Summary

角膜上皮摩耗眼はりのモデルとして角膜創傷治癒

Published: July 10, 2018
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Summary

このプロトコルでは、マウスの眼球の表面に耐摩耗性を与えるし、創傷の治癒過程をその後に従うメソッドについて説明します。ハイパーカプニア マウスで目の表面の上皮を部分的に削除する眼はりのプロトコルを活用します。

Abstract

マウス角膜創傷治癒研究に優秀なモデルを提供します。角膜は、目の最も外側の層となる傷害に最初の防衛.実際には、クリニックの目傷害の最も一般的なタイプは角膜上皮剥離です。ここでは、角膜上皮、体内麻酔下マウスの除去、摩耗を誘発する眼バリを利用します。このメソッドは、ターゲットで再現可能な上皮の中断、その他の部分をそのままにできます。また、フルオレセイン染色とすりむいた上皮の可視化を記述する、すりむいた角膜を視覚化する方法について具体的なアドバイスを提供しています。創傷治癒の 0、18、および 72 時間後摩耗、傷は再 epithelialized までのタイムラインを従います。角膜損傷の上皮摩耗モデルは、上皮細胞の増殖, 移行および角膜の層の再上皮化に関する研究に最適です。ただし、このメソッドは眼のバリが間質細胞の層に浸透していないため創傷が治癒過程における間質の活性化を研究するが最適ではありません。このメソッドは、薬の効果の前臨床試験などの臨床応用に適しています。

Introduction

多くの器官の上皮層は、傷害にさらされています。ただし、創傷治癒過程での組織の損失を賠償する能力も含まれます。角膜創傷治癒研究に優秀なモデルを提供しています。それは眼の外部表面を形作り、敏感な眼機械の保護レイヤーを提供します。したがって、角膜は、病原体や水の損失に物理的な障壁として機能します。3 つの層から成り立っています上皮、実質、内皮細胞。角膜の上皮は角膜の最も外側の層になります。上皮細胞は互いにタイトな接合1,2,3を厳密に遵守することで角膜のバリア機能を維持します。無細胞性角膜基底膜、ボーマン膜は、難治性の実質細胞が含まれている広範な間質から上皮を分離します。実質の下で血管内皮細胞チャネル栄養素、水、および上位層への酸素。

角膜の傷、クリニック4で非常に一般的です。角膜への傷害は様々 で、主にほこりや砂、傷、または他の異物のような小さな粒子によって引き起こされます。プロトコルは、角膜上皮の摩耗、臨床的に関連するタイプを再現するために目的を紹介します。そうでは、このプロトコルは、臨床医や角膜科学者が独自の研究で実装するため制御し、精液メソッドを提供します。鈍く眼バリ、Algerbrush II と組織を研磨し、マウス角膜の体内の損傷修復アッセイを行った。ここでは、ターゲット中心部の角膜上皮にのみ耐摩耗と損傷することがなく器官の他の部分を残して。したがって、移行、増殖と分化体内5のセル プロトコルは再上皮化時に研究角膜上皮細胞や基底膜に最適です。最近では、このモデルは、前駆細胞の動態解析けが67の後角膜上皮幹細胞ニッチを再確立する差別化された角膜上皮細胞の容量を発表するだけでなくマウス角膜を分析に使用されました。次の摩耗、角膜はその通常の透明性、引張強さに返します。興味深いことに、その再上皮化が細胞増殖8なし発生する生体外で研究が示されます。このプロトコルでは、マウスの角膜で中断のない癒しのタイムラインについて説明します。したがって、メソッドは癒しのパターンと速度で薬の効果をテストする適用です。

角膜は、創傷治癒の研究に広く使用されています。しかし、多くの研究は、傷害の他のモデルに依存しています。9角膜表面にフィルター ペーパーの有無、角膜損傷の確立モデルは水酸化ナトリウム (NaOH) を適用することによって実行されるアルカリ火傷です。角膜の上皮だけでなく、結膜と実質9,10に影響大とびまん性損傷でアルカリ暴露します。強いアルカリ液は血管新生9混濁、角膜潰瘍を誘発する示されています。炎症細胞は、通常 6 時間以内実質に侵入し、24 h11までそこに残る。したがって、アルカリ外傷は間質の活性化に関連する研究のことをお勧め方法です。化学傷害の別のタイプは、角膜9,10ジメチルスルホキシド (DMSO) を適用することによって加えることができます。他の一般的に使用される傷害モデル、実質14,15の上の部分に制限されて実質と角膜切除の傷を貫通切開創の傷があります。これらのメソッドは、間質の創傷治癒に関する質問に回答もな。異なった傷害モデルには、独自の長所と短所があります。摩耗、または角膜の上皮のデブリードマンは最初鈍くメスやブレードを使用して前のヴィヴォ角膜16に開発されました。このメソッドは、使用される生体内でマウス、ラット、ウサギ17,18,19,20,21,22後されています。眼のはり (図 1) を使用して、我々 上皮の残りの部分は影響を受けないまま、上皮の選択した領域のみを削除します。このように、角膜のさまざまな部分に上皮の除去を細かく指定することが可能です。さらに、摩耗のサイズは、フルオレセイン染色と評価できます。さらに、ここで我々 は治癒期間中摩耗閉鎖を従います。

このメソッドは、いくつかの利点をもたらす、i) 化学損傷では不可能です、耐摩耗のサイトの正確な位置を含む ii) 耐摩耗性を実行するクイック、iii) 非侵襲的です。ここで、しかし、これはラット、ウサギ、ヒトの角膜障害を研究するために使用の一般的なモデルであるだけでなく遺伝的マウスモデルの広大な配列に適用される可能性がモデルとしてザイモグラムの当所のマウスを使用して方法を述べる.

Protocol

すべての実験は、全国の動物実験委員会によって承認されています。 1. 準備 すべてのソリューションを準備し、特記されない場合はで部屋の温度を維持します。Dispose が使用される材料およびソリューション廃棄物規則に従ってください。 使用当所と ICR ザイモグラム株、どちらかの性別と年齢 4-12 週の間。C57BL/6 株を使用している場合手順 1.3.2 でケタミ…

Representative Results

このプロトコルは、マウス角膜への摩耗損傷を負わせるモデルについて説明し、従うし、摩耗後の癒しのプロセスを視覚化する方法を示唆しています。最近では、創傷治癒の6中に角膜上皮幹細胞の役割を研究するこのメソッドを採用しました。確立されたツールの使用は正常な摩耗実験への鍵です。我々 などは、擦り傷6,<…

Discussion

負傷メソッドは、角膜の恒常性と病態のさまざまな側面を研究するための人気のあるツールです。耐摩耗性モデルでは、眼科に関連する問題に対処するため、よく制御された方法を提供しています。ただし、プロトコルの特定の重要なポイントは強調する価値が。特に、獣医、創傷治癒のタイムライン、および結果について説明詳細はザイモグラム技研や ICR 株式での使用に最適化されたが?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

カイサ Ikkala 中央研究質問への実装中に後でだけでなく、彼女の貴重な技術支援と洞察力に富んだヘルプこのメソッドを実現するときのために感謝したいと思います。獣医の仕事のガイドラインの計画に彼女の助けのため実験動物センターとアンナ Meller に感謝したいと思いますも。

Materials

NMRI mouse Envigo 275
0.9% NaCl use sterile
Medetomidine Vetmedic Vnr087896 Market name: Cepetor Vet
Ketamine Intervet Vnr511485 Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin Invidior 3015248 Market name: Temgesic
Atipamezol Orion Pharma Vnr471953 Market name: Antisedan Vet
Carprofen Norbrook Vnr027579 Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment Dechra Vnr080899 Market name: Isathal
Fluorescein salt Sigma-Aldrich F6377
Phosphate-buffered saline solution PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) Algerbrush 6.39768E+11
Cobalt Blue pen light SP Services DE/003
Hot plate Kunz Instruments 2007-0217
Digital SLR camera Nikon D80
Adjustable camera arm and clamp Neewer 10086132 Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp Prisma
Soft wipe KimtechScience 7552
CO2 chamber
Dissection toolset Fine Science Tools
Syringes Beckton Dickinson 303172
26G needles Beckton Dickinson 303800
2 mL Eppendorf tube Sarstedt 689
Tissue casette Sakura Finetech 4118F
Tissue processing machine ASP200S Leica
Xylene VWR UN1307
Paraffin wax Millipore K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm Sakura Finetech 4123
Microtome Microm HM355
Water bath for sectioning Orthex 60591
Water bath for sectioning Leica HI1210
Microtome blade Feather S35
Glass slide Th.Geyer GmbH & Co. 7,695,019
Ultrapure water Millipore MPGP04001 MilliQ
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 PFA

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Cite This Article
Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing. J. Vis. Exp. (137), e58071, doi:10.3791/58071 (2018).

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