Summary
Burada, ayırmak ve yapısını, koku kudret ve deniz lampreys, sözde feromon bileşiklerin davranışsal yanıt karakterize bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Bioassay-güdümlü ayırma Kılavuzu yalıtım ve bir etkin feromon bileşik tanımlaması için fizyolojik ve davranışsal biyoanalizler sonuçlarını kullanır yinelemeli bir yaklaşımdır. Bu yöntem başarılı alan nitelik özellikleri kimyasal sinyallerin Feromonlar hayvan türlerinin geniş bir alanda olarak bu işlev sonuçlandı. Deniz lampreys davranış ya da fizyolojik yanıt aracılık Feromonlar tespit etmek için koku alma üzerinde güveniyor. Biz bu bilgi balık biyoloji sözde Feromonlar işlevlerini yerine koymak ve Kılavuzu yalıtım ve etkin feromon bileşenleri tanımlaması için kullanın. Kromatografi ayıklamak, konsantre ve bileşikleri şartına sudan ayırmak için kullanılır. Elektro-olfactogram (EOG) kayıtları hangi kesirler koku yanıt-e doğru çıkarmak belirlemek için yapılmaktadır. İki seçenekli labirent davranış deneyleri daha sonra herhangi bir kokulu kesirler de davranışsal etkindir ve neden bir tercih belirlemek için kullanılır. Spektrometrik ve spektroskopik Yöntemler moleküler ağırlık ve yapısı aydınlatma ile yardımcı olacak yapısal bilgiler sağlar. Bioactivity saf bileşiklerin EOG ve davranışsal deneyleri ile doğrulanır. Labirent içinde gözlenen davranış yanıt sonuçta kendi işlevleriyle bir doğal akışı ayarı onaylamak için bir alan ortamda doğrulanması. Bu biyoanalizler 1) ayırma işlemi yol ve 2) onaylamak için ikili bir rol oynar ve daha fazla ayrılmış bileşenleri bioactivity tanımlamak. Burada, bioassay güdümlü ayırma yaklaşım yarar reaksiyonların bir deniz taşemen feromon kimlik temsilcisi sonuçları raporu. Deniz taşemen Feromonlar tanımlaması invaziv deniz taşemen Laurentian göller denetlemek için kabul seçenekler arasında bir modülasyon feromon iletişim sistemi olduğu için özellikle önemlidir. Bu yöntemi özellikleri geniş bir dizi iletişim kimyasal karakterize ve su bazlı kimyasal ekoloji ışık için kolayca adapte edilebilir.
Introduction
Feromonlar gıda kaynakları bulma, yırtıcı algılama ve conspecifics1sosyal etkileşimlerin arabuluculuk yardım bireyler tarafından yayımlanan belirli kimyasal sinyaller. Feromon iletişim böceklerde de okudu2olmuştur; Ancak, kimyasal kimlik ve suda yaşayan omurgalı Feromonlar biyolojik fonksiyonu olarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir değil. Kimlik bilgisine ve serbest Feromonlar fonksiyonu tehdit türlerin3,4 veya kontrol haşere türü5,6kurtarma kolaylaştırmak için uygulanır. Bu tekniklerin uygulama yalıtım ve karakterizasyonu biyoaktif feromon bileşenleri gerektirir.
Feromon kimlik doğal ürün Kimya bir dalıdır. Feromon araştırma sürüyor kısmen feromon moleküller kendilerini yapısı nedeniyle sınırlı olmuştur. Feromonlar çoğu kez kararsız ve küçük miktarlarda yılında yayımlanan ve uçucu7,8 , suda çözünen bileşikler9dakika miktarda algılamak için sadece birkaç örnekleme teknikleri adlı biri yok. Feromonlar tanımlamak için bir yaklaşım bilinen bileşikler, 2) metabolomics ve 3) bioassay-güdümlü ayırma hedeflenen 1) bir tarama içerir. A hedeflenen perde bilinen bileşikler ticari olarak mevcut metabolik yan ürünleri Feromonlar çalışması için olan fizyolojik süreçlerin sınar. Araştırmacılar sadece bilinir ve kullanılabilir bileşenler test edebilirsiniz çünkü bu yaklaşım sınırlayıcı olduğunu. Ancak, Japon balığı cinsiyet hormonları başarılı tanımlaması bu işlevi Feromonlar10,11,12olarak sonuçlandı. Metabolomics biyolojik sistem13içinde potansiyel küçük molekül metabolik ürünler ayıran ikinci bir feromon kimlik bir yaklaşımdır. İki grubun (yani, bir etkin ve etkin olmayan bir özü) metabolik profilleri karşılaştırılması potansiyel bir metabolik profili kimliği sağlar hangi metaboliti saf üzerinden, yapısı aydınlatılmamıştır ve bioactivity teyit edilen14yaşında. Özel karışımlar karmaşık formülasyonları katkı maddesi ya da sinerjik etkileri metabolitleri birlikte yerine kesirler13bir dizi olarak kabul edilir çünkü metabolomics ile tespit edilebilir olasılığı daha yüksektir. Ancak, elde edilen verileri yeni yapıların aydınlatma kolaylaştırmak değil çünkü metabolomics uygulanması sentetik başvurular kullanılabilirliğine dayanır.
Bioassay-güdümlü ayırma yaklaşımdır iki alanı kapsayan bir entegre, yinelemeli: kimya ve biyoloji. Bu yaklaşım kılavuzu yalıtım ve bir etkin feromon bileşik tanımlaması için fizyolojik ve davranışsal biyoanalizler sonuçlarını kullanır. Ham bir özü bir kimyasal özelliği (yani, moleküler boyutu, polarite, vb) tarafından şeker ve elektro-olfactogram (EOG) kayýtlarý içeren ve/veya bir bioassay test edilmiştir. Biyoaktif bileşenler ayırma ve EOGs ve/veya biyoanalizler aşağıdaki adımları tekrar ederek dışarı ekranlı. Saf aktif bileşikler yapılarının moleküler ağırlık ve bahçedeki sentezlenmiş için bir şablon oluşturmak için yapısal bilgi sağlayan spektrometrik ve spektroskopik yöntemler tarafından aydınlatılmamıştır. Bioassay-güdümlü ayırma farklı metabolitleri ve potansiyel olarak Roman Feromonlar biyosentetik yolları öngörülen vermemektedirler benzersiz kimyasal iskeletler ile yol açabilir.
Burada, biz yalıtmak ve erkek deniz taşemen seks feromon bileşiklerin bioactivity karakterize için kullanılan bioassay güdümlü ayırma iletişim kuralı tanımlamak. Deniz taşemen (Petromyzon marinus) Bu balıklar ağır üç ayrı aşamadan oluşan anadromous onların yaşam öyküsü arabuluculuk kimyasal cues koku algılamayı dayandığından feromon iletişim eğitim için ideal bir omurgalı modelidir: Larvalar, çocuk ve yetişkin. Deniz taşemen larvaları tatlı su akışları tortu yuva, köklü bir metamorfoz geçmesi ve bir göl veya nerede büyük konak balık parasitize okyanus geçirmek gençlere dönüştürün. Ana bilgisayar balıktan ayırma sonra yetişkin yumurtlama akarsu geri akışı yerleşik larva15,16,17,18tarafından,19 serbest göçmen Feromonlar rehberliğinde göç . Olgun erkek yumurtlamabölgelerine dönmek çıkmak, arkadaşları çekmek, yaklaşık bir hafta için zaman zaman spawn ve sonra15,20ölmek çok bileşenli seks feromon serbest. Deniz taşemen Feromonlar tanımlaması önemli çünkü bir modülasyon feromon iletişim sisteminin Laurentian büyük göller21invaziv deniz lampreys kontrol etmek için kabul seçenekler arasında yer alıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 ve 02/17-031-00) tarafından onaylanmış olması.
1. toplama ve çıkarma deniz taşemen su şartına
- Yer cinsel olgun erkek deniz lampreys (15-30 hayvanlar) 250 L 16-18 ° C'de tutulan gazlı göl Huron su ile birlikte bir su tankında
- Her gece boyunca erkek şartına su Haziran ile Temmuz için toplamak.
Not: deniz lampreys doğal yumurtlama sonra ölür. Bir balık onun hayatında bu noktaya yaklaşıyor olan taze ve olgun bir erkek yerine. - Katı faz çıkarma tarafından şartına su ayıklayın.
- Reçine metanol 4 h için bir sütuna yüklemeden önce ıslatın. Reçine sütuna yük, o zaman 10 L su sütunu boyunca organik çözücü ortadan kaldırmak için pompa.
- Klimalı su tankı balık üzerinden pompalama sistemi için sütunun üstünde tutan geçmek. Bir yatak dört bir dizide bulunan Orta kutup polimerik iyon değiştirme reçine (e.g., Amberlite XAD-7 HP reçine), 2 kg su geçer 2.5 L kapasiteli cam sütunlar. Yükleme hızı 400 ve 600 mL/6 dk. metabolitleri 10 litre metanol ile hemen aseton 5 L tarafından takip Elute arasında korumak.
Dikkat: Bu adımı metanol ve aseton kullanır. İkisi de yanıcı ve zehirli.
Not: Havuza alınan kalan-80 ° daha fazla işlenen kadar C saklanır.
- Sütun (yaklaşık 10 L) su ile yıkayarak zenginleştirme 1 hafta sonra yeniden etkinleştirin.
- Organik çözücü (metanol ve su karışımı) kaldırmak ve düşük basınç (altında 300 mbar) 40 ° C'de altında 5 h için çevirme buharlaşma tarafından özü hasat Su kalıntı dondurma kuru kadar 48 h-20 ° C'de lyophilization kurutma makinesi tarafından konsantre ol.
2. izolasyon-in kesir havuzları kromatografi ile
- Silika jel (230-400 mesh) ilk mobil faz 30 dk. Transfer için jel bir cam sütun için çözücü (süspansiyon) ile ıslatın. Mobil faz üzerinden gitmek izin vermek için sütun vanayı aç. Silika jel çökelti ve silika jel yatak oluşturmak olanak sağlar.
- Özler silika jel (70-230 mesh) ile iyice karıştırın ve silika jel yatağa sıvı kromatografi sütuna yükleyin. Onları bir gradyan % 95 CHCl3 (kloroform) ile elute / MeOH (metanol) % 100 MeOH, toplam hacim içinde 2.5 L. Bireysel şişeleri (her 10 ml) eluent toplamak.
Dikkat: Bu adımda kullanılan kloroform zehirli bir reaktif olduğunu. - Eluents 20 kesirler göre ince tabaka Kromatografi (TLC) analiz havuzu kılavuz.
- TLC deney öncesi kaplı silika jel tabaklarda örnek başlangıç çizgisine uygulanması ve gelişmekte olan çözücüler (polarizasyonu CHCl3 oranında metanol için % 100-0 Seç) kapalı bir cam plaka başlangıç çizgisine çeker yerine getirilir Tank.
- Çözücü 0,3 arasında değişen her TLC noktalar saklama faktörü (Rf) yapmak için geliştirme oranı seçin - 0.8.
- Satır sonu gelişmekte olan çözücü ulaştıktan sonra plaka havuzdan al ve solvent buharlaşır için 10 dk bekle.
- Belgili tanımlık yer ilk UV 254 nm ve sonra leke ışığı altında görselleştirmek onları % 5 anisaldehyde (20 μL) bir kromatografi püskürtme tarafından bir asidik metanol çözümü ile püskürtme ve onları 3 dk 85 ° C'de Isıtma onları.
Not: TLC plaka üzerinde renkli noktalar kesir ana bileşeni belirtir. - Eluent 20 kesirler spot renk ve ana bileşeni Rf benzerlik göre için birleştirin.
- Yaklaşık 30 dakika için 40 ° C'de düşük basınç (çözücüler mülkiyeti göre 300 mbar) altında çevirme buharlaşma tarafından kesir bir kalıntı için konsantre.
3. Elektro-olfactogram (EOG) kayıtları kokulu kesirler/bileşenleri tanımlamak için
- Borosilikat cam kılcal çekin (dış çap: 1.5 mm; iç çap: 0,86 mm; uzunluğu: 100 mm) bir micropipette ile çektirme ısıtıcı düzeyi ayarlamak için 65.
- Puan edinildi ve cut bir cam elmas uçlu kesici ile kılcal ucundaki açma ve erimiş %0,4 agar % 0,9 serum fizyolojik ile doldurun. Kılcal ucu açılışında çapı yaklaşık 10 µm olmalıdır.
- Adımları 3.1-3.2 ve katı hal elektrotlar sahipleri çekti kapiller elektrotlar ön fabrikasyon 3 M KCl bir micropipette kullanarak ile Ag/AgCl granül (bkz: Malzemeler tablo) ile dolgu.
Not: herhangi bir hava kabarcıkları kılcal veya Elektrot tutucu çıkarmak. - Çekti elektrot elektrot sahipleri yerleştirin.
- 10-5 M 100 mL hazırlamak L-arginin kömür filtre su 10-2 M L-arginin hisse senedi çözeltilerine volumetric flask deiyonize su (4 ° C'de depolanan) üzerinden. 10-5 M 20 mL transfer L-arginin bir cam şişe için.
- Konsantrasyon-yanıt eğrisi için kesir havuzlarının adım 2.3 cam şişe içinde 10 kat dilutions 10 mL hazırlayın. Her gün önce deneyler taze dilutions hazırlamak ve onları bir gün içinde kullanın. Sıcaklığı 8 ° C'ye equilibrate izin vermek için dolaşım bir su banyosu çalışma çözümleri, L-arginin ve kesir havuzu dilutions cam şişe koymak
- 3-aminobenzoic asit etil ester (MS222; 100 mg/L) ile taşemen anestezi ve gallamine triethiodide (3 mg/kg vücut ağırlığı, % 0,9 serum) bir kas içi enjeksiyon ile steril bir şırınga hareketsiz.
Not: Anestezi yeterli derinliğe no gill hareket, dik bir duruş korumak için bir yetersizlik ve hiçbir emme sözlü onun yuvarlak yüzey istimal belgili tanımlık tank kenarlarına gözlemci tarafından belirlenir. Herhangi bir mikrobiyal kirlenme öncesi ve ameliyat sırasında en aza indirmek için steril eldiven giymek ve % 70 etanol (v: v) diseksiyon araçlarında en az 10 dk kullanmadan önce deiyonize su ıslatın. - V şeklindeki standı imzalat taşemen yönlendirmek ve kurutulma önlemek için ıslak kağıt havluyla sarın.
Not: solungaç açıklıklar engel değil. - Gazlı su 50 mg/L MS222 bukkal kavite içine içeren recirculating bir tüp takın, akış hızı ayarlamak ve gill açıklıklar sürekli solungaçları sulamak için su yolu ile çıkarken sağlamak.
- Steril neşter ve forseps kullanın [1,25 X büyütme, stereoskopik mikroskop altında ( Tablo malzemelerigörmek)] koku epitel ortaya çıkarmak için koku kapsül yüzeyi cilt 5 mm2 bölümünü kaldırmak için.
- Propil teslim boru filtrelenmiş su ile yıkayın ve bir micromanipulator üzerinde sıva üstü Vana bağlayın. Propil teslim kılcal tüp filtrelenmiş su kuruma odorants yönetirken değil önlemek için koku epitel sunmak için micromanipulator kullanarak koku epitel kavite içine koyun.
- Kayıt ve başvuru elektrotlar micromanipulators üzerinde bağlayın. Referans elektrot naris yakınındaki dış deri üzerine indir. Stereoskopik mikroskop (1,25 X), daha düşük koku epitel yüzeyi çok az dokunmak kayıt elektrot kullanarak.
- Propil teslim tüp alımını filtre arka plan su 10-5 M L-arginin çözüm için transfer.
- Bilgisayar, amplifikatör (DC modunda), filtre ve çizim tablası açınız. Vana sürücü yazılımını kullanarak program propil 4 bir s tek darbe T 4 olarak ayarlamak T1, kutusunu işaretleyerek yönetmek için bu yordamı s ve T2 kutunun işaretlenmesi.
- Veri toplama yazılımı (bakınız Tablo malzemeler), ayarla toplama modu için yüksek hızlı bir osiloskop, oyun simgesini tıklatın ve propil darbe tetiklemek için Vana sürücü Başlat ' ı tıklatın.
Not: Veri toplama yazılımı otomatik olarak fark EOG yanıt genlik 20 kaydeder s (3 önce 4 s s propil darbe ve 13 sırasında daha sonra s). Kayıt elektrot, referans elektrot veya L-arginin standart en fazla yanıt ve bir çok az yanıt-e doğru boş denetim (sinyal-gürültü oranı artırmak için propil teslim tüp konumlarını manevra için micromanipulator kullanın filtrelenmiş su). Zemin elektrotlar hareket ederken AC-DC amplifikatör anahtar GND için değiştirme'yi amplifikatör. - Boş kontrolü, L-arginin ve sonra adım 3.6'düşük 2 dk floş süzülmüş su ile yüksek konsantrasyonları uygulamalar arasında hazırlanan odorants kaydetmeye başlamak.
- Yanıt test edilecek tüm odorants için kayıt sonra amplifikatör zemin ve dikkatle elektrotlar ve propil teslim kılcal tüp geri çek. Onaylanmış kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) yöntemleri, EOG deney sona ermesi, takip ötenazi ile MS222 aşırı dozda imzalat taşemen (1 g/L).
Not: başarılı ötenazi gill hareketi ve kalp atışı en az 5 min beyin pithing tarafından takip için eksikliği işaret ederek doğrulayın. - Analiz ve analiz yazılımı kullanarak verileri çizmek. Yanıt-e doğru boş su kontrolü büyük temin kokulu kesirler tanımlamak için odorants22 algılama eşiği belirlemek. Boş su kontrolü farklı konsantrasyon bağımlı koku yanıt temin kesir havuzları sonra bir davranış tahlil (adım 4) test edilir.
4. iki seçim labirent davranışsal aktif kesirler/bileşikler tanımlamak için davranış Bioassay
- Cinsel Olgun kadın deniz taşemen labirent yayın kafeste alışmana ( ek Şekil 1bakınız) için 5 dk. labirent içinde nehir su akış hızı korumak
Not: Labirent vernikli deniz sınıf ahşap ve önlemler 6.5 m uzunluğunda ve 1, 2 m genişliğinde bir bölücü 2.7 m uzunluğunda ters yönde sonunda iki kanal içine labirent ayırmak için ölçme ile inşa edilmiştir. Su içine labirent geçici olarak yönlendirilir. Su derinliği 0,19 m., saklanması gereken ve hız 0,07 m/s ± 0,01 muhafaza edilmelidir. - Deniz taşemen yayın ve taşemen deneysel geçirdiği zaman ve denetim kanalı içeren her nehir su 10 dakikadır kümülatif miktarı kaydetmek.
Not: deniz taşemen deneysel girin ve en az 10 için kanal denetlemek başarısız olursa bu 10 dk dönemde s son deneme bu hareketsizlik ya da güçlü yan önyargı bir göstergesi olarak. - Test uyarıcı uygulamak (yani, 10-12 M, sözde bir feromon % 50 metanol/deiyonize su içinde çözünmüş) rasgele atanan deneysel kanal ve kanal denetimi kullanarak araç (% 50 metanol/deiyonize su) peristaltik 5 min için pompalar 200 mL/dk sabit bir fiyatla.
Not: Electro-olfactogram kayıtları ile belirlenen test uyaran algılama eşik konsantrasyonu davranış testi için başlangıç konsantrasyonu kullanılmalıdır. - Test uyarıcı ve aracın ek bir 10 min için geçerlidir ve taşemen geçirdiği zaman toplam miktarını Deneysel kayıt ve denetim kanalı.
- Labirent sonraki duruşma başlamadan önce 10 min için su ile yıkayın. Yeterli test uyarıcı kullanılabilir 4.1-4.4 en az 7 lampreys ile yineleyin.
- Bir dizin tercih22 her deneme için hesaplamak ve Wilcoxon imzaladı-rank testi kullanma önemini değerlendirmek.
Not: Dizin sonuçlarda olumlu veya olumsuz olabilir tek bir numara. Oysa cazibe, değeri tercih Dizin gösterir tercih göstergeler itme dizinin negatif bir değer. Tercih dizin sıfırdan önemli ölçüde farklıysa, kesir etkin olarak kabul edilir.
Burada,
Bc = propil uygulamadan denetim kanalı test taşemen tarafından harcanan zaman
Be = propil uygulamadan deneysel kanaldaki harcanan zaman
C = propil uygulamadan sonra denetim kanalı harcanan zaman ve
E = propil uygulamadan sonra deneysel kanalda harcanan zaman.
5. kromatografik yalıtım etkin kesirler gelen saf bileşiklerin
- Tekrarlamak merdiven 2.1-2.4 koku yanıt (adım 3) neden kesir havuzlu ve davranışsal yanıt (adım 4) temin.
- Daha fazla etkin kesirler Sephadex LH-20 sütun kullanarak boyut-dışlama kromatografi ile bileşikler arındırmak.
- 0.5 mL örnek ilk mobil aşamasında hazırlamak [CHCl3- MeOH (1:1) veya MeOH % 100], bir CHCl3- MeOH (1:1) sütun ve sonra bir MeOH (% 100) sütun karşılık gelen sütuna yüklemek ve onları bileşikleri vermeye elute.
