionizzata) per il canale di controllo utilizzando peristaltico Pompe a tassi costanti di 200 mL/min per 5 min.
Nota: La concentrazione di soglia di rilevazione dello stimolo test come determinato con le registrazioni di electro-olfactogram deve essere utilizzata come la concentrazione iniziale per il test del comportamento. - Applicare lo stimolo di prova e il veicolo per altri 10 min e registrare l'importo cumulativo di tempo che trascorre la lampreda in sperimentale e canale di controllo.
- Sciacquare il labirinto con acqua per 10 minuti prima dell'inizio della prova successiva. Ripetere i passaggi 4.1-4.4 con almeno 7 lamprede se stimolo prova sufficiente è disponibile.
- Calcolare un indice di preferenza22 per ogni prova e valutare il significato utilizzando un test di Wilcoxon firmare-allinea.
Nota: I risultati di indice in un singolo numero che può essere positivo o negativo. Un valore positivo dell'indice di preferenza indica attrazione, mentre un valore negativo dell'indice di repulsione di indicazioni di preferenza. Se l'indice di preferenza è significativamente diverso da zero, la frazione è considerata attiva.
Qui,
Bc = il tempo trascorso dalla lampreda di prova nel canale di controllo prima dell'applicazione di odorizzante,
Be = il tempo trascorso nel canale sperimentale prima dell'applicazione di odorizzante,
Unac = il tempo trascorso nel canale di controllo dopo l'applicazione di odorizzante, e
Ae = il tempo trascorso nel canale sperimentale dopo l'applicazione di odorizzante.
5. cromatografica isolamento dei composti puri da frazioni attive
- Ripetere i passaggi 2.1-2.4 con le piscine di frazione che inducono risposte olfattive (passaggio 3) e suscitare le risposte comportamentali (passaggio 4).
- Purificare ulteriormente le frazioni attive in composti con cromatografia di esclusione dimensionale utilizzando una colonna del Sephadex LH-20.
- Preparare il campione in 0,5 mL nella fase iniziale mobile [CHCl3- MeOH (1:1) o MeOH 100%], caricare nella corrispondente colonna un CHCl3- MeOH (1:1) e quindi una MeOH (100%) colonna ed eluire loro per produrre i composti.
6. delucidazione di un composto puro con spettrometria di massa (MS) e risonanza magnetica nucleare (NMR)
- Sciogliere e portare il composto purificato nella fase mobile iniziale (solitamente, metanolo e acqua, 1:1, v: v) della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) per formare un 10 μL di soluzione di circa 1 μg/mL.
- Trasferire la soluzione campione in HPLC fiale e impostarle nell'autocampionatore HPLC. Iniettare il campione (10 μL) la spettrometria totale di ionizzazione electrospray (ESIMS) e registrare gli spettri di spettrometria di massa (HRESIMS) di ionizzazione electrospray ad alta risoluzione utilizzando uno spettrometro di massa di cromatografia23.
- Prevedere la formula molecolare secondo il database del software di uno spettrometro di massa (Vedi Tabella materiali)24.
- Aprire il cromatogramma del campione iniettato e ottenere il relativo spettro di massa selezionando il picco cromatografico.
- La massa misurata al valore dello ione (m/z) (4 decimali) nella composizione elementare sotto il modulo di strumento di input. Impostare il parametro di tolleranza su PPM < 5.
- Regolare i parametri di simbolo per adattare la composizione di elementi della molecola misurata. Il software produce una predizione della formula molecolare sulla base dell'analisi di massa singola.
- Selezionare i solventi deuterati (600 μL, CH3OH -d4 o DMSO -d6) secondo il protocollo25 per sciogliere i campioni.
- Sciogliere completamente il campione nei solventi deuterati selezionati per formare una soluzione con una concentrazione che varia approssimativamente da 0,1 a 10 mg/mL. Trasferire la soluzione campione in una provetta NMR per registrare la 1D (1H, 13C) e 2D NMR [spettroscopia di correlazione di1H -1H (accogliente), eteronucleari single coerenza quantistica (HSQC), eteronucleari correlazione multipla di legame (HMBC)] spettri su un 900 MHz NMR spettrometro26.
- Collocare la provetta NMR con il campione all'interno della turbina di spinner. Utilizzare il calibro di profondità per garantire che l'altezza del campione è al centro della finestra di misurazione. Aprire il software di NMR (Vedi Tabella materiali) e fare clic sul pulsante " Lift " per modificare il campione nel magnete.
Nota: Tenere una mano sopra la parte superiore del magnete per sentire il gas proveniente dalla parte superiore del magnete. Allo stesso tempo, un suono di fischio dovrebbe essere udibile. - Delicatamente il campione viene posto sul cuscino d'aria sopra il magnete e premere il pulsante di sollevare nuovamente a scendere il campione nel magnete NMR.
Nota: Ascoltare un rumore di "click" indicare che l'esempio è nella giusta posizione. - Creare un nuovo dataset e caricare i parametri di default raccomandati dallo strumento NMR (Vedi Tabella materiali).
- Tipo "lock" per richiamare la procedura di chiusura automatica e selezionare il solvente alla pagina richiesta.
- Per la messa a punto, nel Pannello di manipolare, regolate il pulsante nel modello di sblocco , regolare il cursore sul pannello di manipolare e bloccare di nuovo il magnete.
- Il prompt pagina Atma , regolare il parametro nel pannello manipola per la procedura di sintonizzazione, che può richiedere alcuni minuti. Attendere che l'accordatura è completato per procedere.
- Avviare la routine di spessoramento automatica digitando "topshim" nel prompt. Attendere che l'utilizzo di shim è completato per procedere.
- Tipo "rga" impostare automatico ricezione guadagno regolazioni, quindi tipo "d1" per impostare il ritardo tra impulsi, quindi tipo "zg" per avviare l'acquisizione e attendere il completamento dell'acquisizione.
- Digitare "ef" o "efp" per elaborare i dati e quindi digitare "apk" per fasatura automatica. Elaborare i dati sul software di elaborazione di NMR.
- Delucidare la struttura chimica di un'interpretazione dell'analisi dati NMR.
- Contare i segnali di carbonio nello spettro NMR C 13. Selezionare la formula molecolare abbinata dal risultato prevedibile in spettrometria di massa ad alta risoluzione (HR-MS).
- Integrare i segnali di protone nello spettro 1H NMR 1e assegnare la connettività del carbonio e protone-based sui segnali nello spettro HSQC.
- Assegnare la connettività dello scheletro di carbonio sulla base delle correlazioni in 1H -1H COSY e spettro HMBC.
- Assegnare provvisoriamente la struttura chimica basata sulla struttura razionale27. Ricerca la struttura provvisoria nei database struttura chimica. Confrontare la struttura provvisoria con gli analoghi nei riferimenti.
- Assegnare la relativa configurazione con lo spettro di spettroscopia di effetto nucleare Overhauser (NOESY).
Nota: Poiché la proprietà di identità di enantiomeri visualizzati su spettrometria e metodi spettroscopici sono identiche, la configurazione assoluta di alcuni composti, specialmente quelli con 2'-alcol e 2'-NH2, deve essere determinata con un reazione di derivatizzazione. Dopo la reazione di derivatizzazione, le differenze indicate su spettri facilitano l'assegnazione inequivocabile delle configurazioni assolute della maggior parte dei composti28.
7. EOG e analisi biologica per confermare composti puri sono odorosi e comportamentale attivo
- Ripetere i passaggi da 3.1-3.5.
- Per la curva di concentrazione-risposta, preparare 10 mL di 10 volte diluizioni dei composti puri da 10-6 M - 10-13 M di una soluzione di riserva di feromone 10-3 M in 50% metanolo/acqua conservato a-20 ° C sulla base del peso molecolare determinato in passo 6.2. Mettere i flaconi di vetro con le soluzioni di lavoro di L-arginina e i composti puri in un bagno di acqua a ricircolo per consentire alla temperatura di equilibrare a 8 ° C.
- Ripetere i passaggi da 3,7-3.18.
- Ripetere i passaggi da 4.1-4.2.
- Applicare il composto puro alla concentrazione di soglia di rilevamento EOG al canale sperimentale assegnato in modo casuale e il veicolo (50% metanolo/deionizzata) per il canale di controllo utilizzando una pompa peristaltica a tassi costanti di 200 mL/min per 5 min.
- Ripetere i passaggi da 4.4-4.6.
