Summary
O objetivo do protocolo é medir a amplitude de extensão do movimento do joelho rato. Os efeitos de várias doenças que aumentam a rigidez da articulação do joelho e a eficácia dos tratamentos podem ser quantificados.
Abstract
Faixa de joelho normal de movimento (ROM) é fundamental para o bem-estar e permite realizar atividades básicas como andar, subir escadas e sentado. ROM perdido é chamado uma contractura articular e resulta em aumento de morbilidade. Devido à dificuldade de inversão estabelecida joelho contraturas, deteção adiantada é importante, e, portanto, conhecer os fatores de risco para o seu desenvolvimento é essencial. O rato representa um bom modelo com o qual pode ser estudado o efeito de uma intervenção, devido à semelhança da anatomia do joelho rato dos humanos, habilidade do rato para tolerar a longa duração da imobilização do joelho em flexão, e porque os dados mecânicos podem ser correlacionados com análise histológica e bioquímica do tecido no joelho.
Usando um artrômetro automatizado, vamos demonstrar um método validado, preciso, reprodutível, usuário independente de medir a extensão ROM de rato a articulação do joelho em torques específicos. Este artrômetro pode ser usado para determinar os efeitos das intervenções no joelho mista ROM no rato.
Introduction
Ter amplitude total de movimento (ROM) das articulações é fundamental para saúde e bem-estar1. Uma perda em ROM passiva conjunta é chamada uma contratura2. Contraturas conjuntas podem surgir de várias condições, incluindo repouso prolongado, paralisia, artroplastia conjunta, queimaduras, infecção e condições neurológicas1,3,4,5. Uma contratura do joelho pode ser incapacitante, pois acelera a degeneração articular, aumenta o risco de quedas e prejudicialmente afeta a capacidade da pessoa para realizar tarefas básicas funcionais, incluindo caminhadas, sentado e subir escadas6, 7.
Uma vez estabelecida, contraturas do joelho são difíceis de tratar, e, portanto, determinar quais pacientes estão em maior risco de desenvolver esta condição é essencial para a prevenção e evitar a morbidade associada a contratura8. Experimentos são projetados para avaliar 1) as condições causando ou influenciando contraturas de articulação de joelho, 2) e a severidade de contraturas, 3) sua progressão temporal, 4) os tecidos envolvidos na contratura, 5) sua reversibilidade, bem como 6) a utilidade das várias intervenções preventivas e curativas no joelho mista ROM. Para todas estas experiências, um método válido, objectivo, preciso e reprodutível para medir a ROM é crítico. Outras medidas auxiliares (gasto de energia, Histomorfometria, conteúdo de expressão e da proteína do gene) são marcadores úteis para entender a fisiopatologia de contraturas conjuntas, mas a limitação mecânica é o que limita o paciente e conduz à deficiência. Alguns dos desafios nesta área de pesquisa inclui os métodos heterogêneos pelo qual joelho ROM pode ser testado experimentalmente, bem como a falta de dados quantitativos9. O uso de uma variedade de diferentes métodos experimentais leva a resultados que não são comparáveis de laboratório para laboratório. Isto levou a controvérsia sobre as condições (tais como a artroplastia de imobilização ou articulação) que causar contraturas comum10. Um método automatizado de medir experimentalmente ROM comum após uma intervenção, por conseguinte, é necessário.
Aqui, descrevemos um protocolo independente de usuário, válido, preciso e reprodutível para avaliar o joelho de rato ROM usando um Custom-Built artrômetro ligado a uma câmera digital para medir precisamente o ROM de joelho em extensão. Nós testamos o efeito de vários períodos de imobilização no joelho ROM. Em seguida, descrevemos os métodos de medição ROM em torques previamente especificado nas imagens digitais resultantes usando fixos Marcos ósseos. Em geral, esses métodos confiável medem joelho rato ROM e fornecem dados quantitativos.
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Protocol
O modelo de imobilização do joelho rato usado foi aprovado pela Universidade de Ottawa Animal cuidados serviço veterinário e o Comitê de ética local.
1. preparação animal
- No final do período de imobilização predeterminado, eutanásia em ratos pela administração de dióxido de carbono.
Nota: Aqui usamos um modelo de imobilização com uma placa e 2 parafusos (um inserido no fêmur proximal e a outra na tíbia distal), que evita a violação de qualquer joelho mista estruturas e mantém uma posição joelho-flexionados de 135° conforme descrito anteriormente6 . Durante um período de tempo, isto produz uma flexão de joelho contratura11. - Cobrir a área dentro e ao redor da superfície que será colocado sobre o artrômetro com almofadas de proteção absorvente, à prova de água. Use luvas, avental e proteção para os olhos, enquanto completava o experimento.
- Usando um bisturi, dividir a pele para expor a placa e parafusos (ver a nota seguinte etapa 1.1); Insira o parafuso mais proximal no fêmur proximal e insira o parafuso mais distal na tíbia distal. Palpe para localizar os parafusos. Uma vez que as cabeças dos parafusos são acessíveis, remova o parafuso com uma chave de fenda.
Nota: Durante o período de imobilização, as cabeças dos parafusos podem tornar-se coberta por tecidos moles. Se isso ocorrer, use o bisturi suavemente remover o tecido e descobrir as cabeças dos parafusos. - Uma vez que os parafusos são removidos, retire a placa manualmente ou usando fórceps de um kit de dissecação.
- Usando uma tesoura e pinça, cortar a extremidade inferior para remover a pele da fáscia subjacente.
2. o animal posicionando sobre o artrômetro motorizado
Nota: Todos os testes devem ser realizado à temperatura ambiente. Aqui o artrômetro é alimentado por um padrão norte americano 120 V de entrada. A saída do adaptador é 12 V e 500 mA.
- Posicionar o animal a ser testado em seu lado com a perna experimental (a perna a ser testado) virada para cima (Figura 2).
- Segura o fêmur no grampo metal sulcado integrado para a fase de montagem do artrômetro. Fazem furos através do músculo usando uma chave de fenda de precisão Coloque a pinça distal para o grande trocanter e proteja o fêmur. Ajuste o côndilo femoral lateral sobre o centro de rotação do artrômetro (Figura 1, 2).
- Posição o movable braço com dois bornes eretos por trás a perna, apenas superior ao calcâneo, para empurrar o joelho em extensão passiva, uma vez o motor elétrico é ativada.
- Aperte a braçadeira de fêmur em sua base, usando uma chave de hex, até que ele é seguro.
- Certifique-se a câmera está correctamente montada sobre o artrômetro usando uma chave de fenda e está no Foco Manual. Foco da câmera sobre o côndilo femoral.
- Selecione a configuração de direção com o artrômetro (no sentido horário ou anti-horário), dependendo da direção do joelho ROM sendo testado e a posição do rato.
- Ative o artrômetro motor pressionando simultaneamente o botão Power e começar .
Nota: A necessidade de empurrar o poder e botão iniciar simultaneamente é uma característica de segurança do dispositivo, o que impede o acionamento acidental.- Observe que o motor artrômetro irá mover a uma velocidade de 6,6 RPM e depois parar para 2.1 s, ao atingir o primeiro torque pré-estabelecido.
- Nota: que quando o primeiro torque é alcançado, o LED correspondente acenderá e a câmera digital vai tirar uma foto do joelho automaticamente.
Nota: Uma vez que a foto é tirada, o artrômetro vai continuar para a próxima, mais torque predefinido. Foram aplicados os torques de quatro, o artrômetro irão parar. Uma vez que o rato está posicionado sobre o artrômetro e o teste é iniciado, o tempo total para testar um joelho é aproximadamente 18,8 vezes s. podem variar ligeiramente, dependendo da condição da contractura articular. As imagens captadas são usadas para medir a extensão em cada binário.
3. capturar o ângulo de extensão do joelho usando o artrômetro motorizado
Nota: Uma vez que o motor tenha parado em cada torque aplicado, uma câmera digital é acionada para tirar uma foto. A câmera está posicionada no frame que está diretamente acima da articulação do joelho sendo testado e incidiu sobre o côndilo femoral.
- Continuar com os testes com o mesmo joelho do mesmo animal, mas em uma situação diferente, por exemplo, depois de um myotomy da musculatura posterior transarticular é executada para isolar o componente de arthrogenic (não-muscular) de uma contratura, ou com um joelho de um outro animal.
- Quando completar a myotomy, disse o músculo proximal o suficiente para o joelho para garantir que a cápsula não é cortada.
Nota: É mais fácil completar o myotomy quando a perna em extensão, após a aplicação do torque configuração 4 (17.53 N-cm). Em seguida, repita os passos 2.1 através de 3.1.
- Quando completar a myotomy, disse o músculo proximal o suficiente para o joelho para garantir que a cápsula não é cortada.
- Uma vez que ambas as pernas foram testadas em todas as condições (por exemplo, antes e depois da myotomy), alienar a carcaça animal e todos os materiais de risco biológico, seguindo o protocolo institucional e limpar o artrômetro.
4. joelho ROM medição análise
- Analise a ROM usando o ImageJ.
Nota: Aqui versão 1.45 s foi usado. - Abra o arquivo que contém a imagem digital, tirada pela câmera montada sobre o artrômetro de rato.
Nota: A pessoa que realizar a análise deve ficar cego para o agrupamento experimental do animal (por exemplo, imobilizada contra controle). - Selecione a ferramenta ângulo na barra de ferramentas principal e traçar o ângulo de malrotação desenhando uma linha femoral do meio da braçadeira do fêmur para o côndilo lateral (alinhado com a diáfise femoral, Figura 2) e uma linha da tíbia de lateral côndilo femoral para o maléolo lateral (Figura 2).
Nota: O ângulo fêmoro-tibial corresponde ao ângulo máximo de extensão do joelho em cada binário predefinido. - Use a ferramenta de medição clicando Analyze | Medida para mostrar o ângulo calculado produzido pelas 2 linhas desenhadas acima. Use a Convenção de 0° para significar a extensão completa.
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Representative Results
A quantidade de extensão do joelho, determinada por vários períodos de imobilidade são resumidas para aumentar a duração da imobilidade e mostrar que contraturas mais graves foram produzidas seguindo crescentes comprimentos de imobilização. Resultados representativos usando o ImageJ são mostrados na Figura 3.
A capacidade de medir a extensão máxima dos joelhos de rato de forma válida, precisa e reprodutível, independente de usuário que reduz o viés nos dados. No exemplo fornecido, avaliamos a extensão máxima do joelho após 16 semanas de imobilização para 7 ratos, comparando o membro imobilizado (experimental) para o membro contralateral não-imobilizadas. O membro escolhido para a imobilização alternado de um rato para outro (por exemplo, rato 1 teve o joelho direito imobilizado, rato 2 à esquerda). O investigador medir os ângulos foi cegado para que lado estava imobilizado durante as medições. Os resultados são apresentados na Figura 3. Para o joelho imobilizado, a capacidade de extensão máxima foi reduzida em comparação com o contralateral. Divisão dos músculos de transarticular elimina o componente miogênico da contratura em flexão. A seguir myotomy, aumentou a capacidade de extensão máxima para o joelho contralateral e experimental; no entanto, o joelho experimental continuou a demonstrar uma contratura de flexão (Figura 3).
Figura 1 : Artrômetro de joelho de rato. (A) toda imagem representativa do aparelho (B) do animal dentro artrômetro (C) Electronics display e braçadeiras para artrômetro. (D) imagem alargada de exposição eletrônica. Os números indicam os vários binários sendo aplicada: torque 1 = 2,53 cm N, N-cm, Torque 3 = 12.53 N-cm, de binário 2 = 7.53 torque 4 = 17.53 N-cm. (E) imagem alargada da braçadeira femoral e tibial aparelho empurrando. A braçadeira femoral é fixo para o palco. O braço movente da tíbia tem 2 bornes eretos que fixam a extremidade inferior distal e mover o joelho em extensão. Ponta de flecha e chevron indicam a braçadeira do fêmur e o braço móvel, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Artrômetro e rato experimental para avaliação. (A) joelho extensão do membro posterior é medido utilizando a linha tibial que o côndilo femoral lateral para o maléolo lateral e a linha femoral que o côndilo lateral para o meio da mordaça fêmur. Ponta de flecha e chevron indicam a braçadeira do fêmur e o braço móvel, respectivamente. (B) imagens de alta ampliação do côndilo femoral e (C) alta magnificação do maléolo lateral.
Figura 3 : Escala de joelho imobilizado e contralateral rato do movimento após a imobilização de 16 semanas. Para ambos os joelhos, após o teste de extensão do joelho com estruturas articulares tudo intactas (n = 7), um myotomy dos músculos trans-articular foi realizada para determinar a limitação de arthrogenic na ROM. dados são apresentados como médios graus de extensão completa (usando o Convenção 0 ° = extensão completa) com barras de erro, que representa o desvio-padrão. * representa p < 0,01 usando o teste T independente-amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O artrômetro de joelho do rato foi desenvolvido para reproducibly e confiantemente determinar a extensão máxima do joelho rato após uma intervenção. Vantagens deste dispositivo incluem a geração consistente de torque através de articulação com uma força constante de braço de comprimento e extensão do joelho. Outra vantagem inclui a habilidade de ajustar o torque em um nível que permite repetitivo de teste na mesma articulação para avaliar a influência de diferentes estruturas articulares no joelho ROM, tais como músculo, cápsula ou ligamento. Por exemplo, após teste de articulação totalmente intacta, o joelho posterior transarticular músculos poderiam ser divididos e artrômetro testes repetidos a fim de determinar a contribuição de arthrogenic de extensão limitação11.
Características mecânicas específicas do artrômetro que otimizam a precisão e exatidão de medição incluem a braçadeira sulcada, que é projetada para impedir a rotação do fêmur durante o teste (Figura 1). Os bornes eretos metais dois distais envolver a perna posterior, empurrando o joelho em extensão no sentido horário e minimizam o risco de luxação posterior da tíbia sobre o fêmur durante o teste (Figura 1). A altura da saliência anterior da ligação vertical superior e postagens certifique-se que a tíbia não escorregar os posts. A capacidade dos bornes eretos para girar e manter a sua posição na tíbia imediatamente proximal ao calcâneo garante torque constante. Quatro torques são testados em sequência: 2,53 cm N, N-cm 7.53, 12.53 N-cm e 17.53 N-cm. O mais alto nível de torque foi determinado como sendo a quantidade de força que levou a falha capsular nas articulações de joelho normal (ventrículo) rato (i.e., superando a 0 ° de extensão) após a divisão de todos os músculos transarticular. O torque mais baixo foi o ponto de resistência ao movimento angular acima quantidades mensuráveis nas articulações de joelho do rato normal. O médio dois torques foram criados para ser aproximadamente a meio caminho entre o torque maior e menor.
Outros métodos de medição do ROM conjunta em torques específicos têm sido descritos para ambos os ratos e outros animais modelos12,13,14,15,16. Algumas das vantagens do nosso modelo sobre esses outros sistemas incluem um tamanho conveniente que permite a colocação de bancada do dispositivo sem a necessidade de instalações especiais. Outros modelos podem também exigir a desarticulação do membro sendo estudada, enquanto que o modelo apresentado aqui não. Mecanicamente, via arco do post aplica-se a força de extensão da perna distal, seguindo a progressão angular do joelho, mantendo assim um ângulo consistente de aplicação de força. A fase do artrômetro permite a colocação do rato toda sobre o instrumento de medição, permitindo que o teste de todos em situ articular estruturas que podem contribuir para a ROM perdido sem violar a anatomia comum. Enquanto o protocolo de ética para nosso laboratório exclui testes em animais vivos, isso teoricamente seria possível com analgesia adequada e pós-teste sacrificar protocolos.
O artrômetro apresenta algumas desvantagens. O dispositivo foi dimensionado para o joelho de rato adulto para assegurar que o braço móvel em um comprimento para garantir não escorregava a perna e a perna não escorregava o braço fora. Ratos mais jovens, ou maiores e menores espécies iria beneficiar de componentes de tamanho apropriado. Além disso, uma reprogramação do ideal braço de momento e força (torque) seria necessários. Se, por exemplo, foi usado um animal maior ou menor, pode ser necessário ajustar o comprimento do braço de momento e/ou a quantidade de força aplicada para atingir o torque ideal. Outras partes do artrômetro talvez também precise ser redimensionado, de acordo com o tamanho do animal. Enquanto os movimentos do artrômetro são usuário independente, medida comum usando o ImageJ sujeitas a erro humano. Encontramos no entanto que, usando os métodos apresentados aqui, há alta intra-avaliador e confiabilidade inter avaliador com coeficientes de correlação intraclasse de 0.987 e 0,903, respectivamente. Porque o torque mais elevado muitas vezes prejudica as estruturas articulares durante o teste, uma confiabilidade inter avaliador válida para a colocação de animais e ativando o artrômetro é difícil de determinar. Para evitar o erro de medição que pode ser associado a ter mais de um investigador realizar esta parte do protocolo, recomendamos que o mesmo investigador secure os ratos para o artrômetro para a duração de um estudo que qualquer preconceito é consistente entre experimental e controle de joelhos. Porque os isquiotibiais atravessam o joelho e articulações do quadril, retroversão da pelve pode ocorrer durante o teste em torques 1 e 2 antes da myotomy. Isto pode contribuir para aumentos na extensão de joelho para ambos experimental e controle de joelhos nestes torques. Finalmente, os resultados podem variar de verdade na vivo ROM, como o protocolo foi desenvolvido para testar euthanized em vez de animais vivos.
Enquanto nós descreveu o uso de um dispositivo para avaliar os efeitos da imobilidade no rato a articulação do joelho, outras condições que afetam a ROM comum também poderiam ser estudadas. Existem inúmeros exemplos, alguns dos quais incluem efeitos de trauma, Tom muscular aumentada secundária ao insulto do sistema nervoso central, ou as modificações genéticas relacionadas com doenças neuromusculares. Respectivas intervenções tais como a aplicação de células-tronco para a articulação do joelho, bloqueio da junção neuromuscular ou terapia genética que ajudam a descobrir novas opções de tratamento também podem ser avaliadas usando o dispositivo.
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Disclosures
Os autores não têm divulgações ou conflitos de interesses para declarar.
Acknowledgments
Os autores gostaria agradecer Joao Tomas por sua assistência técnica com o dispositivo e Khaoula Louati para assistência no desenvolvimento dos métodos de análise de imagem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arthrometer | The Ottawa Hospital Rehabilitation Centre - Rehabilitation Engineering | N/A | |
| Camera | Canon | EOS-500D | Commonly known as EOS Rebel T1i |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.45s | |
| Absotbent Underpads | VWR | 820202-845 | |
| Dissection Kit | Fisher | 08-855 | Kit Includes: Forceps: medium points, nickel-plated Scissors: 1.5 in. (40 mm) blades, stainless steel Dissecting knife handle: nickel-plated Knife blades: stainless steel, pack of 3 Dropping pipet: glass Bent dissecting needle: stainless steel with plastic handle Straight dissecting needle: stainless steel with plastic handle Vinylite Ruler 6 in. (15 cm) |
| Precision Screw Driver | Mastercraft | 057-3505-8 | |
| Scalpel Blades - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Screwdriver | Stanley | 057-3558-2 | |
| Hex Keys | Mastercraft | 058-9684-2 | |
| Universal AC to DC powder adapter | RCA | 108004951 |
References
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