سحجه الظهارة القرنية مع لدغ العين كنموذج للقرنية التئام الجروح
Summary
هذا البروتوكول وصف أسلوب لتلحق التآكل على سطح العين للماوس، ومتابعة الجرح شفاء العملية بعد ذلك. البروتوكول يستفيد من لدغ العين جزئيا إزالة ظهارة سطح العين في الفئران فظاعتها.
Abstract
القرنية مورين يوفر نموذجا ممتازا لدراسة التئام الجروح. القرنية هي الطبقة الخارجية للعين، وبالتالي هو الدفاع الأولى للإصابة. في الواقع، النوع الأكثر شيوعاً من إصابة العين وجدت في عيادة كشط القرنية. هنا، فنحن نستخدم لدغ العين للحث كشط أسفر عن إزالة ظهارة القرنية في فيفو على تخديره من الفئران. يسمح هذا الأسلوب لتعطيل الظهارية المستهدفة واستنساخه، ترك مناطق أخرى سليمة. وبالإضافة إلى ذلك، وصف تصور ظهارة الحبيبات مع تلطيخ fluorescein، وتقديم المشورة ملموسة بشأن كيفية تصور القرنية الحبيبات. ثم، نحن نتبع الجدول الزمني للجرح شفاء 0, 18 و 72 ح بعد الكشط، حتى الجرح هو إعادة متظهرنه. نموذج إصابة القرنية الظهارية كشط مثالي للدراسات المتعلقة بانتشار الخلايا الظهارية، والهجرة، وإعادة epithelialization من طبقات القرنية. ومع ذلك، هذا الأسلوب ليس الأمثل لدراسة تفعيل stromal أثناء التئام الجروح، نظراً لعدم اختراق لدغ العين إلى طبقات الخلايا اللحمية. هذا الأسلوب أيضا مناسبة للتطبيقات السريرية، على سبيل المثال، قبل الإكلينيكية اختبار فعالية العقاقير.
Introduction
طبقات طلائي أجهزة عديدة يتعرضون لإصابات. بيد أنها تحتوي أيضا على القدرة على التعويض عن فقدان الأنسجة من خلال التئام الجروح. القرنية يقدم نموذجا ممتازا لدراسة التئام الجروح. أشكال السطح الخارجي للعين، ويوفر طبقة واقية لآلية العين الحساسة. وهكذا، القرنية تعمل كحاجز مادي لمسببات الأمراض وفقدان المياه. وهو يتألف من ثلاث طبقات؛ ظهارة وسدى والبطانة. ظهارة القرنية تشكل الطبقة الخارجية للقرنية. الخلايا الظهارية الحفاظ على وظيفة الحاجز القرنية بالتقيد بدقة ببعضها البعض عن طريق تقاطعات ضيق1،،من23. غشاء القرنية اللاخلوي الطابق السفلي، غشاء بومان، يفصل في الظهارة ستروما واسعة النطاق، التي تحتوي على كيراتوسيتيس المقاوم للحرارة. تحت ستروما، القناة خلايا بطانية بالمواد الغذائية والمياه والأوكسجين إلى الطبقة العليا.
