Summary
Aquí, presentamos un protocolo para aislar y caracterizar la estructura, potencia olfativa y respuesta comportamiento de compuestos de feromonas putativos de lampreas de mar.
Abstract
Fraccionamiento guiado por bioensayo es un enfoque iterativo que utiliza los resultados de pruebas biológicas fisiológicas y de comportamiento para el aislamiento e identificación de un compuesto activo de la feromona. Este método ha dado como resultado la acertada caracterización de las señales químicas que actúan como feromonas en una amplia gama de especies animales. Lampreas del mar dependen de olfato para detectar las feromonas que median las respuestas conductuales o fisiológicas. Utilizamos este conocimiento de la biología de peces para afirmar las funciones de las supuestas feromonas y para el aislamiento e identificación de los componentes de la feromona activa. Cromatografía se utiliza para extraer, concentrar y separar compuestos del agua condicionado. Electro-olfactogram (EOG) las grabaciones se llevan a cabo para determinar qué fracciones provocan respuestas olfativas. Ensayos conductuales laberinto dos opción entonces se utilizan para determinar si cualquiera de las fracciones los también son su comportamiento activo e inducen una preferencia. Métodos espectroscópicos y espectrométricos proporcionan el peso molecular e información estructural para ayudar en la aclaración de la estructura. La bioactividad de los puros se confirma con análisis de comportamiento y EOG. Las respuestas conductuales observadas en el laberinto, en definitiva, deberán validarse en un ambiente de campo para confirmar su función en un entorno natural de la corriente. Estas pruebas biológicas desempeñan un papel dual para 1) guiar el proceso de fraccionamiento y 2) confirmar y definir con mayor precisión la bioactividad de componentes aislados. Aquí, Divulgamos los resultados representativos de una identificación de la feromona de lamprea marina que ejemplifican la utilidad del enfoque fraccionamiento guiado por bioensayo. La identificación de las feromonas de la lamprea marina es particularmente importante porque una modulación de su sistema de comunicación de feromona es entre las opciones consideradas para el control de la lamprea de mar invasiva en el Laurentian Great Lakes. Este método se puede adaptar fácilmente para caracterizar la comunicación química en una amplia gama de taxa y arrojar luz sobre ecología química transmitidas por el agua.
Introduction
Las feromonas son señales químicas específicas por personas que les ayudan a localizar fuentes de alimento, detectar depredadores y mediar las interacciones sociales de sus congéneres1. Comunicación de feromonas en insectos ha sido bien estudiado2; sin embargo, la identificación química y función biológica de las feromonas vertebradas acuáticas no han sido estudiados tan extensamente. Conocimiento de la identidad y función de las feromonas liberado pueden aplicarse para facilitar la recuperación de especies amenazadas3,4 o el control de plagas especies5,6. La aplicación de estas técnicas requiere el aislamiento y la caracterización de los componentes bioactivos de la feromona.
Identificación de la feromona es una rama de la química de productos naturales. Progreso en la investigación de la feromona ha sido parcialmente limitada debido a la naturaleza de las moléculas de feromona se. Las feromonas son a menudo inestables y liberado en pequeñas cantidades, y existen sólo unas pocas técnicas de muestreo para detectar cantidades diminutas de volátiles7,8 o compuestos solubles en agua9. Enfoques para identificar las feromonas incluyen 1) una proyección específica de compuestos conocidos, 2) metabolómica y fraccionamiento 3) guiado por bioensayo. Una proyección específica de compuestos conocidos pruebas disponibles comercialmente los subproductos metabólicos de procesos fisiológicos que se presumen para funcionar como las feromonas. Este enfoque limita porque los investigadores sólo pueden probar compuestos conocidos y disponibles. Sin embargo, ha resultado en la identificación acertada de las hormonas sexuales en los peces de colores que funcionan como feromonas10,11,12. Metabolómica es un segundo enfoque de identificación de la feromona que distingue productos metabólicos posibles de molécula pequeña dentro de un sistema biológico13. Una comparación de los perfiles metabólicos de los dos grupos (es decir, un activo versus un extracto inactivo) permite la identificación de un perfil metabólico potencial de que el metabolito es purificado, es dilucidar la estructura y la bioactividad es confirmado14. Efectos aditivos o sinérgicos de complejas formulaciones de mezclas específicas suelen detectarse con metabolómica debido a metabolitos son considerados juntos en lugar de como una serie de fracciones13. Sin embargo, la aplicación de la metabolómica se basa en la disponibilidad de referencias sintéticas porque los datos resultantes no facilitan la elucidación de estructuras novedosas.
Fraccionamiento guiado por bioensayo es un enfoque integrado, iterativo que abarca dos campos: química y biología. Este enfoque utiliza los resultados de pruebas biológicas fisiológicas y de comportamiento para el aislamiento e identificación de un compuesto activo de la feromona. Un extracto crudo es fraccionado por una propiedad química (es decir, tamaño molecular, polaridad, etc.) y probado con grabaciones de electro-olfactogram (EOG) o en un bioensayo. Los componentes bioactivos se proyectan hacia fuera repitiendo estos pasos de fraccionamiento y EOGs o pruebas biológicas. Las estructuras de compuestos activos puros se esclareció por métodos espectroscópicos y espectrométricos, que el peso molecular e información estructural para producir una plantilla del compuesto a ser sintetizados. Fraccionamiento guiado por bioensayo puede producir diversos metabolitos y potencialmente nuevas feromonas con esqueletos química únicas que no puede predecirse desde las vías biosintéticas.
Aquí, describimos el protocolo de fraccionamiento guiado por bioensayo utilizado para aislar y caracterizar la actividad biológica de compuestos de feromonas sexo masculino lamprea de mar. La lamprea marina (Petromyzon marinus) es un modelo vertebrado ideal para estudiar comunicación feromonas porque estos peces dependen en gran medida la detección olfativa de señales químicas para mediar su historia de vida anádromo conformada de tres etapas distintas: larvas, juveniles y adultos. Larvas de lamprea marina madriguera en el sedimento de las corrientes de agua dulce sufren una drástica metamorfosis y transforman en juveniles que migran a un lago o un océano donde que parasitan a peces de gran acogida. Después de la extracción de los pescados del anfitrión, los adultos migran hacia arroyos de desove, guiado por las feromonas migratorias publicadas por larvas de corriente residente15,16,17,18,19 . Los machos maduros ascienden para el desove, liberan una feromona sexual multicomponente para atraer a compañeros, aparecen intermitentemente durante aproximadamente una semana y luego mueren15,20. La identificación de las feromonas de la lamprea marina es importante porque una modulación del sistema de comunicación de feromona es entre las opciones consideradas para el control de las lampreas de mar invasivas en el Laurentian Great Lakes21.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de la Universidad Estatal de Michigan (AUF # 03/14-054-00 y 02/17-031-00).
1. recolección y extracción de lamprea marina acondicionado agua
- Lugar sexual maduro masculinas lampreas de mar (15-30 animales) en un tanque provisto de 250 L de agua aireada del Huron de lago en 16-18 ° C.
- Recoger el agua acondicionado por el hombre a lo largo de cada noche desde junio a julio.
Nota: lampreas de mar naturalmente mueren después de reproducirse. Si un pez está a punto de este punto en su vida, sustituirla por un hombre maduro fresco. - Extraer el agua condicionado por extracción en fase sólida.
- Remoje la resina en metanol durante 4 horas antes de cargar en una columna. Cargar la resina en la columna, luego 10 litros de agua a través de la columna para eliminar el solvente orgánico de la bomba.
- Pasar el agua acondicionado desde el tanque manteniendo el pescado mediante el sistema de bombeo en la parte superior de la columna. El agua pasa a través de una cama de 2 kg de resina de intercambio iónico polimérico moderadamente polar (por ejemplo., resina Amberlite XAD-7 HP), contenida en una serie de cuatro columnas de vidrio de 2,5 L de capacidad. Mantener velocidades de carga de entre 400 y 600 mL/6 min eluir los metabolitos con 10 L de metanol seguida inmediatamente por 5 L de acetona.
Atención: Este paso utiliza metanol y acetona. Ambos son inflamables y tóxicos.
Nota: El residuo combinado puede almacenarse a-80 ° C hasta que la tramitación.
- Reactivar la columna después de 1 semana de enriquecimiento por lavado con agua (aproximadamente 10 L).
- Quite el solvente orgánico (la mezcla de metanol y agua) y recoger el extracto por evaporación rotativa de 5 h a presión reducida (menor de 300 mbar) a 40 ° C. Concentrar el residuo de agua por congelación liofilización secador durante 48 h a-20 ° C hasta que se seque.
2. aislamiento de fracción piscinas con cromatografía de
- Remojo el gel de sílice (230-400 mesh) en la fase móvil inicial 30 min transferencia el gel con el solvente (suspensión) a una columna de vidrio. Abra la válvula de la columna para permitir que la fase móvil ir a través. Permita que el gel de sílice precipitar y formar una cama de gel de silicona.
- Homogeneizar los extractos con gel de sílice (70-230 mesh) y cargarlos en la columna de cromatografía de líquidos sobre la cama de gel de silicona. Eluir con una inclinación de 95% CHCl3 (cloroformo) / MeOH (metanol) a 100% MeOH, 2,5 L de volumen total. Recoger el eluyente en frascos individuales (cada 10 ml).
PRECAUCIÓN: El cloroformo utilizado en este paso es un reactivo tóxico. - Guía de la puesta en común de los eluyentes en 20 fracciones por un análisis de cromatografía (TLC) de capa delgada.
- Realizar el experimento de TLC en placas de Silicagel prelacado aplicando la muestra sobre la línea de salida y sumergiendo a la línea de salida de la placa en los solventes en desarrollo (elegir la polaridad por el ratio de CHCl3 metanol 100-0%) en un vaso sellado tanque.
- Seleccione la relación de desarrollo solvente para hacer todos los TLC puntos con un factor de retención (Rf) que van desde 0.3 - 0.8.
- Después de que el solvente de desarrollo alcanza la línea de fondo, sacar la placa del tanque y esperar 10 minutos para que el disolvente se evapore.
- Visualizar las manchas primero bajo UV luz en 254 nm y manchas entonces por pulverización con una solución de metanol ácido de 5% anisaldehyde (20 μL) por un rociador de cromatografía y calentamiento a 85 ° C durante 3 minutos.
Nota: Los puntos de colores en la placa de TLC indican el componente principal en la fracción. - Combinar el eluyente a 20 fracciones basado en colores planos y la similitud def de R del componente principal.
- Concentrar la fracción a un residuo por evaporación rotatorio a presión reducida (300 mbar según la propiedad de disolventes) a 40 ° C durante aproximadamente 30 minutos.
3. Electro-olfactogram (EOG) grabaciones para identificar fracciones/compuestos olorosos
- Tire de Capillares de vidrio de borosilicato (diámetro externo: 1,5 mm, diámetro interno: 0,86 mm; longitud: 100 mm) con una micropipeta tirador con el nivel de calefacción se establece en 65.
- Puntuación y corte la abertura en la punta del tubo capilar con un cortador de vidrio punta de diamante y llenarlo con agar fundido de 0,4% en solución salina al 0.9%. La abertura en la punta del tubo capilar debe ser alrededor de 10 μm de diámetro.
- Llene los electrodos capilares tirados de 3.1-3.2 y los sostenedores de electrodos de estado sólido prefabrican con pelotillas de Ag/AgCl (véase Tabla de materiales) con 3 M KCl con una micropipeta.
Nota: Desplazar cualquier burbuja de aire en el tubo capilar o el portaelectrodo. - Inserte los electrodos tirados en el portaelectrodos.
- Preparar 100 mL de 10-5 M L-arginina en agua filtrada de carbón de leña de una solución 10-2 M L-arginina en agua desionizada (almacenado a 4 ° C) en un matraz aforado. Transferir 20 mL de la 10-5 M L-arginina a un frasco de vidrio.
- Para la curva concentración-respuesta, prepare 10 mL de diluciones 10 veces de las piscinas de la fracción del paso 2.3 en viales de vidrio. Preparar diluciones frescas diariamente antes de los experimentos y utilizar dentro de un día. Poner los frascos de vidrio de las soluciones de trabajo de L-arginina y las diluciones de la piscina de fracción en un baño de agua de recirculación para permitir que la temperatura se equilibre y 8 ° C.
- Anestesiar la lamprea con éster de etilo ácido 3-aminobenzoico (MS222; 100 mg/L) e inmovilizar con una inyección intramuscular de trietioduro de galamina (3 mg/kg de peso corporal, en suero salino 0,9%) con una jeringa estéril.
Nota: Una suficiente profundidad de la anestesia se determina mediante la observación de ningún movimiento de gill, una incapacidad para mantener una postura erguida y no hay succión a los lados del tanque con su disco oral. Para minimizar cualquier contaminación microbiana antes y durante la cirugía, guantes estériles y sumerja las herramientas de disección en etanol al 70% (v: v) en agua desionizada durante al menos 10 minutos antes de su uso. - Oriente la lamprea anestesia en un soporte en forma de V y envuélvalo con una toalla de papel húmeda para evitar la desecación.
Nota: No obstruya las aberturas branquiales. - Insertar un tubo de recirculación agua aireada que contiene 50 mg/L de MS222 en la cavidad bucal, ajustar el flujo y asegurarse de que está saliendo agua por las aberturas branquiales para regar continuamente las branquias.
- Utilice un bisturí estéril y pinzas [bajo el microscopio estereoscópico en un 1.25 X de ampliación (véase Tabla de materiales)] para eliminar una sección de2 5 mm de la piel en la superficie de la cápsula olfatoria para exponer el epitelio olfatorio.
- Lave la tubería de suministro de olor con agua filtrada y conéctela a la válvula montada en un micromanipulador. Coloque el tubo capilar de la entrega de olor en la cavidad del epitelio olfativo con el micromanipulador para suministrar agua filtrada al epitelio olfativo para prevenir desecación al no administrar aceites.
- Monte los electrodos de registro y referencia en los micromanipuladores. Bajar el electrodo de referencia en la piel externa cerca de la naris. Utilizando el microscopio estereoscópico (1,25 X), baje el electrodo de la grabación apenas toque la superficie del epitelio olfativo.
- Transferir la toma de la tubería de impulsión de olor del fondo filtrado agua a la solución de L-arginina 10-5 M.
- Encienda el ordenador, amplificador (a modo de la C.C.), filtro y digitalizador. El software de controlador de válvula, programar el procedimiento para administrar un pulso simple de 4 s de odorante marcando la casilla de T1, configuración T a 4 s y marcar la casilla de T2.
- En el software de adquisición de datos (véase Tabla de materiales), establezca el modo de adquisición en un osciloscopio de alta velocidad, haga clic en el icono del juego y a continuación, haga clic en Inicio en el controlador de la válvula para activar el pulso de odorante.
Nota: El software de adquisición de datos registra automáticamente la amplitud de respuesta EOG diferenciada durante 20 s (3 s antes de 4 s durante el pulso de odorante y 13 s después). Utilizar el instrumental quirúrgico para maniobrar las posiciones del electrodo de la grabación, electrodo de referencia o tubo odorante para aumentar la relación señal a ruido con una respuesta máxima al nivel de L-arginina y una respuesta mínima a los () control en blanco agua filtrada). Cambiando el interruptor del amplificador de AC-DC a tierra mientras se mueven los electrodos de tierra del amplificador. - Iniciar la grabación del control en blanco, L-arginina y entonces el preparado en el paso 3.6 de baja a las altas concentraciones con un chorro de 2 min de agua filtrada entre las aplicaciones de aceites.
- Después de registrar las respuestas a todos de las aceites a probarse, masa en el y retraiga cuidadosamente los electrodos y el tubo capilar de la entrega de olor. Siguiendo los métodos institucionales el cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) aprobados, en la terminación del experimento EOG, eutanasia la lamprea anestesia con una sobredosis de MS222 (1 g/L).
Nota: Verifique éxito eutanasia señalando la falta de movimiento de gill y del latido del corazón para por lo menos 5 min seguido de registrados en el cerebro. - Analizar y trazar los datos mediante software de análisis. Determinar el umbral de detección de olores22 identificar fracciones olorosas que provocan respuestas mayores que el control de agua en blanco. Las piscinas de fracción que provocan respuestas olfativas dependiente de la concentración que son diferentes que el control de agua en blanco entonces se prueban en un ensayo conductual (paso 4).
4. elección de dos bioensayos conductuales para identificar compuestos de fracciones comportamiento activos de laberinto
- Aclimatar la lamprea de mar mujer sexualmente madura en la jaula de liberación en el laberinto (ver figura 1 complementaria) por 5 min, mantener la tasa de flujo del agua del río en el laberinto
Nota: El laberinto se construye de madera barnizado calidad marina y medidas de 6,5 m de longitud y 1,2 m de ancho con un divisor de 2,7 m de longitud para separar el laberinto en dos canales en el extremo aguas arriba. El agua es desviada temporalmente en el laberinto. La profundidad del agua debe mantenerse a 0,19 m y la velocidad se debe mantener a 0.07 m/s ± 0.01. - Suelte la lamprea de mar y registrar la cantidad acumulada de tiempo que pasa la lamprea en el experimental y el canal de control de cada río con agua durante 10 minutos.
Nota: Si la lamprea marina es incapaz de introducir en la experimental y el control de canal para al menos 10 s durante este período de 10 minutos, termina el juicio, pues esto es una indicación de inactividad o lado fuerte sesgo. - Aplicar el estímulo de prueba (es decir, una supuesta feromona en 10-12 M disuelto en 50% metanol/desionizada) en el canal experimental asignado al azar y el vehículo (50% metanol/desionizada) en el canal de control usando peristáltico bombas a precios constante de 200 mL/min durante 5 minutos.
Nota: Puede usarse como concentración inicial la concentración umbral de detección de la prueba de estímulo determinada con las grabaciones de electro-olfactogram para la prueba de comportamiento. - Aplicar el estímulo de prueba y el vehículo para un adicional 10 min y registrar la cantidad acumulada de tiempo que dedica a la lamprea en el experimental y el canal de control.
- Descarga el laberinto con agua durante 10 minutos antes del comienzo de la siguiente prueba. Repita los pasos 4.1-4.4 con lampreas al menos 7 si se dispone de suficiente estímulo de prueba.
- Calcular el índice de preferencia de22 por cada ensayo y evaluar el significado usando una Wilcoxon firmar-alinea la prueba.
Nota: El índice de resultados en un único número que puede ser positivo o negativo. Un valor positivo del índice de preferencia indica atracción, mientras que un valor negativo del índice de rechazo de las indicaciones de preferencia. Si el índice de preferencia es significativamente diferente de cero, la fracción se considerará como activa.
Aquí,
Bc = el tiempo empleado por la lamprea de prueba en el canal de control antes de la aplicación de odorante,
Be = el tiempo pasado en el canal experimental antes de la aplicación de odorante,
C = el tiempo pasado en el canal de control después de la aplicación de aroma, y
Ae = el tiempo pasado en el canal experimental después de la aplicación de odorante.
5. aislamiento cromatografía de compuestos puros de fracciones activas
- Repita los pasos 2.1-2.4 con las piscinas de fracción que inducen respuestas olfativas (paso 3) y provocan respuestas conductuales (paso 4).
- Además purificar fracciones activas en compuestos con Cromatografía por exclusión de tamaño mediante una columna de Sephadex LH-20.
- Preparar la muestra de 0,5 mL en la fase móvil inicial [CHCl3- MeOH (1:1) o MeOH 100%], una columna de CHCl3- MeOH (1:1) y luego una columna de MeOH (100%) de carga en la columna correspondiente y eluir para producir los compuestos.
6. aclaración estructura de un compuesto puro con espectrometría de masas (MS) y resonancia magnética Nuclear (RMN)
- Disolver y diluir el compuesto purificado en la fase móvil inicial (por lo general, metanol en agua 1:1, v: v) de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para formar una solución μL 10 de aproximadamente 1 μg/mL.
- Transferir la solución de muestra a frascos de la CLAR y ponlos en el automuestreador de HPLC. Inyectar la muestra (10 μL) de la espectrometría de ionización por electrospray (ESIMS) y registrar los espectros de espectrometría de masas (HRESIMS) de ionización electrospray alta resolución usando un espectrómetro de masas cromatografía del23.
- Predecir la fórmula molecular según la base de datos en el software de espectrómetro de masas (véase Tabla de materiales)24.
- Abra el cromatograma de la muestra inyectada y obtener su espectro de masas seleccionando el pico cromatográfico.
- Entrada de la masa medida al valor de la ion (m/z) (4 decimales) en la composición Elemental en el módulo de la herramienta . Establezca el parámetro de tolerancia en PPM < 5.
- Ajustar los parámetros de símbolo para la composición del elemento de la molécula de medida. El software produce una predicción de fórmula molecular basada en el análisis de la masa única.
- Seleccionar los disolventes deuterados (600 μL, CH3OH -d4 o DMSO -d6) según el protocolo25 para disolver las muestras.
- Disolver completamente la muestra en los disolventes deuterados seleccionados para formar una solución con una concentración desde aproximadamente 0.1 a 10 mg/mL. Transferir la solución de muestra en un tubo NMR a grabar el 1D (1H, 13C) y RMN 2D [1H -1H espectroscopia de la correlación (acogedor), heteronuclear sola coherencia cuántica (HSQC), heteronuclear correlación bonos múltiples (HMBC)] espectros en un espectrómetro NMR de 900 MHz del26.
- Coloque el tubo NMR con la muestra dentro de la turbina de spinner. Utilice el medidor de profundidad para garantizar que la altura de la muestra está en el centro de la ventana de medición. Abra el software NMR (véase Tabla de materiales) y haga clic en el botón de elevación para cambiar la muestra en el imán.
Nota: Mantenga una mano sobre la parte superior del imán para sentir el gas proveniente de la parte superior del imán. Al mismo tiempo, un silbido debe ser audible. - Suavemente Coloque la muestra en el colchón de aire sobre el imán y empujar levantar nuevamente el botón para descender la muestra en el imán de NMR.
Nota: Escuche un ruido de "click" indicar que la muestra está en la posición correcta. - Crear un nuevo conjunto de datos y cargar los parámetros por defecto recomendados por el instrumento NMR (véase Tabla de materiales).
- Tipo "lock" para invocar el procedimiento de bloqueo automático y seleccionar el solvente en la página pronto.
- Para ajustar, en el panel de la manipulación, ajuste el botón en el modelo de desbloqueo , ajustar el cursor en el panel de la manipulación y volver a bloquear el imán.
- En el indicador de la página de Atma , ajustar el parámetro en el panel de la manipulación para el procedimiento de ajuste, que puede tardar unos minutos. Espere hasta que el ajuste se completa para proceder.
- Inicie la rutina automática de relleno escribiendo "topshim" en el símbolo del sistema. Espere a que el equilibrado se completa para proceder.
- Tipo "rga" establecer automático recibiendo ajustes de ganancia, entonces tipo "d1" para establecer el retardo entre pulsos, luego tipo "zg" para iniciar la adquisición y esperar hasta que termine la adquisición.
- Tipo "ef" o "efp" para procesar los datos y teclear "apk" para la eliminación automática. Procesar los datos en el software de proceso NMR.
- Dilucidar la estructura química de una interpretación de los análisis de datos NMR.
- Cuenta las señales de carbono en el espectro de RMN de C 13. Seleccione la fórmula molecular coincidente en el resultado predicho en espectrometría de masas de alta resolución (HR-MS).
- Integrar las señales de protones en el espectro de 1H NMR y asignar la conectividad de la carbón - y protón-basado en las señales en el espectro HSQC.
- Asignar la Conectividad del esqueleto de carbono basado en las correlaciones en el 1H -1H COSY y HMBC espectro.
- Asignar provisionalmente la estructura química basada en la estructura lógica27. La estructura tentativa de búsqueda en las bases de datos de estructura química. Comparar la estructura provisional con los análogos en las referencias.
- Asignar la configuración relativa con el espectro Nuclear Overhauser efecto espectroscopia (NOESY).
Nota: Puesto que las propiedades de identidad de enantiómeros en espectrometría y métodos espectroscópicos son idénticas, la configuración absoluta de algunos compuestos, especialmente aquellos con alcohol 2' y 2'-NH2, tiene que determinarse con una reacción de derivatización. Después de la reacción de derivatización, las diferencias en los espectros de facilitan la asignación inequívoca de la configuración absoluta de la mayoría de los compuestos de28.
7. EOG y bioensayos para confirmar compuestos puros son olorosos y comportamiento activo
- Repita los pasos 3.1 a 3.5.
- Para la curva concentración-respuesta, prepare 10 mL de diluciones 10 veces de los puros de 10-6 M - 10-13 M de una solución 10-3 M feromona en 50% metanol/agua almacenada a-20 ° C basado en el peso molecular determinado en Paso 6.2. Poner los frascos de vidrio con las soluciones de trabajo de L-arginina y los compuestos puros en el baño de agua de recirculación para permitir que la temperatura se equilibre y 8 ° C.
- Repita los pasos 3.7-3.18.
- Repita los pasos 4.1 4.2.
- Aplique el compuesto puro en la concentración de umbral de detección EOG en el canal experimental asignado al azar y el vehículo (50% metanol/desionizada) en el canal de control utilizando una bomba peristáltica a precios constante de 200 mL/min durante 5 minutos.
- Repita los pasos 4.4-4.6.
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Representative Results
En la figura 1muestra un diagrama que resume los pasos descritos en el protocolo de fraccionamiento guiado por bioensayo. El protocolo trata de pasos para aislar y caracterizar la estructura, la potencia olfativa y la actividad conductual de las 5 feromonas supuesta lamprea de mar (figura 2). Utilizando los datos de NMR (figura 3 y figura 4) y espectrometría de masa, las estructuras de petromyzene A-B y petromyzone A-C fueron acladas de agua acondicionada con lampreas de mar macho maduro22,29.
Nuestros datos representativos de las grabaciones de EOG (figura 5) demuestran que la petromyzene A-B y petromyzone A-C eran todos olores potentes que estimularon el epitelio olfatorio de la lamprea de mar adultos y bajos umbrales de detección (figura 6) . De nota particular, los registros EOG requieren una colocación correcta del electrodo sobre la superficie del epitelio olfativo en relación con el tubo de entrega de estímulo para dar lugar a una buena relación señal a ruido para olor fiable grabación grabaciones de respuesta ( Figura 5B). Si no se sigue este paso crítico, será difícil discernir la señal inducida por el olor entre el alto nivel de ruido. La desviación hacia abajo de la traza EOG después de la exposición de olor es un potencial negativo. Una buena señal EOG debe mostrar una administración de odorante que la respuesta rápida y aguda seguida de una recuperación a la línea de base. Las respuestas olfativas a los pheromones supuestos también se normalizaron a las respuestas de 10-5 M L-arginina, un aroma de control positivo en la lamprea marina, probada durante todo el experimento para asegurar la integridad de las grabaciones fue mantenido.
En los ensayos conductuales laberinto opción dos (Figura 7A), lampreas de mar hembras ovuladas fueron atraídas a petromyzone A, petromyzene A y petromyzene B y rechazados de petromyzone C. Ovulated hembras parecen ser rechazados de petromyzone B; sin embargo, la respuesta conductual no fue significativa (figura 7B). Un mayor tamaño de la muestra no fue posible debido a la cantidad limitada de petromyzone B. Para evaluar adecuadamente la respuesta conductual a un odorante, es fundamental registrar el tratamiento previo sesgo para el control y el experimental canal de cada lamprea.
Figura 1: Diagrama de flujo del fraccionamiento guiado por bioensayo de feromonas de. Esta figura es una adaptación de la figura 2 en la Buchinger y Li y Li30. Las cajas indican el producto químico resultante de la técnica indicada en el óvalo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: las estructuras químicas de petromyzene A-B y petromyzone A-C. Esta cifra se modifica de la figuras 1 en Li et al. 22 , 29. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Espectros de RMN de figura 3:1. Espectros de RMN de 1D de petromyzene A: (A) espectro 1H NMR (900 MHz) y (B) 13C NMR (225 MHz) de espectro. Esta figura es de la información de apoyo en Li et al. 29. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: espectros de RMN 2D. Espectros de RMN 2D de petromyzene A: (A) el espectro HSQC (B) la 1H -1H COSY espectro, (C) el HMBC espectro y espectro (D) el NOESY. Esta figura es de la información de apoyo en Li et al. 29. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Electro-olfactogram (EOG) grabación grabaciones de seguimiento preparación y representante. (A) se trata de una preparación de EOG mostrando el epitelio olfatorio de la lamprea de mar expuesta con el electrodo de la grabación, el electrodo de referencia, el tubo de transferencia de olor y el agua oxigenada con el anestésico. (B) este panel muestra grabaciones de seguimiento representativo demostrando buena (superior) o cocientes signal-to-noise de mal (abajo). Una buena relación señal a ruido es necesaria para las grabaciones de las respuestas odorante confiable. La desviación hacia abajo de la traza EOG después de la exposición de olor es un potencial negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: una parcela Semi-logarítmica de curvas de concentración-electro-olfactogram (EOG). Petromyzone A-C y petromyzene A y B fueron estimulantes para el epitelio olfatorio de la lamprea de mar adulto y tenían límites de detección bajos. Los datos se presentan como la media amplitud normalizada EOG ± SEM Los tamaños de muestra fueron los siguientes: petromyzone A, petromyzene A y petromyzene B (n = 7) y petromyzone B y petromyzone C (n = 5). El margen es una vista ampliada de las respuestas EOG mostrando respuesta concentraciones umbral. Esta cifra ha sido modificada de la figura 3 en Li et al. 22 y figura 4 en Li et al. 29. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: un esquema y los resultados del laberinto de dos opción utilizada para evaluar las respuestas conductuales de lampreas de mar hembras ovuladas a odorantes. (A) la flecha representa la dirección del flujo de agua (0,07 m s-1 ± 0.01). Los círculos representan los puntos de administración de odorante. Las pequeñas líneas discontinuas representan malla fina que se utiliza para restringir el movimiento de la lamprea de mar a los confines del laberinto. Las grandes líneas discontinuas representan flujo tableros utilizados para reducir la turbulencia del agua. El rectángulo gris representa la jaula de liberación. La barra de escala = 1 m. Esta cifra es de S1 de la figura de Li et al. 29. (B) las hembras fueron atraídas a petromyzone A, petromyzene A y petromyzene B. El tiempo pasado de la lamprea en cada canal del laberinto antes y después de la exposición de odorante (10-12 M) se utilizó para calcular el índice de preferencia para evaluar su comportamiento ante el aroma. Un valor positivo del índice de preferencia indica atracción. El tamaño de la muestra, n, es reportado fuera de los paréntesis, y el número en paréntesis indica el número de hembras a través de ensayos que pasaron más tiempo en el canal experimental en comparación con el control. Los datos se presentan como promedio ± SEM (* p < 0.05; Wilcoxon firmar-alinea la prueba) para comparar la preferencia de comportamiento antes y después de la exposición de odorante. Esta cifra ha sido modificada de la figura 4 en Li et al. 22 y 5 de la figura de Li et al. 29. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario Figura 1: una foto del laberinto. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Peces viven en un mundo químico completo de compuestos aún por identificarse. Fraccionamiento guiado por bioensayos se ha demostrado esencial para identificar y caracterizar moléculas bioactivas que median muchas interacciones químicas, como los observados en salmón masu31, elefantes asiáticos32y lampreas de mar33, 34,35. Fraccionamiento guiado por bioensayo es un enfoque eficaz traza con precisión y determinar que los compuestos bioactivos de la puesta en marcha del extracto para el compuesto activo purificado. Usando este acercamiento, los compuestos bioactivos identificados pueden revelar una novela compuesta con un esqueleto químico único que es poco probable ser predicho de las vías biosintéticas conocidas.
Grabaciones de EOG se llevan a cabo para determinar que fracciones o compuestos provocan respuestas olfativas. Varias consideraciones técnicas son imprescindibles para medir con precisión las respuestas olfativas de las supuestas feromonas con grabaciones de EOG. En primer lugar, según el institucional Animal cuidado y procedimientos del Comité de uso aprobado, el pescado debe ser profundamente anestesiado con éster de etilo ácido 3-aminobenzoico (MS222) e inmovilizado con una inyección intramuscular de trietioduro de galamina. El electrodo de registro detecta cualquier movimiento de las branquias y latido del corazón debido a una inmovilización insuficiente, que puede ser una fuente de ruido eléctrico. En segundo lugar, el epitelio olfatorio debe ser inmediatamente expuesto a agua filtrada carbón después de la disección para evitar la desecación. Ajustar la posición del electrodo de registro y referencia con los micromanipuladores, la tierra y el tubo de suministro de odorante puede ayudar a maximizar la respuesta al olor de control positivo y reducir al mínimo la respuesta al (control en blanco agua filtrada). En tercer lugar, después de identificar una situación de grabación sensibles en el epitelio olfatorio, es importante al registro de una posición similar en las laminillas para minimizar la variación. Para grabar constantemente de un lugar similar, mantener el tanque y el soporte de plástico en forma de V con el pescado, el microscopio, el tubo de transferencia de olor y los micromanipuladores en la misma posición. El tubo anestésico debe permanecer en la cavidad bucal del pez durante la duración del experimento para sea anestesiado. Sin embargo, la colocación dentro de la cavidad bucal y de la tasa de flujo del anestésico puede ser modificada si el electrodo de la grabación es detectar el movimiento del agua que resulta en una base irregular de la señal eléctrica.
El diseño de la prueba de comportamiento se debe adaptar a la ecología conductual del sujeto de prueba y la pregunta de investigación de interés. Opción dos laberinto conductual ensayos se utilizan para determinar si cualquiera de las fracciones de los que también son conductualmente activo. Porque compuestos purificados a menudo sólo están disponibles en cantidades minuciosas, el laberinto es un bioensayo comportamiento beneficioso en comparación con la corriente debido a una descarga inferior. Estábamos interesados en la evaluación de la preferencia de cerca de la fuente de las supuestas feromonas por los machos maduros predichos para atraer a compañeros femeninos maduros en proximidad cercana y guárdelas en un nido para el desove. El análisis conductual fue diseñado para replicar las condiciones naturales de una mujer ovuladas que elegir entre los olores de los machos maduros. Por lo tanto, era relevante para la prueba de hembras ovuladas como el tema de prueba en nuestros experimentos de comportamiento. Sin embargo, dependiendo el aroma probado, otros temas de prueba (es decir, etapa de la vida diferentes o varones) pueden ser más apropiados. Variaciones en las dimensiones del laberinto dos opción pueden que sea necesarias dependiendo del tamaño del tema de prueba y el espacio activo predicho de la feromona (es decir, cerca de fuente versus distancia)36. Asimismo, las respuestas del comportamiento son a menudo dependientes de la concentración. Si no se observa una respuesta conductual cuando la feromona putativa se aplica en la concentración umbral de detección determinada con EOG, debe ajustarse la concentración de la feromona. Sin embargo, cabe señalar que incluso si un compuesto es un potente aroma, puede no necesariamente inducen una preferencia significativa de comportamiento. En definitiva, las respuestas conductuales observadas en el laberinto deberán validarse en un ambiente de campo con el compuesto sintético para confirmar la función de la feromona putativa.
Una limitación importante del fraccionamiento guiado por bioensayo es el prueba secuencial de fracciones individuales o compuestos en un bioensayo (EOG o comportamiento). Trabajo previo ha demostrado insecto feromonas sexuales suelen ser mezclas de varios componentes en proporciones específicas37 que funcionan independientemente como componentes38 o sinérgicamente como mezcla39 para inducir las respuestas apropiadas en sus congéneres. Por lo tanto, compuestos que sólo se activa cuando se presenta en mezclas de concreto pueden pasarse por alto con el fraccionamiento guiado por bioensayo porque requieren pruebas de combinatorias para confirmar la actividad biológica. Otras limitaciones del fraccionamiento guiado por bioensayo incluyen: 1) una gran cantidad de material de partida es necesaria tener una cantidad suficiente para el análisis estructural, EOG y ensayos conductuales; 2) el proceso es lento debido al proceso de purificación iterativo; y 3) compuestos minúsculos o inestables están poco probable que se detecte. En el futuro, superar algunas de las limitaciones técnicas de fraccionamiento guiado por bioensayo puede requerir un enfoque hibridizado de fraccionamiento guiado por bioensayo y metabolómica. Usando un enfoque hibridizado, feromona aditiva o sinérgica los efectos son más probables ser discernido13 y compuestos inestables tienen más probabilidades de ser detectado.
El proceso de fraccionamiento guiado por bioensayo se describe está diseñado específicamente para la identificación de las feromonas de la lamprea de mar. Sin embargo, la comunicación química es ubicua en el reino animal1 y este proceso puede ser fácilmente adaptado para caracterizar las feromonas en una amplia gama de taxa. Caracterización e identificación de feromonas son importantes porque las feromonas pueden aplicarse para modular las respuestas del comportamiento que resulten en el control de especies invasoras o en la restauración de especies nativas en peligro.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a la Estados Unidos geológico estudio Hammond Bay estación biológica para el uso de sus instalaciones de investigación y el personal del U.S. Fish y Wildlife Service y pesca y océanos de Canadá para proporcionar lampreas de mar. Esta investigación fue apoyada por las subvenciones de la Comisión de pesca de los grandes lagos a Li Weiming y Ke Li.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades - #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
References
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