6. yapı aydınlatma kütle spektrometresi (MS) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) ile saf bir bileşik
- Dağıtılması ve saf bileşik ilk mobil aşamasında yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) yaklaşık 1 μg/ml 10 μL çözüm oluşturmak için (genellikle, metanol su, 1:1, v: v) oranında seyreltin.
- Örnek çözüm HPLC şişeleri için aktarmak ve HPLC Otomatik Örnekleyici koymak onları. Örnek (10 μL) electrospray iyonlaşma kütle spektrometresi (ESIMS) enjekte ve yüksek çözünürlüklü electrospray iyonlaşma kütle spektrometresi (HRESIMS) spectra kromatografi kütle spektrometre23kullanarak kaydedin.
- Moleküler formülü kütle spektrometre yazılım veritabanında göre tahmin (bakınız Tablo reçetesi)24.
- Eklenen örnek kromatografik açın ve kromatografik tepe seçerek onun kitle spektrum elde etme.
- Aracı modülü Elemental bileşiminde iyon (m/z) değeri (4 ondalık) ölçülen ayine girdi. PPM tolerance parametre ayarla < 5.
- Öğe oluşumu ölçülen molekülünün sığdırmak için sembol parametrelerini ayarlamak. Yazılım moleküler formülü tek kitle analizi dayalı bir tahmin oluşturur.
- Deuterated çözücüler (600 μL, CH3OH -d4 veya DMSO -d6) örnekleri çözülmeye Protokolü25 göre seçin.
- Yaklaşık 0,1 10 mg/mL aralığında değişen bir konsantrasyon ile bir çözüm oluşturmak için seçili deuterated çözücüler örnek tamamen erimesi. Örnek çözüm 1 D (1H, 13C) kaydetmek için bir NMR tüp içine aktarmak ve 2D NMR [1H -1H korelasyon spektroskopisi (rahat), heteronuclear tek kuantum tutarlılık (HSQC), heteronuclear çoklu bağ korelasyon (HMBC)] Spectra 900 MHz NMR spektrometresi26.
- NMR tüp spinner türbin içinde örnek ile yerleştirin. Derinlik mastarı örnek yükseklik ölçme penceresinin ortasında olduğundan emin olmak için kullanın. NMR yazılımını açın (bkz. Tablo reçetesi) ve mıknatıs örnek değiştirmek için Kaldır düğmesini tıklatın.
Not: magnet mıknatıs tepesinden gelen gaz hissetmek tepesinden bir elini tut. Aynı zamanda, bir ıslık sesi duyulabilir olmalıdır. - Yavaşça örnek hava yastığı mıknatıs üstüne yerleştirin ve NMR mıknatısına örnek tekrar inmeye Kaldır düğmesine basın.
Not: örnek doğru pozisyonda olduğunu belirtmek bir "tıklama" gürültü dinler. - Yeni bir veri kümesi oluşturun ve NMR enstrüman tarafından önerilen varsayılan parametreler yük ( Tablo malzemelerigörmek).
- Otomatik kilitleme yordamı çağırmak ve solvent istemi sayfasindan seçmek için "kilit" yazın.
- İnce ayar için Unlock modelindeki düğmesini Değiştir masası' nda, ayarlamak, imleci işlemek panelindeki ayarlama ve mıknatıs kilit daha.
- İstemi Atma sayfa üzerinde bir kaç dakika sürebilir ayarlama yordamı işlemek paneline parametresinde ayarlayın. Devam etmek için ayarlama tamamlanana kadar bekleyin.
- Otomatik shimming rutin-e sevketmek içinde "topshim" yazarak başlatın. Titremeden devam tamamlanana kadar bekleyin.
- Türü "rga otomatik ayarlamak için" kazanç ayarlar, daha sonra "türü d1 Bakliyat, sonra"türü zg satın başlatmak ve satın alma bitene kadar bekleyin"arasındaki gecikme ayarlamak için" alınıyor.
- "Ef" veya "verileri işlemek ve sonra yazın"apk otomatik phasing için"e.f.P'yi" yazın. NMR işleme yazılımı verilerin işlenmesi.
- Kimyasal yapısı NMR veri analizi bir yorumu tarafından aydınlatmak.
- 13C NMR spektrumu karbon sinyalleri saymak. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HR-MS) öngörülen sonucu eşleşen moleküler formülü seçin.
- 1H NMR spektrumu proton sinyalleri entegre ve belgili tanımlık connectivity, karbon ve proton-tabanlı HSQC spektrumda sinyalleri üzerinde atayın.
- Korelasyon 1H -1H rahat ve HMBC spektrum dayalı karbon iskeleti bağlantı atayın.
- Kesin olmayan biçimde kimyasal yapısı yapısı mantığı27tarihinde temel atayın. Geçici yapısı kimyasal yapısı veritabanlarında arama. Geçici yapısı başvurular analogları ile karşılaştırın.
- Nükleer Overhauser etkisi spektroskopisi (NOESY) spektrum göreli yapılandırmayla atayın.
Not: spektrometresi ve spektroskopik yöntemler üzerinde görüntülenen enantiomers kimlik özelliklerini aynı olduğundan, bazı bileşiklerin, özellikle de 2'-alkol ve 2'-NH2, mutlak yapılandırma ile belirlenecek sahip bir derivatization reaksiyon. Derivatization reaksiyon sonra spectra üzerinde belirtilen farklılıklar çoğu bileşikler28mutlak konfigürasyonlar kesin atama kolaylaştırmak.
7. EOG ve Bioassay saf bileşikler onaylamak için kokulu ve davranışsal aktif
- 3.1-3.5 adımları yineleyin.
- 10-6 M - 10-13 M 10-3 M feromon hisse senedi çözüm % 50 metanol/su içinde belirlenen moleküler ağırlık temel-20 ° C'de depolanan gelen saf bileşiklerin 10 kat dilutions 10 mL konsantrasyonu-yanıt eğrisi için hazırlamak Adım 6.2. Sıcaklığı 8 ° C'ye equilibrate izin vermek için dolaşım bir su banyosu çalışma çözümleri, L-arginin ve saf bileşikler ile cam şişe koymak
- 3.7-3.18 adımları yineleyin.
- 4.1-4.2 adımları yineleyin.
- EOG algılama eşik konsantrasyon saf kampta rasgele atanan deneysel kanal ve 5 min için 200 mL/dk Sabit fiyatla peristaltik pompa kullanarak Denetim kanalında ve aracın (% 50 metanol/deiyonize su) uygulanır.
- 4.4-4,6 adımları yineleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bioassay-güdümlü Ayırma Protokolü içinde açıklanan adımları özetleyen bir diyagram Şekil 1' de gösterilen. Protokol yalıtmak ve yapısı, koku kudret ve davranış etkinliği 5 sözde deniz taşemen Feromonlar (Şekil 2) ile karakterize için adımları içerir. Kütle spektrometrik ve NMR veri (Şekil 3 ve Şekil 4) kullanarak, petromyzene A-B ve petromyzone A-C yapılar olgun erkek deniz lampreys22,29ile şartına su aydınlatılmamıştır.
Bizim temsilcisi veri--dan EOG recordings (Şekil 5) petromyzene A-B ve petromyzone A-C yetişkin deniz taşemen koku epitel uyarılmış ve algılama (Şekil 6) düşük eşikleri olan tüm güçlü odorants olduğunu göstermek . Özellikle belirtmek gerekirse EOG kayıtları kayıt elektrot güvenilir propil için iyi bir sinyal / gürültü oranı neden için uyarıcı teslim tüp göre koku epitel yüzeyi uygun yerleşimini gerektiren yanıt kayıtları ( Şekil 5B). Değilse bu kritik adımı takip, yüksek gürültü arasında propil tarafından indüklenen sinyal ayırt etmek zor olacak. EOG izleme aşağı saptırma propil maruz kaldıktan sonra negatif bir potansiyeldir. İyi EOG sinyal bir kurtarma temel ardından hızlı ve keskin bir yanıt sonuçlanan bir propil yönetim göstermelidir. Sözde feromon koku yanıtlarını Ayrıca M L-arginin 10-5 yanıt-e doğru normalleştirilmiş, bir olumlu denetim propil kayıtları bütünlüğünü sağlamak için deney boyunca test deniz taşemen içinde devam edildi.
İki seçenekli labirent davranış deneyleri (Şekil 7A), ovulated kadın deniz lampreys petromyzone BIR, petromyzene ve petromyzene B için çekti ve C. Ovulated kadın petromyzone B püskürtüldü olduğu ortaya çıktı petromyzone üzerinden püskürtüldü; Ancak, davranışsal yanıt önemli (Şekil 7B) değildi. Daha büyük bir örnek boyutu petromyzone B. sınırlı miktar nedeniyle mümkün değildi Düzgün bir propil davranış yanıtı değerlendirmek için tedavi öncesi önyargı kontrolü ve her taşemen deneysel kanalı kaydetmek için önemlidir.
Şekil 1: akış çizelgesi feromon bioassay güdümlü ayırma. Bu rakam üzerinden Şekil 2'li, Buchinger ve Li adapte30. Kutuları oval belirtilen tekniği elde edilen kimyasal ürün gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: kimyasal yapıları petromyzene A-B ve petromyzone A-c Bu rakam rakamlar 1 Li vd.'den değiştirilir 22 , 29. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3:1 d NMR spectra. 1D NMR spectra petromyzene A: (A) 1H NMR (900 MHz) spektrum ve (B) 13C NMR (225 MHz) spektrum. Li ve ark. destekleyici bilgiler bu rakam olduğunu 29. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: 2D NMR spectra. Petromyzene A: (A) HSQC spektrum, 2D NMR spectra, (B) 1H -1H COSY spektrum, (C) HMBC spektrum ve (D) NOESY spektrum. Li ve ark. destekleyici bilgiler bu rakam olduğunu 29. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Electro-olfactogram hazırlık ve temsilcisi izleme kayıtları kayıt (EOG). (A)maruz kalan deniz taşemen koku epitel kayıt elektrot, referans elektrot, propil teslim tüp ve anestezi ile oksijenli su ile gösterilen bir EOG hazırlık bu. (B) Bu panel (üst) iyi veya kötü (alt) sinyal noise oranları gösteren temsilcisi izleme kayıtları gösterir. İyi bir sinyal / gürültü oranı güvenilir propil yanıt kayıtları için gereklidir. EOG izleme aşağı saptırma propil maruz kaldıktan sonra negatif bir potansiyeldir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: electro-olfactogram (EOG) konsantrasyon-yanıt eğrileri yarı logaritmik bir arsa. Petromyzone A-C ve petromyzene A ve B yetişkin deniz taşemen koku epitel uyarıcı ve düşük algılama eşikleri vardı. Verileri ortalama normalleştirilmiş EOG genlik ± S.E.M. sunulur Örneklerin boyutu aşağıdaki gibidir: petromyzone bir, petromyzene ve petromyzene B (n = 7) ve petromyzone B ve C petromyzone (n = 5). İlave yanıt eşik konsantrasyonları gösterilen EOG yanıtlarının genişletilmiş bir görünümdür. Şekil 3 Li vd. bu rakam değiştirilme tarihi 22 ve Şekil 4'te Li vd. 29. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: bir şematik ve ovulated kadın deniz lampreys davranışsal yanıt odorants için değerlendirmek için kullanılan iki seçmeli labirent sonuçlarını. (A) oku (0,07 m s-1 ± 0,01) su akış yönünü temsil eder. Daireler propil yönetim noktalarını temsil eder. Küçük kesik çizgiler ince mesh labirent sınırları için deniz taşemen hareketi kısıtlamak için kullanılan temsil eder. Büyük kesik çizgiler panoları su türbülans azaltmak için kullanılan akış temsil eder. Gri dikdörtgen yayın kafes temsil eder. Ölçek çubuğu 1 m =. Bu rakam S1 Li vd. bir rakamdır 29. (B) kadın petromyzone bir, petromyzene ve petromyzene B. için çekici Taşemen Her kanaldaki labirentin sonuna önce ve sonra propil pozlama (10-12 M) propil davranış onun yanıtı değerlendirmek için tercih bir dizinin hesaplamak için kullanılan süre. Değeri tercih dizinin cazibe gösterir. Örnek boyutu, n, parantez dışında bildirilir ve parantez içinde kadın sayısı deneysel kanaldaki denetimine göre daha fazla zaman harcadı denemeler arasında gösterir. Demek gibi ± S.E.M. sunulan verilerin (* p < 0,05; Davranışsal tercih öncesi ve propil maruz kaldıktan sonra karşılaştırmak için Wilcoxon imzaladı-rank testi). Şekil 4'li vd. bu rakam değiştirilme tarihi 22 ve Şekil 5'li vd. 29. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek Şekil 1: labirent fotoğrafı. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Balık bileşiklerin henüz tespit için tam bir kimyasal dünyada yaşıyoruz. Bioassay-güdümlü ayırma belirlemek ve bu masu somon31, Asya filler32ve deniz lampreys33gözlenen gibi birçok kimyasal etkileşimlerin arabuluculuk biyoaktif molekülleri karakterize temel kanıtlamıştır, 34,35. Bioassay-güdümlü ayırma doğru bir şekilde izleme ve belirlemekte başlangıç biyoaktif bileşikler için saflaştırılmış etkin bileşik ayıklamak için etkili bir yaklaşımdır. Bu yaklaşımı kullanarak, bir roman bileşik bilinen biyosentetik yolları öngörülen düşüktür benzersiz bir kimyasal iskelet ile tanımlanan biyoaktif bileşikler ortaya çıkarabilir.
EOG kayıtları hangi kesirleri veya bileşikler koku yanıt-e doğru çıkarmak belirlemek için yapılmaktadır. Birkaç teknik konuları doğru EOG kayıtları ile sözde feromon koku yanıtlarını ölçmek için zorunludur. İlk olarak, kurumsal hayvan bakım ve kullanım onaylı Komitesi yordamlar uygun olarak, balık olmalı derinden 3-aminobenzoic asit etil ester (MS222) anestezi ve gallamine triethiodide bir kas içi enjeksiyon ile immobilize. Kayıt elektrot elektriksel gürültü kaynağı olabilen herhangi bir hareketi solungaçları ve yetersiz bir immobilizasyon nedeniyle kalp atışı algılar. İkinci olarak, koku epitel hemen kömür filtre su kuruma engelleyecek sonra diseksiyon maruz. Micromanipulators, elektrik zemin ve propil teslim tüp ile kayıt ve referans elektrot konumunu ayarlama olumlu denetim propil yanıt yanıt-e doğru boş denetim (en aza indirerek en üst düzeye yardımcı olabilir filtrelenmiş su). Üçüncü olarak, koku epitel duyarlı kayıt konum belirledikten sonra bu kayda varyasyon en aza indirmek için lamellae üzerinde benzer bir konumdan önemlidir. Sürekli olarak benzer bir konuma kaydetmek için tank ve balık, mikroskop, propil teslim tüp ve micromanipulators aynı pozisyonda tutan V şekilli plastik stand tutun. Anestezik tüp balık'ın bukkal boşluğunda imzalat kalır emin olmak için deney süresince kalmalıdır. Ancak, Eğer kayıt elektrot elektrik sinyali düzensiz bir taban çizgisi kaynaklanan su hareket algılama bukkal kavite ve anestezi akış hızı içinde bulma değiştirilebilir.
Davranışsal tahlil tasarımını denek davranışsal ekoloji ve araştırma soru ilgi için özel. İki seçenekli labirent davranış deneyleri herhangi bir kokulu kesirler de davranışsal etkin olup olmadığını belirlemek için kullanılır. Arıtılmış bileşikleri genellikle sadece dakika miktarlarda bulunması nedeniyle, daha düşük bir akıntı nedeniyle akışına göre faydalı bir davranış bioassay labirentidir. Biz kaynak yakınındaki tercihi Olgun Erkek Olgun kadın arkadaşları yakın çekmek ve onları yumurtlama için bir yuva üzerinde korumak için öngörülen tarafından yayımlanan sözde seks feromon değerlendirirken ilgilenmişlerdir. Davranışsal tahlil ovulated bir kadın Olgun Erkek odorants arasında seçme doğal koşulları çoğaltmak için tasarlanmıştır. Bu nedenle, bizim davranış deneylerde denek olarak ovulated kadın test etmek ilgili. Ancak, test propil bağlı olarak, diğer denekler (Örneğin, farklı bir hayat sahne veya erkek) daha uygun olabilir. İki seçenekli labirent boyutlarının varyasyonlarında denek ve feromon (yani, kaynak karşı uzun mesafe yakınındaki) öngörülen etkin alan boyutuna bağlı olarak gerekli olabilir36. Aynı şekilde, davranışsal yanıt çoğu kez konsantrasyon bağımlı. Sözde feromon, EOG ile belirlenen algılama eşik konsantrasyon uygulandığında bir davranışsal yanıt gözlem değil yapılırsa, feromon konsantrasyonu ayarlanmalıdır. Ancak, bileşik bir güçlü propil olsa bile, o mutlaka önemli bir davranış tercih neden olabilir değil olduğunu belirtmek gerekir. Sonuçta, labirent gözlenen davranış yanıt sözde feromon fonksiyonu onaylamak için bir alan ayarında sentetik bileşik ile doğrulanması.
Bir büyük bioassay güdümlü ayırma sıralı test bireysel kesirleri veya bir bioassay (EOG veya davranış) bileşikler kısıtlamasıdır. Önceki çalışma böcek sex Feromonlar genellikle birden çok bileşeni belirli oranlarda37 karışımları bu işlev bileşenleri38 olarak bağımsız olarak ya da sinerjik olarak uygun tepkiler ikna etmek için39 karışımları göstermiştir conspecifics. Bu nedenle, bioactivity onaylamak için Kombinatorik testleri gerektirdiğinden yalnızca belirli karışımları içinde varolduğunda aktif bileşikler bioassay güdümlü ayırma ile gözden. Bioassay-güdümlü ayırma diğer sınırlamaları içerir: 1) büyük miktarda malzeme başlayan yapısal analizi, EOG ve davranışsal deneyleri; için yeterli miktarda olması gerekir 2) yinelemeli arıtma süreci nedeniyle zaman alıcı bir süreçtir; ve 3) ufacık ya da kararsız bileşiklerdir olmak bulmak pek mümkün değildir. Gelecekte, bazı bioassay güdümlü ayırma teknik sınırlamaları aşmak bioassay güdümlü ayırma ve metabolomics melez bir yaklaşım gerektirebilir. Melez bir yaklaşım kullanarak, katkı maddesi ya da sinerjik feromon etkileri ayırt13 olması muhtemel ve kararsız bileşikler tespit olasılığı daha yüksektir.
Açıklanan bioassay güdümlü ayırma işlemi deniz taşemen Feromonlar tanımlanması için özel olarak tasarlanmıştır. Ancak, kimyasal iletişim hayvanlar alemi1 ' her yerde ve bu işlemi kolayca takson geniş bir dizi Feromonlar karakterize etmek için adapte edilebilir. Çünkü Feromonlar davranışsal yanıt istilacı türlerin kontrolünü veya yerel türler Imperiled restorasyonu sonucu modüle için uygulanabilir feromon kimlik ve karakterizasyonu önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Okyanus deniz lampreys sağlamak için Kanada ve ABD Jeolojik Araştırma Hammond Bay biyolojik İstasyonu onların araştırma tesislerinin kullanımı ve personel ABD balık ve vahşi yaşam servisi ve balıkçılık için teşekkür ederiz. Bu araştırma Weiming Li ve Ke Li büyük göl balıkçılık Komisyonu hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades - #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
References
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- El-Sayed, A. M. The pherobase: database of insect pheromones and semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com (2009).
- Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
- Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
- Carde, R. T., Minks, A. K. Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints. Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).
- Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. Sex pheromones and their impact on pest management. Journal of chemical ecology. 36, (2010).
- Cheng, Y. -n, Wen, P., Dong, S. -h, Tan, K., Nieh, J. C. Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).
- Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , Springer Science & Business Media. (2013).
- Pizzolon, M., et al. When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success. Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).
- Stacey, N., Sorensen, P. Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , Elsevier Inc. (2011).
- Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish. Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).
- Stacey, N. Hormonally-derived pheromones in teleost fishes. Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).
- Kuhlisch, C., Pohnert, G. Metabolomics in chemical ecology. Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).
- Prince, E. K., Pohnert, G. Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).
- Teeter, J. Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).
- Moore, H., Schleen, L. Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).
- Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).
- Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).
- Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour? Animal Behaviour. 78, (2009).
- Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus. Animal Behaviour. 70, (2005).
- Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. Great Lakes Fisheries Policy and Management. , Michigan State University Press. East Lansing, MI. 651-704 (2013).
- Li, K., et al. Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics. Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).
- Hird, S. J., Lau, B. P. -Y., Schuhmacher, R., Krska, R. Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food. TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).
- Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. Identification of "known unknowns" utilizing accurate mass data and ChemSpider. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).
- Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2 (11), 2692 (2007).
- Kaiser, B., Wright, A. Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , BRUKER. Madison, WI. (2008).
- Breitmaier, E., Sinnema, A. Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , Wiley. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore. (1993).
- Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. The assignment of absolute configuration by NMR. Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).
- Li, K., et al. Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey. Organic Letters. , (2017).
- Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish. Natural Product Reports. , In press (2018).
- Yambe, H., et al. L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).
- Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Jr Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus. Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).
- Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
- Hoye, T. R., et al. Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone. The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).
- Fine, J. M., Sorensen, P. W. Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone. Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).
- De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).
- De Bruyne, M., Baker, T. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).
- Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. Separate orientation and releaser components in a sex pheromone. Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).
- Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it. Science. 237 (4815), 650-652 (1987).