سحجات القرنية شائعة جداً في عيادة4. إصابات القرنية متنوعة، ولكن إلى حد كبير تسببها جزيئات صغيرة مثل الغبار أو الرمل أو الخدوش أو كائنات أخرى أجنبية. ووصف البروتوكول هنا تهدف إلى استنساخ نوع ذات صلة سريرياً كشط القرنية الظهارية. عند القيام بذلك، يوفر هذا البروتوكول طريقة يمكن السيطرة عليها والاصيلة للأطباء والعلماء القرنية لتنفيذ الدراسات الخاصة بهم. ونحن قد يؤديها في فيفو إصابة إصلاح مقايسة على القرنية مورين كاشط الأنسجة مع لدغ العين المتبلدة، ثانيا الجيربروش. هنا، نحن نستهدف الكشط فقط ظهارة القرنية المركزية وترك أجزاء أخرى من الجهاز دون أضرار. وهكذا، البروتوكول المثالي لدراسة ديناميات الخلايا الظهارية القرنية أو الأغشية الطابق السفلي أثناء إعادة ابيثيلياليزيشن، خلية الهجرة والانتشار والتمايز في فيفو5. مؤخرا، تم استخدام هذا النموذج لتحليل ديناميات الخلايا السلف في القرنية مورين، وكذلك فيما يتعلق بكشف النقاب عن قدرة الخلايا الظهارية القرنية المتباينة في إعادة تأسيس مكانة الخلايا الجذعية القرنية بعد إصابة6،7. عقب الكشط، ترجع القرنية بشفافيته المعتادة والشد. من المثير للاهتمام، أوضحت دراسة في المختبر أن epithelialization إعادة يحدث دون انتشار الخلايا زيادة8. ويصف هذا البروتوكول الجدول الزمني للشفاء دون انقطاع في القرنية مورين. وبالتالي ينطبق الأسلوب لاختبار أثر المخدرات على شفاء أنماط والسرعة.
وقد استخدمت على نطاق واسع القرنية للجرح شفاء الدراسات. ومع ذلك، قد اعتمدت العديد من الدراسات على نماذج أخرى للإصابة. نموذج راسخة لإصابة القرنية هو حرق القلوية التي يتم تنفيذها بواسطة تطبيق هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) مع أو بدون تصفية الورق على سطح القرنية9. التعرض القلوية ينتج ضرر كبير ومنتشر يؤثر على ظهارة القرنية، ليس فقط، بل أيضا الملتحمة وسدى9،10. حلول قلوية قوية تبين أن حمل قرحة القرنية، عتامة ونيوفاسكولاريزيشن9. الخلايا التحريضية تغزو ستروما عادة ضمن ح 6 والبقاء هناك حتى 24 ح11. هكذا، إصابة القلوية أسلوب المستحسن في الدراسات المتعلقة بالتنشيط stromal. نوع آخر من الإصابات الكيميائية يمكن إنزالها بتطبيق ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) في9،القرنية10. وتشمل نماذج الإصابة شائعة أخرى عن الجروح التي تخترق عن طريق الجروح ستروما وكيراتيكتومي، التي تقتصر على الجزء العلوي من ال14،ستروما15. هذه الأساليب أيضا مفيدة للإجابة على الأسئلة بخصوص اللحمية التئام الجروح. نماذج مختلفة من الإصابة لها مزاياها وعيوبها. تم تطوير الكشط، أو ديبريديمينت، من ظهارة القرنية أولاً باستخدام المشارط المتبلدة أو شفرات على السابقين فيفو القرنيات16. وكان هذا الأسلوب في وقت لاحق المستخدمة في فيفو على الماوس وفار وارنب17،،من1819،20،،من2122. استخدام لدغ العين (الشكل 1)، نزيل فقط منطقة مختارة من الظهارة، تاركاً بقية الظهارة لم تتأثر. وبهذه الطريقة، فمن الممكن التحديد تستهدف إزالة الظهارية إلى أجزاء مختلفة من القرنية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم حجم الاحتكاك مع صبغة فلوريسسين. وعلاوة على ذلك، هنا ونحن نتابع الإغلاق كشط خلال فترة الشفاء.
