Summary

Hoornvlies epitheliale schuren met oogbeschadigingen en/of Burr als een Model voor hoornvlies wondgenezing

Published: July 10, 2018
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft een methode om een slijtage aan de oculaire oppervlakte van de muis toebrengen, en volgen de wond genezingsproces daarna. Het protocol maakt gebruik van een oogbeschadigingen en/of burr gedeeltelijk verwijderen van de oppervlakte-epitheel van het oog bij verdoofde muizen.

Abstract

Het lymfkliertest hoornvlies biedt een uitstekend model om te studeren wondgenezing. Het hoornvlies is de buitenste laag van het oog, en is dus de eerste verdediging aan verwonding. In feite, is het meest voorkomende type oogletsel gevonden in kliniek een hoornvlies schuren. Hier, gebruiken wij een oogbeschadigingen en/of burr om te induceren een schuren wat resulteert in de verwijdering van de cornea epitheel in vivo narcose muizen. Deze methode zorgt voor gerichte en reproduceerbare epitheliale ontwrichting, en andere gebieden intact. Bovendien, we beschrijven de visualisatie van het vrijkomen epithelium met fluoresceïne kleuring en concreet advies geven over hoe het vrijkomen hoornvlies visualiseren. Dan, we volgen de tijdlijn voor wond genezing van 0, 18, en 72 uur na schuren, totdat de wond is opnieuw epithelialized. Het model van de epitheliale schuren van hoornvlies letsel is ideaal voor studies betreffende epitheliale celproliferatie, migratie en opnieuw epithelialization van het hoornvlies lagen. Deze methode is echter niet optimaal te bestuderen stromale activering tijdens de wondgenezing, omdat de oogbeschadigingen en/of burr niet tot de stromale cel lagen doordringen doet. Deze methode is ook geschikt voor klinische toepassingen, bijvoorbeeld, pre-klinische test voor drug effectiviteit.

Introduction

Epitheelweefsel lagen van talrijke organen worden blootgesteld aan verwondingen. Ze bevatten echter ook de mogelijkheid om te compenseren voor het verlies van weefsel door de wondgenezing. Het hoornvlies biedt een uitstekend model om te studeren wondgenezing. Het vormt het buitenoppervlak van het oog en vormt een beschermende laag voor de gevoelige oogbeschadigingen en/of machines. Hoornvlies fungeert dus als een fysieke barrière voor ziekteverwekkers en waterverlies. Het bestaat uit drie lagen; epitheel, stroma en endotheel. Het epitheel van het hoornvlies maakt de buitenste laag van het hoornvlies. Epitheliale cellen behouden de barrièrefunctie van het hoornvlies door het strikt vasthouden aan elkaar tot en met strakke kruispunten1,2,3. Een Acellulair hoornvlies membraan van de kelder, de Bowman membraan, scheidt het epitheel van de uitgebreide stroma, waarin vuurvaste keratocytes. Onder de stroma kanaal endotheliale cellen voedingsstoffen, water en zuurstof naar de bovenste laag.

Hoornvlies schaafwonden zijn heel gebruikelijk in de kliniek4. Verwondingen aan het hoornvlies zijn divers, maar grotendeels worden veroorzaakt door kleine deeltjes zoals stof of zand, krassen of andere vreemde voorwerpen. Het protocol beschreven hier beoogt een klinisch relevante soort hoornvlies epitheliale schuren te reproduceren. Dit protocol biedt daarbij een controleerbaar en baanbrekende methode voor clinici en wetenschappers van de cornea te implementeren in hun eigen studies. We hebben een in vivo -bepaling van het schade-reparatie uitgevoerd op het lymfkliertest hoornvlies door wordt het weefsel met een dulled oogbeschadigingen en/of burr, de Algerbrush II bekrast. Hier, wij de doelstelling van de schuren alleen aan de centrale hoornvlies epitheel en laat de andere delen van het orgel zonder schade. Dus, het protocol is ideaal om studie hoornvlies epitheliale cel dynamics of het membraan van de kelder tijdens Re epithelialization, cel migratie, de proliferatie en differentiatie in vivo5. Onlangs, dit model werd gebruikt voor het analyseren van progenitor cel dynamiek in het lymfkliertest hoornvlies eveneens over het onthullen van de capaciteit van de gedifferentieerde hoornvlies epitheliale cellen in het herstel van de niche van de cel van de stam van het hoornvlies na letsel6,7. Na het schuren, het hoornvlies keert terug naar haar normale transparantie en treksterkte. Interessant, een in vitro studie aangegeven dat opnieuw epithelialization gebeurt zonder verhoogde cel proliferatie8. Dit protocol beschrijft de tijdlijn van ononderbroken genezing in het lymfkliertest hoornvlies. De methode is dus die van toepassing zijn voor het testen van het effect van drugs op genezing patronen en snelheid.

Het hoornvlies is uitgebreid gebruikt voor wond genezing studies. Vele studies hebben echter vertrouwd op andere modellen van letsel. Een reeds lang gevestigde model van hoornvlies letsel is het alkalische branden die wordt uitgevoerd door het toepassen van natriumhydroxide (NaOH) met of zonder filtreerpapier op het hoornvlies oppervlakte9. Alkalische blootstelling resulteert in een grote en diffuse schade raakt niet alleen het hoornvlies epitheel, maar ook het bindvlies en stroma9,10. Sterke basische oplossingen is gebleken voor het opwekken van de cornea ulcera, troebelingen, en neovascularization9. Ontstekingscellen binnenvallen het stroma meestal binnen 6 uur en blijft er tot 24 h11. Alkalische letsel is dus een raadzaam methode in studies met betrekking tot stromale activering. Een ander soort chemische letsel kan worden toegebracht door dimethylsulfoxide (DMSO) toe te passen op het hoornvlies9,10. Andere veelgebruikte letsel-modellen zijn incisional wonden die dringen door de stroma en keratectomy wonden, die beperkt tot het bovenste deel van het stroma14,15 zijn. Deze methoden zijn ook handig voor het beantwoorden van vragen over stromale wondgenezing. Verschillende letsel modellen hebben hun eigen voor- en nadelen. Schuren, of debridement, van het hoornvlies epithelium werd eerst ontwikkeld met behulp van afgestompt scalpels of messen op ex vivo hoornvlies16. Deze methode is later gebruikt in vivo op muis, rat en konijn17,18,19,20,21,22. Gebruik de oogbeschadigingen en/of burr (Figuur 1), verwijderen we alleen een geselecteerde regio van het epitheel, en de rest van het epithelium onaangetast. Deze manier, is het mogelijk om precies de epitheliale verhuizing naar verschillende delen van het hoornvlies. Daarnaast kan de grootte van de schuur met fluoresceïne kleuring worden beoordeeld. Bovendien, hier volgen wij schuren sluiting de helende periode.

Deze methode brengt verschillende voordelen, i) met inbegrip van de precieze locatie van schuren site, die niet mogelijk met chemische schade is, ii) de schuren is snel uit te voeren, en iii) het is niet-invasief. Hierin beschrijven we de methode met behulp van de outbred NMRI-muis als een model, maar dit kan worden toegepast voor de enorme hoeveelheid genetische muismodellen, alsmede voor de rat en het konijn, die gemeenschappelijke modellen gebruikt bij het bestuderen van de menselijke verstoring van het hoornvlies.

Protocol

Alle experimenten zijn goedgekeurd door de board van het nationale dierlijke experiment. 1. voorbereiding Alle oplossingen voor te bereiden en bewaar op kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven. Volg afvalverwijdering verordeningen Gooi gebruikte materialen en oplossingen. Gebruik NMRI en ICR outbred voorraden, leeftijd tussen 4-12 weken en beide geslachten. Als de stam van de C57BL/6, volgt u de ketamine-medetomidine-voorbereiding methode in stap 1.3.2. Voor andere stapp…

Representative Results

Dit protocol beschrijft een model om te berokkenen slijtage schade aan het hoornvlies muis en stelt voor het visualiseren van het genezingsproces na schuren te volgen. Onlangs, we gebruikt deze methode om te studeren van de rol van hoornvlies epitheliale voorlopercellen tijdens wond genezing van6. Het gebruik van gevestigde tools is de sleutel tot een succesvolle schuren-experiment. Wij, en anderen, hebben de Algerbrush II oogbeschadigingen en/of burr (<strong clas…

Discussion

Verwonden methoden zijn populaire tools om te bestuderen van de verschillende aspecten van het hoornvlies homeostase en pathologieën. Het schuren-model biedt een goed gecontroleerde methode om aan te pakken problemen in de oogheelkunde. Er zijn echter bepaalde kritische punten in het protocol waard het benadrukken. Met name de details beschreven met betrekking tot de uitoefening van de diergeneeskunde, wond genezing tijdlijn en resultaat zijn geoptimaliseerd voor gebruik met outbred NMRI en ICR voorraden, maar kunnen va…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zouden graag bedanken Kaisa Ikkala voor haar onschatbare hulp van de technische en inzichtelijke hulp bij het actualiseren van deze methode en later tijdens de uitvoering op onze centrale onderzoeksvragen. Wij wil ook het laboratorium dier Center en Anna Meller bedanken voor haar hulp bij het plannen van de richtsnoeren van het veterinaire werk.

Materials

NMRI mouse Envigo 275
0.9% NaCl use sterile
Medetomidine Vetmedic Vnr087896 Market name: Cepetor Vet
Ketamine Intervet Vnr511485 Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin Invidior 3015248 Market name: Temgesic
Atipamezol Orion Pharma Vnr471953 Market name: Antisedan Vet
Carprofen Norbrook Vnr027579 Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment Dechra Vnr080899 Market name: Isathal
Fluorescein salt Sigma-Aldrich F6377
Phosphate-buffered saline solution PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) Algerbrush 6.39768E+11
Cobalt Blue pen light SP Services DE/003
Hot plate Kunz Instruments 2007-0217
Digital SLR camera Nikon D80
Adjustable camera arm and clamp Neewer 10086132 Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp Prisma
Soft wipe KimtechScience 7552
CO2 chamber
Dissection toolset Fine Science Tools
Syringes Beckton Dickinson 303172
26G needles Beckton Dickinson 303800
2 mL Eppendorf tube Sarstedt 689
Tissue casette Sakura Finetech 4118F
Tissue processing machine ASP200S Leica
Xylene VWR UN1307
Paraffin wax Millipore K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm Sakura Finetech 4123
Microtome Microm HM355
Water bath for sectioning Orthex 60591
Water bath for sectioning Leica HI1210
Microtome blade Feather S35
Glass slide Th.Geyer GmbH & Co. 7,695,019
Ultrapure water Millipore MPGP04001 MilliQ
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 PFA

References

  1. Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).
  2. Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal. Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).
  3. Sugrue, S. P., Zieske, J. D. ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions. Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).
  4. Jackson, H. Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions. British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).
  5. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  6. Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing. Stem Cells. , (2018).
  7. Nasser, W., et al. Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury. Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).
  8. Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 936 (2012).
  9. Bai, J. -. Q., Qin, H. -. F., Zhao, S. -. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  10. Chan, M. F., et al. Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury. Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).
  11. Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  12. Amitai-Lange, A., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
  13. Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).
  16. Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis. Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).
  17. Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin "purse string" filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).
  18. Lyu, J., Joo, C. -. K. Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).
  19. Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Science Reports. 5, 14776 (2015).
  20. Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).
  21. Stepp, M. A., Zhu, L. Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).
  22. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  23. . Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018)
  24. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  25. Suzuki, K. Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).
  26. Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).
  27. Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds. Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).
  28. Boote, C., et al. Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).
  29. Pal-Ghosh, S., et al. MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice. Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).
  30. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).

Play Video

Cite This Article
Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing. J. Vis. Exp. (137), e58071, doi:10.3791/58071 (2018).

View Video