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Representative Results
Nella Figura 1è riportato un diagramma che riassume i passaggi descritti nel protocollo del frazionamento analisi biologica-guida. Il protocollo prevede passaggi per isolare e caratterizzare la struttura, la potenza olfattiva e l'attività comportamentale di 5 Petromyzon marinus putativi feromoni (Figura 2). Utilizzando la spettrometria di massa e dati NMR (Figura 3 e Figura 4), le strutture di petromyzene A-B e petromyzone A-C sono state chiarite dall'acqua condizionata con lamprede di mare maschio maturo22,29.
I nostri dati rappresentativi dalle registrazioni EOG (Figura 5) dimostrano che petromyzene A-B e petromyzone A-C erano tutti i potenti odoranti che ha stimolato l'epitelio olfattivo adulto lampreda di mare e aveva basse soglie di rilevazione (Figura 6) . Di particolare nota, le registrazioni di EOG richiedono un corretto posizionamento dell'elettrodo di registrazione sulla superficie dell'epitelio olfattivo rispetto al tubo di consegna di stimolo per provocare un buon rapporto segnale-rumore per affidabile odorant registrazioni di risposta ( Figura 5B). Se questo passaggio critico non è seguito, sarà difficile discernere il segnale indotto da odorant tra il rumore alto. La deflessione verso il basso della traccia EOG dopo l'esposizione di odorizzante è un potenziale negativo. Un buon segnale EOG dovrebbe mostrare un'amministrazione odorant conseguente a una risposta rapida e nitida, seguita da un recupero alla linea di base. Le risposte olfattive per i presunti feromoni sono state normalizzate anche le risposte di 10-5 M L-arginina, un controllo positivo odorant nella lampreda di mare, testata in tutto l'esperimento per garantire l'integrità delle registrazioni è stata mantenuta.
In analisi del comportamento della due-scelta labirinto (figura 7A), ovulate femminile mare lamprede sono stati attratte A di petromyzone, A petromyzene e il petromyzene B e respinto da petromyzone C. Ovulated femmine è sembrate essere respinti da petromyzone B; Tuttavia, la risposta comportamentale non era significativa (figura 7B). Una più grande dimensione del campione non è stato possibile a causa della quantità limitata di petromyzone B. Per valutare correttamente la risposta comportamentale di un odorant, è fondamentale per registrare la differenza di trattamento preparatorio per il controllo e il canale sperimentale di ogni lampreda.
Figura 1: un diagramma di flusso di frazionamento analisi biologica-Guida dei feromoni. Questa figura è adattata da figura 2 in Li, Buchinger e Li30. Le caselle indicano il prodotto chimico risultante dalla tecnica indicata nell'ovale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: le strutture chimiche di petromyzene A-B e petromyzone A-C. Questa figura è stata modificata da figure 1 a Li et al. 22 , 29. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Spettri NMR di figura 3:1. Spettri RMN 1D di petromyzene r.: (A), lo spettro di 1H NMR (900 MHz) e lo spettro (B) 13C NMR (225 MHz). Questa figura è dalle informazioni di supporto in Li et al. 29. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: 2D spettri RMN. 2D spettri RMN di petromyzene r.: (A), lo spettro HSQC, (B), 1H -1H COSY spettro, (C) il HMBC spettro e spettro (D) il NOESY. Questa figura è dalle informazioni di supporto in Li et al. 29. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Electro-olfactogram (EOG) registrazione preparazione e rappresentante traccia registrazioni. (A) si tratta di una preparazione di EOG mostrando l'epitelio olfattivo Petromyzon marinus esposta con l'elettrodo di registrazione, l'elettrodo di riferimento, il tubo di mandata di odorizzante e l'acqua ossigenata con l'anestetico. (B), questo pannello mostra le registrazioni rappresentative traccia dimostrando buona (in alto) o rapporti segnale-rumore di male (in basso). Un buon rapporto segnale-rumore è necessario per le registrazioni affidabili odorant risposte. La deflessione verso il basso della traccia EOG dopo l'esposizione di odorizzante è un potenziale negativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: una trama semi-logaritmica delle curve concentrazione-risposta electro-olfactogram (EOG). Petromyzone A-C e petromyzene A e B erano stimolatori dell'epitelio olfattivo adulto lampreda di mare e aveva soglie di rilevamento basso. I dati sono presentati come i media normalizzata EOG ampiezza ± s.e.m. Le dimensioni del campione erano come segue: petromyzone A, petromyzene A e petromyzene B (n = 7) e petromyzone B e petromyzone C (n = 5). L'inserto è una visualizzazione espansa delle risposte EOG risultati risposta concentrazioni soglia. Questa figura è stata modificata dalla figura 3 in Li et al. 22 e figura 4 in Li et al. 29. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: un disegno schematico e i risultati del labirinto due-scelta utilizzato per valutare le risposte comportamentali di ovulato femminile mare lamprede al odoranti. (A), la freccia rappresenta la direzione del flusso dell'acqua (0.07 m s-1 ± 0,01). I cerchi rappresentano i punti di somministrazione di odorizzante. Le piccole linee tratteggiate rappresentano maglia fine utilizzata per limitare il movimento della lampreda di mare fino ai confini del labirinto. Le grandi linee tratteggiate rappresentano il flusso schede utilizzati per ridurre la turbolenza dell'acqua. Rettangolo grigio rappresenta la gabbia di rilascio. La barra della scala = 1 m. Questa figura è dalla figura S1 in Li et al. 29. (B) le femmine erano attratte da petromyzone A, petromyzene A e petromyzene B. Il tempo della lampreda impiegato in ciascun canale del labirinto prima e dopo l'esposizione di odorizzante (10-12 M) è stato utilizzato per calcolare un indice di preferenza per valutare la risposta comportamentale per l'odorizzante. Un valore positivo dell'indice di preferenza indica attrazione. La dimensione del campione, n, è segnalata all'esterno delle parentesi, e il numero tra parentesi indica il numero di femmine in studi clinici che trascorso più tempo nel canale sperimentale rispetto al controllo. I dati sono presentati come media ± s.e.m. (* p < 0,05; Wilcoxon firmare-allinea la prova) per confrontare la preferenza del comportamento prima e dopo l'esposizione di odorizzante. Questa figura è stata modificata da figura 4 in Li et al. 22 e figura 5 in Li et al. 29. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 1: una fotografia del labirinto. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Pesci vivono in un mondo chimico completo di composti ancora da identificare. Frazionamento analisi biologica-guida ha dimostrato essenziale per identificare e caratterizzare molecole bioattive che mediano molte interazioni chimiche, come quelle osservate in salmone masu31, elefanti asiatici32e lamprede di mare33, 34,35. Frazionamento analisi biologica-guida è un approccio efficace alla accuratamente traccia e pinpoint che i composti bioattivi partire estrarre il composto attivo purificato. Utilizzando questo approccio, i composti bioattivi identificati è in grado di rivelare un nuovo composto con un unico scheletro chimico che è improbabile da essere predetto dalle vie biosintetiche note.
Registrazioni di EOG sono condotte per determinare quali frazioni o composti elicitare risposte olfattive. Diverse considerazioni tecniche sono di importanza fondamentale per misurare con precisione le risposte olfattive per i presunti feromoni con registrazioni di EOG. In primo luogo, secondo le procedure di comitato uso approvato e istituzionali Animal Care, il pesce deve essere profondamente anestetizzato con estere etilico dell'acido 3-aminobenzoic (MS222) e immobilizzato con un'iniezione intramuscolare di gallamine triethiodide. L'elettrodo di registrazione in grado di rilevare qualsiasi movimento delle branchie e battito cardiaco a causa di un'insufficiente immobilizzazione, che può essere una fonte di rumore elettrico. In secondo luogo, l'epitelio olfattivo deve essere immediatamente esposto all'acqua filtrata carbone dopo la dissezione per evitare il disseccamento. Regolare la posizione dell'elettrodo registrazione e riferimento con i micromanipolatori, la messa a terra elettrica e il tubo di mandata odorant può aiutare a massimizzare la risposta per il controllo positivo odorant riducendo al minimo la risposta al controllo vuoto ( acqua filtrata). In terzo luogo, dopo aver individuato una posizione di registrazione sensibili nell'epitelio olfattivo, è importante per registrare da una posizione simile sulle lamelle per minimizzare la variazione. Per registrare costantemente da una simile posizione, tenere il serbatoio e il supporto in plastica a forma di V che tiene i pesci, il microscopio, il tubo di mandata di odorizzante e i micromanipolatori nella stessa posizione. Il tubo anestetico deve rimanere nella cavità buccale del pesce per tutta la durata dell'esperimento per garantire che rimane anestetizzato. Tuttavia, il posizionamento all'interno della cavità buccale e la portata dell'anestetico può essere modificato se l'elettrodo di registrazione è di rilevare il movimento dell'acqua risultante in una linea di base irregolare del segnale elettrico.
Il design dell'analisi comportamentale dovrebbe essere adattato per l'ecologia del comportamento del soggetto e la domanda di ricerca di interesse. Analisi comportamentale due-scelta labirinto sono usate per determinare se uno qualsiasi delle frazioni odorose sono anche relativamente al comportamento attivo. Poiché sono disponibili in quantità minime spesso solo composti purificati, il labirinto è una benefica analisi biologica del comportamento rispetto al flusso a causa di uno scarico inferiore. Eravamo interessati a valutare la preferenza vicino a fonte di feromoni sessuali presunte rilasciato da maschi maturi preveduti femminile maturi compagni nelle immediate vicinanze di attrarre e mantenere loro su un nido per la deposizione delle uova. L'analisi comportamentale è stato progettato per replicare le condizioni naturali di una femmina ovulated scegliendo tra odoranti di maschi maturi. Di conseguenza, fosse rilevante testare le femmine ovulate come oggetto di prova nei nostri esperimenti di comportamento. Tuttavia, a seconda della odorant testati, altri soggetti di prova (cioè, la fase di vita diversa o maschi) possono essere più appropriati. Variazioni delle dimensioni del labirinto due-scelta possono essere necessarie a seconda delle dimensioni dell'oggetto di prova e lo spazio attivo previsto del feromone (cioè, nei pressi di origine rispetto a lunga distanza)36. Allo stesso modo, le risposte comportamentali sono spesso dipendente dalla concentrazione. Se una risposta comportamentale non è osservata quando il feromone presunto viene applicato alla concentrazione di soglia di rilevamento determinata con EOG, la concentrazione del feromone deve essere regolata. Tuttavia, dovrebbe essere notato che anche se un composto è un potente odorant, può non necessariamente indurre una significativa preferenza comportamentale. In definitiva, le risposte comportamentali osservate nel labirinto devono essere convalidate in un campo con il composto sintetico per confermare la funzione del feromone presunto.
Uno dei principali limiti di frazionamento analisi biologica-guida è il test sequenziale di singole frazioni o composti in un'analisi biologica (EOG o comportamento). Il lavoro precedente ha indicato insetto feromoni sessuali sono in genere miscele di più componenti specifici rapporti37 che funzionano in modo indipendente come componenti38 o sinergicamente come unisce39 per indurre le risposte appropriate in conspecifici. Di conseguenza, composti che agiscono solo quando sono presenti in miscele specifiche possono essere trascurati con frazionamento analisi biologica-guida perché richiedono combinatoria test per confermare la bioattività. Altri limiti di frazionamento analisi biologica-guida includono: 1) una grande quantità di materiale di partenza è necessaria avere una quantità sufficiente per l'analisi strutturale, EOG e le analisi comportamentale; 2) il processo è molto tempo a causa del processo di purificazione iterativo; e 3) minuscoli o instabile composti sono improbabili da essere rilevato. In futuro, superamento di alcune limitazioni tecniche di frazionamento analisi biologica-guida può richiedere un approccio ibridato di frazionamento analisi biologica-Guida e metabolomica. Utilizzando un approccio ibridato, feromone additivo o sinergico gli effetti sono più probabili essere discernere13 e instabile composti hanno maggiori probabilità di essere rilevato.
Il processo di frazionamento analisi biologica-Guida descritta è specificamente progettato per l'identificazione di feromoni lampreda di mare. Tuttavia, la comunicazione chimica è onnipresente nel Regno animale1 e questo processo può essere facilmente adattato per caratterizzare i feromoni in una vasta gamma di taxa. Caratterizzazione ed identificazione del feromone sono importanti poiché i feromoni possono essere applicati per modulare le risposte comportamentali derivanti nel controllo delle specie invasive o nel restauro di specie autoctone in pericolo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo l'US Geological Survey Hammond Bay stazione biologica per l'utilizzo delle loro strutture di ricerca e il personale del U.S. Fish e Wildlife Service e della pesca e degli oceani Canada per la fornitura di lamprede di mare. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dalla Commissione per la pesca dei grandi laghi a Weiming Li e Ke Li.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades - #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
References
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