يشكل هذا الأسلوب العديد من المزايا، ط) بما في ذلك الموقع الدقيق لموقع الكشط، وغير ممكن مع الإصابات الكيميائية، الثاني) التآكل السريع لأداء، والثالث) غير الغازية. هنا، نحن تصف طريقة استخدام الماوس الرنين أووتبريد كنموذج، ولكن هذا يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من النماذج الوراثية الماوس، وكذلك للفئران والأرانب، وهي النماذج الشائعة المستخدمة لدراسة اضطراب القرنية البشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
أساليب إصابة أدوات شعبية لدراسة مختلف جوانب التوازن القرنية والأمراض. يوفر الطراز كشط أسلوب التحكم جيدا لمعالجة المشاكل ذات الصلة في طب العيون. ومع ذلك، بعض النقاط الحرجة في البروتوكول يجدر التشديد. جدير بالذكر أن التفاصيل المحددة فيما يتعلق بالطب البيطري، والجرح الشفاء الجدول الزمني، و…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر عكلة كيسه لها المساعدة التقنية لا تقدر بثمن ومساعدة الثاقبة عند تفعيل هذا الأسلوب كذلك في وقت لاحق أثناء التنفيذ على أسئلتنا البحوث المركزية. ونود أيضا أن أشكر مركز الحيوانات المختبرية وأنا ميلر لمساعدة لها مع تخطيط المبادئ التوجيهية لعمل الطب البيطري.
Materials
| NMRI mouse | Envigo | 275 | |
| 0.9% NaCl | use sterile | ||
| Medetomidine | Vetmedic | Vnr087896 | Market name: Cepetor Vet |
| Ketamine | Intervet | Vnr511485 | Market name: Ketaminol Vet |
| Buprenorfin | Invidior | 3015248 | Market name: Temgesic |
| Atipamezol | Orion Pharma | Vnr471953 | Market name: Antisedan Vet |
| Carprofen | Norbrook | Vnr027579 | Market name: Norocarp Vet |
| 1% fucidin acid eye ointment | Dechra | Vnr080899 | Market name: Isathal |
| Fluorescein salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Phosphate-buffered saline solution | PBS | ||
| Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) | Algerbrush | 6.39768E+11 | |
| Cobalt Blue pen light | SP Services | DE/003 | |
| Hot plate | Kunz Instruments | 2007-0217 | |
| Digital SLR camera | Nikon | D80 | |
| Adjustable camera arm and clamp | Neewer | 10086132 | Height 28 cm |
| Table lamp with a flexible arm and a clamp | Prisma | ||
| Soft wipe | KimtechScience | 7552 | |
| CO2 chamber | |||
| Dissection toolset | Fine Science Tools | ||
| Syringes | Beckton Dickinson | 303172 | |
| 26G needles | Beckton Dickinson | 303800 | |
| 2 mL Eppendorf tube | Sarstedt | 689 | |
| Tissue casette | Sakura Finetech | 4118F | |
| Tissue processing machine ASP200S | Leica | ||
| Xylene | VWR | UN1307 | |
| Paraffin wax | Millipore | K95523361 | |
| Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm | Sakura Finetech | 4123 | |
| Microtome | Microm | HM355 | |
| Water bath for sectioning | Orthex | 60591 | |
| Water bath for sectioning | Leica | HI1210 | |
| Microtome blade | Feather | S35 | |
| Glass slide | Th.Geyer GmbH & Co. | 7,695,019 | |
| Ultrapure water | Millipore | MPGP04001 | MilliQ |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | PFA |
References
- Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).
- Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal. Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).
- Sugrue, S. P., Zieske, J. D. ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions. Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).
- Jackson, H. Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions. British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing. Stem Cells. , (2018).
- Nasser, W., et al. Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury. Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).
- Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 936 (2012).
- Bai, J. -. Q., Qin, H. -. F., Zhao, S. -. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Chan, M. F., et al. Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury. Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).
- Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
- Amitai-Lange, A., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
- Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).
- Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis. Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).
- Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin "purse string" filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).
- Lyu, J., Joo, C. -. K. Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).
- Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Science Reports. 5, 14776 (2015).
- Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).
- Stepp, M. A., Zhu, L. Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).
- Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
- . Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018)
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
- Suzuki, K. Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).
- Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds. Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).
- Boote, C., et al. Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).
- Pal-Ghosh, S., et al. MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice. Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).
