Epitheliale Korneaabnutzung mit okulärer Burr als Modell für die Hornhaut Wundheilung

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, einen Abrieb auf der Augenoberfläche der Maus zuzufügen und die Wundheilung danach zu folgen. Das Protokoll nutzt eine augenfällige Grat, teilweise das oberflächenepithel des Auges in narkotisierter Mäuse zu entfernen.

Abstract

Die murine Hornhaut bietet ein hervorragendes Modell um die Wundheilung zu studieren. Die Hornhaut ist die äußerste Schicht des Auges, und somit ist die erste Verteidigungslinie zu Verletzungen. In der Tat ist die häufigste Art von Verletzungen am Auge gefunden in Klinik ein korneaabnutzung. Hier nutzen wir eine augenfällige Grat um einen Abrieb was Entfernung des Hornhaut-Epithel in Vivo an narkotisierten Mäusen zu induzieren. Diese Methode ermöglicht gezielte und reproduzierbare epithelialen Störung, wobei andere Bereiche intakt bleiben. Darüber hinaus wir beschreiben die Visualisierung der abgeriebenen Epithel mit Fluorescein beflecken und liefern konkrete Ratschläge wie man die abgeriebenen Hornhaut zu visualisieren. Dann folgen wir die Zeitleiste der Wundheilung 0, 18 und 72 h nach Abrieb, bis die Wunde wieder epithelialized ist. Die epithelialen Abrieb Modell der Verletzung der Hornhaut ist ideal für Studien zur epithelialen Zell-Proliferation, Migration und Re Epithelisierung der Hornhaut Schichten. Diese Methode ist jedoch nicht optimal Stromazellen Aktivierung bei der Wundheilung, zu studieren, weil der okuläre Grat nicht um die Stromale Zellschichten eindringt. Diese Methode ist auch geeignet für klinische Anwendungen, z. B. der präklinischen Prüfung der Wirksamkeit der Droge.

Introduction

Epitheliale Schichten zahlreiche Organe sind Verletzungen ausgesetzt. Sie enthalten jedoch auch die Möglichkeit zum Ausgleich Gewebeverlust durch Wundheilung. Die Hornhaut bietet ein hervorragendes Modell um die Wundheilung zu studieren. Es bildet die äußere Oberfläche des Auges und bietet eine Schutzschicht für die sensible okuläre Maschinen. So funktioniert Hornhaut als eine physikalische Barriere gegenüber Krankheitserregern und Wasserverlust. Es besteht aus drei Schichten; Epithel, Stroma und Endothel. Das Epithel der Hornhaut bildet die äußerste Schicht der Hornhaut. Epithelzellen pflegen die Barrierefunktion der Hornhaut durch die Einhaltung streng miteinander durch tight Junctions^1,2,3. Eine azelluläre Hornhaut Basalmembran, die Bowman-Membran trennt das Epithel aus der umfangreichen Stroma, das feuerfeste keratozyten enthält. Unter das Stroma Kanal endotheliale Zellen Nährstoffe, Wasser und Sauerstoff, die obere Schicht.

Hornhauterosionen sind sehr häufig in der Klinik⁴. Verletzungen der Hornhaut sind vielfältig, aber vor allem durch kleine Partikel wie Staub oder Sand, Kratzer oder andere Fremdkörper verursacht werden. Das Protokoll beschrieben hier zielt auf eine klinisch relevante Art von epithelialen korneaabnutzung zu reproduzieren. Dabei bietet dieses Protokoll eine kontrollierbare und bahnbrechende Methode für Kliniker und Wissenschaftler Hornhaut, in eigenen Studien zu implementieren. Wir haben eine in Vivo Verletzung Reparatur Assays auf der murinen Hornhaut durch Anrauen des Gewebes mit einer getrübten okuläre Burr, Algerbrush II durchgeführt. Unser Ziel hier, den Abrieb nur auf der zentralen Hornhaut-Epithel und lassen Sie die anderen Teile der Orgel ohne Schaden. So, das Protokoll ist ideal, um Studie Hornhaut Epithelzelle Dynamik oder der Basalmembran während Re Epithelisierung, Migration, Proliferation und Differenzierung in Vivo⁵Zelle. Vor kurzem wurde dieses Modell zum Analysieren der Stammvater Zelldynamik in der murinen Hornhaut als auch hinsichtlich der Kapazität der differenzierten Hornhaut epithelialen Zellen bei der Neugründung der Hornhaut Stammzellnische nach Verletzungen^6,7zu enthüllen. Nach Abrieb kehrt die Hornhaut zu seiner normalen Transparenz und Zugfestigkeit. Interessant ist, eine in-vitro- Studie angedeutet, dass re Epithelisierung ohne erhöhte Zelle Verbreitung⁸tritt. Dieses Protokoll beschreibt die Zeitachse der ununterbrochenen Heilung in der murinen Hornhaut. Die Methode ist somit anwendbar, die Wirkung von Medikamenten auf die Heilung von Mustern und Geschwindigkeit zu testen.

Die Hornhaut ist beträchtlich für Wundheilung Studien benutzt worden. Jedoch haben viele Studien auf andere Modelle der Verletzung verlassen. Ein gut etabliertes Modell der Verletzung der Hornhaut ist die alkalische brennen, die durchgeführt wird, durch die Anwendung von Natriumhydroxid (NaOH) mit oder ohne Filterpapier auf die Hornhaut-Oberfläche-⁹. Alkalische Exposition führt zu einer großen und diffuse Verletzung, die betrifft nicht nur das Hornhaut-Epithel, sondern auch die Bindehaut und Stroma^9,10. Starke alkalische Lösungen nachweislich hornhautgeschwüren, eintrübt und Neovaskularisation⁹induzieren. Entzündungszellen dringen in das Stroma in der Regel innerhalb von 6 h und bleiben dort bis zum 24 h-¹¹. Somit ist alkalisch Verletzungen eine ratsam Methode in Studien im Zusammenhang mit Stromazellen Aktivierung. Eine andere Art von chemischen Verletzungen kann durch die Anwendung von Dimethyl Sulfoxid (DMSO) zugefügt werden, auf die Hornhaut^9,10. Andere häufig verwendete Verletzungen Modelle umfassen incisional Wunden, die durch die Stroma und Keratektomie Wunden eindringen, die auf den oberen Teil der Stroma^14,15beschränkt sind. Diese Methoden eignen sich auch zur Rede und Antwort bezüglich Stromazellen Wundheilung. Verschiedene Verletzungen Modelle haben ihre eigenen vor- und Nachteile. Abrieb oder Debridement, der das Hornhaut-Epithel wurde zuerst mit getrübten Skalpelle oder klingen auf ex Vivo Hornhaut¹⁶entwickelt. Diese Methode wurde später verwendet in Vivo auf Maus, Ratte und Kaninchen^{17,18,19,20,21,22}. Mit Hilfe des okulären Grates (Abbildung 1), entfernen wir nur einen ausgewählten Bereich des Epithels, ohne Auswirkung auf den Rest des Epithels. Auf diese Weise ist es möglich auf die epithelialen Entfernung zu den verschiedenen Teilen der Hornhaut. Darüber hinaus kann die Größe der Abrieb mit Fluorescein Beflecken beurteilt werden. Darüber hinaus folgen wir hier Abrieb Schließung während der Einheilphase.

Diese Methode birgt einige Vorteile, i) einschließlich der genauen Standort der Abrieb Website, die nicht mit chemischen Verletzungen möglich ist, (Ii) der Abrieb ist schnell durchzuführen, und (Iii) Es ist nicht-invasiv. Hier beschreiben wir die Methode mit der outbred NMRI Maus als Modell, aber dies angewendet werden könnte, die breite Palette von genetischer Mausmodelle sowie der Ratte und Kaninchen, die gängigen Modelle zur Untersuchung der menschlichen Hornhaut Störungen sind.

Protocol

Alle Experimente werden von den nationalen Tierversuch Board genehmigt. 1. Vorbereitungen Bereiten Sie alle Lösungen und halten bei Raumtemperatur, wenn nicht anders angegeben. Befolgen der Abfallentsorgung zu entsorgen verwendete Materialien und Lösungen. Verwendung NMRI und ICR fremd-Bestände Alter zwischen 4 und 12 Wochen und beiderlei Geschlechts. Wenn den Stamm C57BL/6 verwenden, folgen Sie den Ketamin-Medetomidine Vorbereitung Methode im Schritt 1.3.2. Folgen Sie f…

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt ein Modell, um eine Verletzung der Maus Hornhaut Abrieb zufügen und Lösungsvorschläge zu folgen und den Heilungsprozess nach Abrieb zu visualisieren. Vor kurzem haben wir diese Methode zur Untersuchung der Rolle von Hornhaut epithelialen Progenitorzellen bei Wundheilung6beschäftigt. Der Einsatz von etablierten Werkzeugen ist der Schlüssel zu einer erfolgreichen Abrieb-Experiment. Wir und andere haben den Algerbrush II okulären Grat…

Discussion

Verwundung Methoden sind populäre Werkzeuge, verschiedene Aspekte der Hornhaut Homöostase und Pathologien zu studieren. Der Abrieb-Modell bietet eine gut kontrollierte Methode zur relevanten Probleme in der Augenheilkunde. Allerdings sind einige kritische Punkte im Protokoll hervorzuheben. Insbesondere die Details bezüglich der Veterinärmedizin, heilende Wunde Timeline und Ergebnis skizziert sind optimiert für den Einsatz mit fremd-NMRI und ICR-Aktien, aber können unter Stämme von Mäusen²⁶…

Materials

NMRI mouse	Envigo	275
0.9% NaCl			use sterile
Medetomidine	Vetmedic	Vnr087896	Market name: Cepetor Vet
Ketamine	Intervet	Vnr511485	Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin	Invidior	3015248	Market name: Temgesic
Atipamezol	Orion Pharma	Vnr471953	Market name: Antisedan Vet
Carprofen	Norbrook	Vnr027579	Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment	Dechra	Vnr080899	Market name: Isathal
Fluorescein salt	Sigma-Aldrich	F6377
Phosphate-buffered saline solution			PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)	Algerbrush	6.39768E+11
Cobalt Blue pen light	SP Services	DE/003
Hot plate	Kunz Instruments	2007-0217
Digital SLR camera	Nikon	D80
Adjustable camera arm and clamp	Neewer	10086132	Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp	Prisma
Soft wipe	KimtechScience	7552
CO2 chamber
Dissection toolset	Fine Science Tools
Syringes	Beckton Dickinson	303172
26G needles	Beckton Dickinson	303800
2 mL Eppendorf tube	Sarstedt	689
Tissue casette	Sakura Finetech	4118F
Tissue processing machine ASP200S	Leica
Xylene	VWR	UN1307
Paraffin wax	Millipore	K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm	Sakura Finetech	4123
Microtome	Microm	HM355
Water bath for sectioning	Orthex	60591
Water bath for sectioning	Leica	HI1210
Microtome blade	Feather	S35
Glass slide	Th.Geyer GmbH & Co.	7,695,019
Ultrapure water	Millipore	MPGP04001	MilliQ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA