Cicatrización de heridas de abrasión epitelial corneal con rebabas Ocular como un modelo de córnea

Summary

Este protocolo describe un método para causar una abrasión en la superficie ocular del ratón y seguir la herida en proceso de curación después de eso. El protocolo aprovecha de una ocular rebabas a eliminar parcialmente el epitelio de superficie del ojo en ratones anestesiados.

Abstract

La córnea murina ofrece un excelente modelo para estudiar la cicatrización de heridas. La córnea es la capa más externa del ojo y es la primera defensa a la lesión. De hecho, el tipo más común de lesión de ojo encontrado en clínica es una abrasión corneal. Aquí, utilizamos un ocular burr para inducir una abrasión, resultando en la eliminación del epitelio corneal en vivo sobre ratones anestesiados. Este método permite la interrupción epitelial específica y reproducible, dejando otras áreas intactas. Además, describimos la visualización del epitelio erosionada con tinción de fluoresceína y proporcionar consejos concretos sobre cómo visualizar la córnea erosionada. Luego, seguimos la línea de tiempo de cicatrización 0, 18 y 72 h después de la abrasión, hasta que la herida es re-epithelialized. El modelo de abrasión epitelial de la lesión corneal es ideal para los estudios sobre proliferación de células epiteliales, la migración y la reepitelización de las capas corneales. Sin embargo, este método no es óptimo para estudiar la activación estroma durante la cicatrización de heridas, porque las rebabas del ocular no penetran a las capas de células estromales. Este método también es adecuado para aplicaciones clínicas, por ejemplo, pre-clínica prueba de eficacia de la droga.

Introduction

Las capas epiteliales de numerosos órganos están expuestas a lesiones. Sin embargo, también contienen la capacidad de compensar la pérdida de tejido por medio de la cicatrización de heridas. La córnea ofrece un excelente modelo para estudiar la cicatrización de heridas. Forma la superficie externa del ojo y proporciona una capa protectora para la delicada maquinaria ocular. Así, la córnea funciona como una barrera física frente a patógenos y la pérdida de agua. Se compone de tres capas; epitelio, estroma y endotelio. El epitelio de la córnea es la capa más externa de la córnea. Las células epiteliales mantienen la función barrera de la córnea adhiriéndose estrictamente entre sí mediante uniones estrechas^1,2,3. Membrana córnea acelular de la basal, la membrana de Bowman, separa el epitelio del estroma extensa, que contiene keratocytes refractaria. En el estroma, las células endoteliales canal de nutrientes, agua y oxígeno a la capa superior.

Abrasiones corneales son muy comunes en la clínica⁴. Lesiones en la córnea son diversas, pero en gran parte son causadas por pequeñas partículas como polvo o arena, arañazos u otros objetos extraños. El protocolo aquí había descrito pretende reproducir un tipo clínico de abrasión epitelial corneal. De esta manera, este protocolo proporciona un método controlable y seminal para los médicos y científicos corneales aplicar en sus estudios. Hemos realizado un ensayo de reparación en vivo lesiones en la córnea murina por causar lesiones en el tejido con una fresa rasgunõs ocular, el Algerbrush II. Aquí apuntamos la abrasión sólo al epitelio corneal central y dejar las otras partes del órgano sin daño. Así, el protocolo es ideal para el estudio de la célula epitelial corneal dinámica o la membrana basal durante re-epithelialization, célula de la migración, proliferación y diferenciación en vivo⁵. Recientemente, este modelo se utilizó para analizar la dinámica de la célula progenitora en la córnea murina, así como para conocer la capacidad de las células epiteliales corneales diferenciadas en el restablecimiento del nicho de células madre corneales después de lesión^6,7. Después de la abrasión, la córnea vuelve a su normal transparencia y resistencia a la tracción. Curiosamente, un estudio en vitro indicó que re-epithelialization ocurre sin creciente de la célula proliferación⁸. Este protocolo describe la línea de tiempo de curación sin interrupciones en la córnea de ratón. Así, el método es aplicable para probar el efecto de las drogas en patrones y la velocidad de cicatrización.

La córnea se ha utilizado extensivamente para estudios de heridas. Sin embargo, muchos estudios han dependido de otros modelos de la lesión. Un modelo bien establecido de lesión corneal es la quemadura alcalina que se realiza mediante la aplicación de hidróxido de sodio (NaOH) con o sin papel de filtro sobre la superficie corneal⁹. Exposición alcalina produce una lesión grande y difusa que no sólo afecta el epitelio corneal, sino también la conjuntiva y el tejido conectador^9,10. Soluciones alcalinas fuertes han demostrado inducir neovascularización⁹, opacificación y úlceras corneales. Las células inflamatorias invaden el estroma normalmente dentro de las 6 h y permanecen allí hasta las 24 h¹¹. Por lo tanto, alcalino es un método recomendable en estudios relacionados con la activación stromal. Otro tipo de daño químico puede ser infligida por aplicar dimetilsulfóxido (DMSO) en la córnea^9,10. Otros modelos de lesiones comúnmente usados incluyen heridas incisionales que penetran a través de las heridas de tejido conectador y keratectomy, que se limitan a la parte superior del tejido conectador^14,15. Estos métodos también son útiles para responder a preguntas sobre cicatrización estromal. Lesiones diferentes modelos tienen sus ventajas y desventajas. Abrasión o desbridamiento, del epitelio corneal se desarrolló inicialmente utilizando bisturís rasgunõs o cuchillas en vivo ex córneas¹⁶. Este método ha sido más tarde usado en vivo en el ratón, rata y conejo^{17,18,19,20,21,22}. Con las rebabas del ocular (figura 1), quitamos sólo una región seleccionada del epitelio, dejando el resto del epitelio afectado. Esta manera, es posible orientar precisamente la supresión epitelial a diferentes partes de la córnea. Además, el tamaño de la abrasión puede ser evaluado con la tinción de fluoresceína. Además, aquí seguimos cierre de abrasión durante el período de cicatrización.

Este método presenta varias ventajas, i) incluyendo la localización exacta del sitio de la abrasión, que no es posible con lesión química, ii) la abrasión es rápida de realizar, y iii) es no invasivo. Adjunto, describimos el método utilizando el ratón NMRI exogámica como modelo, sin embargo esto podría aplicarse a la amplia gama de modelos genéticos del ratón, así como a la rata y el conejo, que son modelos comunes utilizados para estudiar la interrupción córnea humana.

Protocol

Todos los experimentos son aprobados por la Junta Nacional experimento animal. 1. preparaciones Preparar todas las soluciones y guardar en temperatura ambiente, salvo indicación en contrario. Siga las regulaciones de eliminación de residuos a disponer utilizada materiales y soluciones. Uso NMRI y ICR marginado las existencias, entre 4-12 semanas de edad y sexo. Si se utiliza la cepa C57BL/6, siga el método de preparación de ketamina-medetomidina en paso 1.3.2. Para otra…

Representative Results

Este protocolo describe un modelo para infligir una lesión de abrasión en la córnea de ratón y sugiere cómo seguir y visualizar el proceso de curación después de la abrasión. Recientemente, se empleó este método para estudiar el papel de células progenitoras epiteliales corneales durante6de cicatrización. El uso de herramientas establecidas es la clave para un experimento exitoso de la abrasión. Nosotros y otros, hemos utilizado las rebabas ocular Alge…

Discussion

Hería los métodos son herramientas populares para estudiar diferentes aspectos de la homeostasis de la córnea y patologías. El modelo de abrasión ofrece un método bien-controlado para hacer frente a problemas relevantes en Oftalmología. Sin embargo, ciertos puntos críticos en el protocolo son destacar. En particular, los detalles descritos en relación con la medicina veterinaria, herida curativa línea de tiempo y resultado están optimizados para el uso con cepas NMRI y ICR exogámica, pero pueden variar entre …

Materials

NMRI mouse	Envigo	275
0.9% NaCl			use sterile
Medetomidine	Vetmedic	Vnr087896	Market name: Cepetor Vet
Ketamine	Intervet	Vnr511485	Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin	Invidior	3015248	Market name: Temgesic
Atipamezol	Orion Pharma	Vnr471953	Market name: Antisedan Vet
Carprofen	Norbrook	Vnr027579	Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment	Dechra	Vnr080899	Market name: Isathal
Fluorescein salt	Sigma-Aldrich	F6377
Phosphate-buffered saline solution			PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)	Algerbrush	6.39768E+11
Cobalt Blue pen light	SP Services	DE/003
Hot plate	Kunz Instruments	2007-0217
Digital SLR camera	Nikon	D80
Adjustable camera arm and clamp	Neewer	10086132	Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp	Prisma
Soft wipe	KimtechScience	7552
CO2 chamber
Dissection toolset	Fine Science Tools
Syringes	Beckton Dickinson	303172
26G needles	Beckton Dickinson	303800
2 mL Eppendorf tube	Sarstedt	689
Tissue casette	Sakura Finetech	4118F
Tissue processing machine ASP200S	Leica
Xylene	VWR	UN1307
Paraffin wax	Millipore	K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm	Sakura Finetech	4123
Microtome	Microm	HM355
Water bath for sectioning	Orthex	60591
Water bath for sectioning	Leica	HI1210
Microtome blade	Feather	S35
Glass slide	Th.Geyer GmbH & Co.	7,695,019
Ultrapure water	Millipore	MPGP04001	MilliQ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA