Hoornvlies epitheliale schuren met oogbeschadigingen en/of Burr als een Model voor hoornvlies wondgenezing

Summary

Dit protocol beschrijft een methode om een slijtage aan de oculaire oppervlakte van de muis toebrengen, en volgen de wond genezingsproces daarna. Het protocol maakt gebruik van een oogbeschadigingen en/of burr gedeeltelijk verwijderen van de oppervlakte-epitheel van het oog bij verdoofde muizen.

Abstract

Het lymfkliertest hoornvlies biedt een uitstekend model om te studeren wondgenezing. Het hoornvlies is de buitenste laag van het oog, en is dus de eerste verdediging aan verwonding. In feite, is het meest voorkomende type oogletsel gevonden in kliniek een hoornvlies schuren. Hier, gebruiken wij een oogbeschadigingen en/of burr om te induceren een schuren wat resulteert in de verwijdering van de cornea epitheel in vivo narcose muizen. Deze methode zorgt voor gerichte en reproduceerbare epitheliale ontwrichting, en andere gebieden intact. Bovendien, we beschrijven de visualisatie van het vrijkomen epithelium met fluoresceïne kleuring en concreet advies geven over hoe het vrijkomen hoornvlies visualiseren. Dan, we volgen de tijdlijn voor wond genezing van 0, 18, en 72 uur na schuren, totdat de wond is opnieuw epithelialized. Het model van de epitheliale schuren van hoornvlies letsel is ideaal voor studies betreffende epitheliale celproliferatie, migratie en opnieuw epithelialization van het hoornvlies lagen. Deze methode is echter niet optimaal te bestuderen stromale activering tijdens de wondgenezing, omdat de oogbeschadigingen en/of burr niet tot de stromale cel lagen doordringen doet. Deze methode is ook geschikt voor klinische toepassingen, bijvoorbeeld, pre-klinische test voor drug effectiviteit.

Introduction

Epitheelweefsel lagen van talrijke organen worden blootgesteld aan verwondingen. Ze bevatten echter ook de mogelijkheid om te compenseren voor het verlies van weefsel door de wondgenezing. Het hoornvlies biedt een uitstekend model om te studeren wondgenezing. Het vormt het buitenoppervlak van het oog en vormt een beschermende laag voor de gevoelige oogbeschadigingen en/of machines. Hoornvlies fungeert dus als een fysieke barrière voor ziekteverwekkers en waterverlies. Het bestaat uit drie lagen; epitheel, stroma en endotheel. Het epitheel van het hoornvlies maakt de buitenste laag van het hoornvlies. Epitheliale cellen behouden de barrièrefunctie van het hoornvlies door het strikt vasthouden aan elkaar tot en met strakke kruispunten^1,2,3. Een Acellulair hoornvlies membraan van de kelder, de Bowman membraan, scheidt het epitheel van de uitgebreide stroma, waarin vuurvaste keratocytes. Onder de stroma kanaal endotheliale cellen voedingsstoffen, water en zuurstof naar de bovenste laag.

Hoornvlies schaafwonden zijn heel gebruikelijk in de kliniek⁴. Verwondingen aan het hoornvlies zijn divers, maar grotendeels worden veroorzaakt door kleine deeltjes zoals stof of zand, krassen of andere vreemde voorwerpen. Het protocol beschreven hier beoogt een klinisch relevante soort hoornvlies epitheliale schuren te reproduceren. Dit protocol biedt daarbij een controleerbaar en baanbrekende methode voor clinici en wetenschappers van de cornea te implementeren in hun eigen studies. We hebben een in vivo -bepaling van het schade-reparatie uitgevoerd op het lymfkliertest hoornvlies door wordt het weefsel met een dulled oogbeschadigingen en/of burr, de Algerbrush II bekrast. Hier, wij de doelstelling van de schuren alleen aan de centrale hoornvlies epitheel en laat de andere delen van het orgel zonder schade. Dus, het protocol is ideaal om studie hoornvlies epitheliale cel dynamics of het membraan van de kelder tijdens Re epithelialization, cel migratie, de proliferatie en differentiatie in vivo⁵. Onlangs, dit model werd gebruikt voor het analyseren van progenitor cel dynamiek in het lymfkliertest hoornvlies eveneens over het onthullen van de capaciteit van de gedifferentieerde hoornvlies epitheliale cellen in het herstel van de niche van de cel van de stam van het hoornvlies na letsel^6,7. Na het schuren, het hoornvlies keert terug naar haar normale transparantie en treksterkte. Interessant, een in vitro studie aangegeven dat opnieuw epithelialization gebeurt zonder verhoogde cel proliferatie⁸. Dit protocol beschrijft de tijdlijn van ononderbroken genezing in het lymfkliertest hoornvlies. De methode is dus die van toepassing zijn voor het testen van het effect van drugs op genezing patronen en snelheid.

Het hoornvlies is uitgebreid gebruikt voor wond genezing studies. Vele studies hebben echter vertrouwd op andere modellen van letsel. Een reeds lang gevestigde model van hoornvlies letsel is het alkalische branden die wordt uitgevoerd door het toepassen van natriumhydroxide (NaOH) met of zonder filtreerpapier op het hoornvlies oppervlakte⁹. Alkalische blootstelling resulteert in een grote en diffuse schade raakt niet alleen het hoornvlies epitheel, maar ook het bindvlies en stroma^9,10. Sterke basische oplossingen is gebleken voor het opwekken van de cornea ulcera, troebelingen, en neovascularization⁹. Ontstekingscellen binnenvallen het stroma meestal binnen 6 uur en blijft er tot 24 h¹¹. Alkalische letsel is dus een raadzaam methode in studies met betrekking tot stromale activering. Een ander soort chemische letsel kan worden toegebracht door dimethylsulfoxide (DMSO) toe te passen op het hoornvlies^9,10. Andere veelgebruikte letsel-modellen zijn incisional wonden die dringen door de stroma en keratectomy wonden, die beperkt tot het bovenste deel van het stroma^{14,15 zijn}. Deze methoden zijn ook handig voor het beantwoorden van vragen over stromale wondgenezing. Verschillende letsel modellen hebben hun eigen voor- en nadelen. Schuren, of debridement, van het hoornvlies epithelium werd eerst ontwikkeld met behulp van afgestompt scalpels of messen op ex vivo hoornvlies¹⁶. Deze methode is later gebruikt in vivo op muis, rat en konijn^{17,18,19,20,21,22}. Gebruik de oogbeschadigingen en/of burr (Figuur 1), verwijderen we alleen een geselecteerde regio van het epitheel, en de rest van het epithelium onaangetast. Deze manier, is het mogelijk om precies de epitheliale verhuizing naar verschillende delen van het hoornvlies. Daarnaast kan de grootte van de schuur met fluoresceïne kleuring worden beoordeeld. Bovendien, hier volgen wij schuren sluiting de helende periode.

Deze methode brengt verschillende voordelen, i) met inbegrip van de precieze locatie van schuren site, die niet mogelijk met chemische schade is, ii) de schuren is snel uit te voeren, en iii) het is niet-invasief. Hierin beschrijven we de methode met behulp van de outbred NMRI-muis als een model, maar dit kan worden toegepast voor de enorme hoeveelheid genetische muismodellen, alsmede voor de rat en het konijn, die gemeenschappelijke modellen gebruikt bij het bestuderen van de menselijke verstoring van het hoornvlies.

Protocol

Alle experimenten zijn goedgekeurd door de board van het nationale dierlijke experiment. 1. voorbereiding Alle oplossingen voor te bereiden en bewaar op kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven. Volg afvalverwijdering verordeningen Gooi gebruikte materialen en oplossingen. Gebruik NMRI en ICR outbred voorraden, leeftijd tussen 4-12 weken en beide geslachten. Als de stam van de C57BL/6, volgt u de ketamine-medetomidine-voorbereiding methode in stap 1.3.2. Voor andere stapp…

Representative Results

Dit protocol beschrijft een model om te berokkenen slijtage schade aan het hoornvlies muis en stelt voor het visualiseren van het genezingsproces na schuren te volgen. Onlangs, we gebruikt deze methode om te studeren van de rol van hoornvlies epitheliale voorlopercellen tijdens wond genezing van6. Het gebruik van gevestigde tools is de sleutel tot een succesvolle schuren-experiment. Wij, en anderen, hebben de Algerbrush II oogbeschadigingen en/of burr (<strong clas…

Discussion

Verwonden methoden zijn populaire tools om te bestuderen van de verschillende aspecten van het hoornvlies homeostase en pathologieën. Het schuren-model biedt een goed gecontroleerde methode om aan te pakken problemen in de oogheelkunde. Er zijn echter bepaalde kritische punten in het protocol waard het benadrukken. Met name de details beschreven met betrekking tot de uitoefening van de diergeneeskunde, wond genezing tijdlijn en resultaat zijn geoptimaliseerd voor gebruik met outbred NMRI en ICR voorraden, maar kunnen va…

Materials

NMRI mouse	Envigo	275
0.9% NaCl			use sterile
Medetomidine	Vetmedic	Vnr087896	Market name: Cepetor Vet
Ketamine	Intervet	Vnr511485	Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin	Invidior	3015248	Market name: Temgesic
Atipamezol	Orion Pharma	Vnr471953	Market name: Antisedan Vet
Carprofen	Norbrook	Vnr027579	Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment	Dechra	Vnr080899	Market name: Isathal
Fluorescein salt	Sigma-Aldrich	F6377
Phosphate-buffered saline solution			PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)	Algerbrush	6.39768E+11
Cobalt Blue pen light	SP Services	DE/003
Hot plate	Kunz Instruments	2007-0217
Digital SLR camera	Nikon	D80
Adjustable camera arm and clamp	Neewer	10086132	Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp	Prisma
Soft wipe	KimtechScience	7552
CO2 chamber
Dissection toolset	Fine Science Tools
Syringes	Beckton Dickinson	303172
26G needles	Beckton Dickinson	303800
2 mL Eppendorf tube	Sarstedt	689
Tissue casette	Sakura Finetech	4118F
Tissue processing machine ASP200S	Leica
Xylene	VWR	UN1307
Paraffin wax	Millipore	K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm	Sakura Finetech	4123
Microtome	Microm	HM355
Water bath for sectioning	Orthex	60591
Water bath for sectioning	Leica	HI1210
Microtome blade	Feather	S35
Glass slide	Th.Geyer GmbH & Co.	7,695,019
Ultrapure water	Millipore	MPGP04001	MilliQ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA