Denne protokollen beskriver en metode å påføre en slitasje på okulær overflaten av musen, og følge såret helbredelsesprosessen etter. Protokollen utnytter en okulær burr delvis fjerne overflaten epitel i øyet i anaesthetized mus.
Murine hornhinnen gir en utmerket modell for å studere sårtilheling. Hornhinnen er det ytterste laget av øyet, og dermed er den første forsvaret til skade. Den vanligste typen øye skade i klinikken er faktisk en hornhinnen avsliting. Her benytter vi en okulær burr å indusere en slitasje resulterer i fjerning av hornhinnen epitel i vivo på bedøvet mus. Denne metoden gir mulighet for målrettet og reproduserbar epithelial avbrudd, røres andre områder. I tillegg vi beskrive visualisering av abraded epitel med fluorescein flekker og gi konkrete råd om hvordan å visualisere abraded hornhinnen. Deretter følger vi tidslinjen i sårheling 0, 18 og 72 h etter slitasje, inntil såret er re epithelialized. Epitel slitasje modell av hornhinnen skade er ideell for studier av epitelial celle spredning, migrasjon og nytt epithelialization av hornhinnen lag. Denne metoden er imidlertid ikke optimalt å studere stromal aktivisering under sårheling, fordi den okulær burr ikke trenge til stromal cell lag. Denne metoden er også egnet for klinisk bruk, for eksempel pre-klinisk test av narkotika.
Epiteliale lag mange organer er utsatt for skader. Men inneholder de også muligheten til å kompensere for vev tap gjennom sårtilheling. Hornhinnen tilbyr en utmerket modell for å studere sårtilheling. Den danner den eksterne overflaten gir et beskyttende lag for følsom okulær maskiner. Dermed fungerer hornhinnen som en fysisk barriere mot patogener og vanntap. Det består av tre lag. epitel, stroma og endotelet. Epitel i hornhinnen utgjør det ytterste laget av hornhinnen. Epitelceller opprettholde funksjonen barriere av hornhinnen ved holdt seg strengt til hverandre gjennom tett veikryss1,2,3. En acellular hornhinnen kjelleren membran, Bowmans membran, skiller epitel fra det omfattende stroma, som inneholder ildfaste keratocytes. Under stroma kanal endotelceller næringsstoffer, vann og oksygen til øvre laget.
Hornhinnen avsliting er svært vanlig i klinikken4. Skader på hornhinnen er forskjellige, men skyldes hovedsakelig små partikler som støv eller sand, riper eller andre fremmedelementer. Protokollen beskrevet her tar sikte på å gjengi en klinisk relevant type hornhinnen epithelial slitasje. Dermed gir denne protokollen en kontrollerbar og banebrytende metode for klinikere og hornhinnen forskere i egne studier. Vi har utført i vivo skade reparasjon analysen på murine hornhinnen ved slipeenhet vev med en sløv okulær burr, den Algerbrush II. Her vi målrette slitasje bare til sentrale hornhinnen epitel og la de andre delene av orgelet uten skade. Dermed protokollen er ideelt å studere hornhinnen tarmepitelet dynamics eller kjelleren membranen under re epithelialization, celle migrasjon, spredning og differensiering i vivo5. Nylig, denne modellen ble brukt til å analysere stamfar celle dynamikk i murine hornhinnen samt å avsløre kapasiteten til differensiert hornhinnen epitelceller med å opprette hornhinnen stamcelleforskningen nisje etter skade6,7. Etter slitasje, hornhinnen returnerer til normal åpenhet og strekkfasthet. Interessant, viste en studie utført i vitro at re epithelialization skjer uten økt celle spredning8. Denne protokollen beskriver tidslinjen uavbrutt healing i murine hornhinnen. Metoden gjelder dermed å teste effekten av legemidler på healing mønstre og hastighet.
Hornhinnen er mye brukt for sårheling studier. Men har mange studier stolt på andre modeller av skade. En veletablert modell av hornhinnen skade er alkalisk brenne som utføres ved å bruke natriumhydroksid (NaOH) med eller uten filter papir på hornhinnen overflaten9. Alkaliske eksponering resulterer i en stor og diffus skade som påvirker ikke bare hornhinnen epitel, men også conjunctiva og stroma9,10. Sterke alkaliske løsninger har vist å indusere hornhinnen sår, opacification og neovascularization9. Inflammatoriske celler invadere stroma vanligvis innen 6 h og forblir der til 24 h11. Dermed er alkaliske skade en tilrådelig metode i studier knyttet til stromal aktivisering. En annen type kjemisk skade kan bli påført ved å bruke dimethyl sulfoxide (DMSO) på hornhinnen9,10. Andre vanlige skader modeller inkluderer incisional sår som trenger gjennom stroma og keratectomy sår, som er begrenset til den øvre delen av stroma14,15. Disse metodene er også nyttig å svare på spørsmål om stromal sårtilheling. Ulike skader modeller har sine egne fordeler og ulemper. Slitasje eller rensing, av hornhinnen epitel ble først utviklet bruker sløv skalpeller eller blader på ex vivo hornhinner16. Denne metoden har senere vært brukt i vivo på mus, rotte og kanin17,18,19,20,21,22. Bruker den okulær burr (figur 1), fjerne vi bare en valgt region av epitel, la resten av epitel upåvirket. På denne måten er det mulig å målrette epithelial fjerning til forskjellige deler av hornhinnen. I tillegg kan slitasje størrelsen vurderes med fluorescein flekker. Videre følger her vi slitasje nedleggelse i helbredende perioden.
Denne metoden utgjør flere fordeler i) inkludert svært presis plassering av slitasje området, som ikke er mulig med kjemisk skade, ii) avsliting er raske til å utføre og iii) det er ikke-invasiv. Her beskriver vi metoden med outbred NMRI musen som modell, men dette kan brukes til det store utvalget av musen genetisk modeller og rotte og hare, og dette er vanlige modeller brukes til å studere menneskelig hornhinnen avbrudd.
Såret er populære verktøy å studere ulike aspekter av hornhinnen homeostase og patologi. Slitasje modellen tilbyr en godt kontrollert metode for å løse aktuelle problemer i Oftalmologi. Visse kritiske punkter i protokollen er imidlertid verdt å vektlegge. Spesielt detaljene beskrevet om veterinærmedisin, sår helbredelse tidslinjen og resultatet er optimalisert for bruk med outbred NMRI og ICR aksjer, men kan variere mellom stammer mus26. Med denne protokollen forblir forsøksdyr bedøvet …
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Kaisa Ikkala for henne uvurderlig kundestøtte og innsiktsfulle hjelp når virkeliggjøre denne metoden og senere implementering til våre sentrale problemstillinger. Vi vil også gjerne takke laboratorium dyr senter og Anna Meller hennes hjelp med retningslinjer av veterinær arbeidet.
NMRI mouse | Envigo | 275 | |
0.9% NaCl | use sterile | ||
Medetomidine | Vetmedic | Vnr087896 | Market name: Cepetor Vet |
Ketamine | Intervet | Vnr511485 | Market name: Ketaminol Vet |
Buprenorfin | Invidior | 3015248 | Market name: Temgesic |
Atipamezol | Orion Pharma | Vnr471953 | Market name: Antisedan Vet |
Carprofen | Norbrook | Vnr027579 | Market name: Norocarp Vet |
1% fucidin acid eye ointment | Dechra | Vnr080899 | Market name: Isathal |
Fluorescein salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
Phosphate-buffered saline solution | PBS | ||
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) | Algerbrush | 6.39768E+11 | |
Cobalt Blue pen light | SP Services | DE/003 | |
Hot plate | Kunz Instruments | 2007-0217 | |
Digital SLR camera | Nikon | D80 | |
Adjustable camera arm and clamp | Neewer | 10086132 | Height 28 cm |
Table lamp with a flexible arm and a clamp | Prisma | ||
Soft wipe | KimtechScience | 7552 | |
CO2 chamber | |||
Dissection toolset | Fine Science Tools | ||
Syringes | Beckton Dickinson | 303172 | |
26G needles | Beckton Dickinson | 303800 | |
2 mL Eppendorf tube | Sarstedt | 689 | |
Tissue casette | Sakura Finetech | 4118F | |
Tissue processing machine ASP200S | Leica | ||
Xylene | VWR | UN1307 | |
Paraffin wax | Millipore | K95523361 | |
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm | Sakura Finetech | 4123 | |
Microtome | Microm | HM355 | |
Water bath for sectioning | Orthex | 60591 | |
Water bath for sectioning | Leica | HI1210 | |
Microtome blade | Feather | S35 | |
Glass slide | Th.Geyer GmbH & Co. | 7,695,019 | |
Ultrapure water | Millipore | MPGP04001 | MilliQ |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | PFA |