Summary
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור האפיון הביוכימי של שמרים שינוי RNA האנזים, Mod5, ונדון כיצד פרוטוקול זה יכול לחול על אנזימים אחרים שינוי RNA.
Abstract
N6- isopentenyladenosine RNA שינויים הינם מגוונים באופן פונקציונלי מאוד שנשמרת בין אאוקריוטים פרוקריוטים. אחד השינויים שנשמרת ביותר של - isopentenyladenosine6N מתרחשת במיקום A37 בקבוצת משנה של tRNAs. שינוי זה משפר את יעילות התרגום ונאמנות על ידי הגדלת את הקרבה של tRNA הריבוזום. מוטציה של אנזימים האחראים את השינוי בפרוקריוטים משויכות מספר מצבי מחלה, כולל תפקוד מיטוכונדריאלי וסרטן. לכן, הבנת את המצע ירידה לפרטים ופעילויות הביוכימי של אנזימים אלה חשוב להבנה של ביולוגיה האיקריוטים נורמלי, פיפטות. כבר מועסקים מערך מגוון של שיטות לאפיון אני6א שינויים. בזאת הוא תיאר גישה ישירה של איתור isopentenylation על ידי Mod5. שיטה זו משתמשת דגירה של RNAs עם טרנספראז isopentenyl רקומביננטי, ואחריו RNase T1 עיכול, וניתוח חד-מימדי ג'ל אלקטרופורזה לזהות אני6א שינויים. בנוסף, נדון על הסתגלות פוטנציאלי של הפרוטוקול לאפיין אנזימים אחרים שינוי RNA.
Introduction
163. לפחות שינויים ברורים posttranscriptional RNA זוהו, עם שינויים אלה היוועצות פונקציות מגוונות and תלויי-ההקשר RNAs ישירות המשפיעים על מבנה רנ א, המשפיעים על האינטראקציות של RNA עם השני מולקולות1,2. הערכה ממגוון גדול של RNA שינויים גודלת, חיוני לפתח מבחני זה שניתן לחקור בצורה אמינה את השינויים RNA והן האנזימים לעודד אותם.
אחד השינויים RNA הראשון להיות מזוהה מתרחשת 37 בסיס ב- tRNAs, סמוך codon אנטי-3' צד3,4. קבוצת isopentenyl של dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) מועבר המיקום N6 של אדנוזין 37 (אני6A37) 3,5 ב תת-קבוצה של tRNAs cytoplasmic והן מיטוכונדריאלי. אני6A37 משפר את דיוק התרגום ועל יעילות על ידי הגדלת אהדה של tRNA ריבוזום4,6 ו אני6A37 חשוב לתגובת הלחץ בחיידקים7. האנזימים לבצע שינוי זה מכונים tRNA isopentenyl transferases, מאוד נשמרים חיידקים8,9, פטריות10, תולעים11, צמחים12ו גבוה פרוקריוטים13 , כולל בני14.
מוטציות בגן האנושי tRNA isopentenyl טרנספראז, TRIT1, קשורים עם מחלות אנושיות. לדוגמה, מוטציה בגן TRIT1 הוא מתואם עם מחלה מיטוכונדרית קשה, ככל הנראה נגרם על-ידי פגם חלבון מיטוכונדריאלי סינתזה15,16. יתר על כן, TRIT1 מתוארת כ הגידול משתיק קול ג'ין17,18 , הייתה שם מספר סוגי סרטן כולל מלנומה19, השד20, קיבה21וסרטן ריאות22 ,23. לבסוף, TRIT1, Mod5 transferases isopentenyl (האפייה) הם חלבונים צבירת נוטה היוצרים סיבי עמילואיד פריון דמוי24,25,26. תצפיות אלה שעלולים לסבך tRNA transferases isopentenyl מחלות ניווניות, למרות עדות ישירה לכך עדיין לא הוכח.
בהתחשב בתפקיד isopentenyl transferases לשחק ב תרגום ומחלות, שיטות ישירות למדוד לי6פעילות isopentenyl טרנספראז חשובות להבנה מכניסטית של אנזימים תחת נורמלי ועם מצבי מחלה אלה. מספר גדל והולך של שיטות זמינות לזהות אני6א RNA שינויים, כולל במבחנה isopentenylation מבחני, הכלאה חיובי בהעדר אני6מבחני (PHA6), דק שכבה כרומטוגרפיה (TLC), חומצת אמינו מבחני קבלה פעילות, גישות ספקטרומטר מסה (אירוע של יום שלם הפניה למעורר 4).
וזמינותו isopentenylation במבחנה תואר אשר מנצל 14C-DMAPP ו- tRNAs ללא תווית. ב הזה assay, פחמן רדיואקטיבי מועבר RNA מ 14C-DMAPP על ידי טרנספראז isopentenyl. בעוד assay זו היא רגישה מאוד, לעתים קרובות קשה לקבוע שאריות ספציפי זה שונה9,20,27. מבחני PHA6 להסתמך על מגושם אני6א שינוי המפריעים הכלאה של 32התווית על-ידי P החללית פורש את שאריות ששונה. ככזה, הכלאה גדול בהיעדר תמונה628,18,שינוי29. מבחני PHA6 הם רגישים, יכולת ניתוח הכולל RNA מופק lysates הסלולר. בנוסף, היכולת לעצב הגששים ספציפי הרנ א עניין נותן גמישות יעד משמעותי בשיטה זו. עם זאת, מבחני PHA6 מוגבלות אפיון שינויים העשויים להתרחש על שאריות בתוך אזור ממוקד של המכשיר, ולכן סביר פחות לזהות שינוי הרומן אתרים. בנוסף, כמו היעדר איגוד מעידה על השינוי, שינויים או מוטציות המשפיעות על ה-RNA מחייב אחרים וחיסול ניתוח נתונים.
גישה אחרת משלב בנזיל DEAE תאית (BD) תאית כרומטוגרפיה עם חומצת אמינו פעילות קבלה כמו readout אני6א שינויים ב- tRNA30. גישה זו assays ישירות את הפונקציה של i השינוי6א, אבל זה היא גישה עקיפה כדי לזהות אני6א שינוי ושל חסר רזולוציה למפות שינויים משקע ספציפי ב- RNA. בגישה TLC שימש כדי לזהות tRNA סה כ אני6א שינויים. בגישה זו, באופן פנימי 32tRNAs התווית על-ידי P מתעכלים כדי נוקלאוטידים בודדים, ניתוח TLC מימדי משמש לזיהוי isopentenylation. גישה זו היא רגישה מאוד באיתור סה כ אני6א במדגם RNA נתון אבל על העיכול, כל רצף מידע אובד; לפיכך, החוקר אין שום דרך לקבוע אילו שאריות היה שונה31.
לאחרונה, ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS) פותחו שיטות המשווים באופן כמותי הכולל שינויים RNA בין המינים, סוגי תאים תנאים ניסיוני32,33, 34. מגבלה של מתודולוגיה זו הוא כי הוא פחות מסוגל לקבוע זהותו ואת מיקום בתוך RNA שממנו היה nucleoside ששונה נגזר34. יתר על כן, הידע, הציוד הנדרש לביצוע ניסויים אלה מגבילות את המעשיות של גישה זו.
בנוסף, פותחו מספר טכנולוגיות הדור הבא רצפי למפות RNA שינויים transcriptome ברוחב34. Immunoprecipitation של RNAs עם נוגדנים ספציפיים שינוי מסוים (RIP-Seq) מאפשרים החוקר לזהות כל רצפי המכילה35,שינוי מסוים36. בנוסף, גישות רוורס טרנסקריפטאז כגון כימיה-Seq ורצף אי-התאמה שאינן אקראיות להסתמך על לפליטת התגובה שעתוק במהופך38,37,שאריות ששונה39. למרות היתרון של טכניקות אלה כדי למפות RNA שינויים transcriptome רחב, RIP-seq וטכנולוגיות כימית-Seq מוגבלים על ידי חוסר של נוגדנים אמין או זמין עבור כל שינוי מסוים, בהתאמה34תגובתי כימיקלים. יתר על כן, רוורס טרנסקריפטאז אנזימים הדרושים לביצוע כימית-Seq, אי התאמה שאינן אקראיות רצף טכניקות יכול להיות מובן מבנים RNA יציבה. הטבע ששונה מאוד ויציב מבחינה מבנית של tRNAs תגרום להם קשה במיוחד לחקור שיטות אלה. עד כה, טכנולוגיות מבוססות-רצף של הדור הבא שלא טרם נוצלו למפות אני6שינויים34.
במסמך זה, אנו מתארים גישה פשוטה וישירה כדי לזהות אני6א tRNA שינויים בתוך חוץ גופית. שיטה זו משתמשת דגירה של RNAs עם רקומביננטי cerevisiae ס isopentenyl טרנספראז (Mod5), ואחריו RNase T1 לעיכול, חד-מימדי ג'ל אלקטרופורזה ניתוח כדי למפות אני6א שינויים. גישה זו הוא ישיר ואינה דורשת מומחיות ייחודית קצת כדי לנתח את הנתונים. יתר על כן, שיטה זו ניתנת להתאמה אחרים RNA שינוי אנזימים, כולל אנזימים covalently לשנות את המשקל המולקולרי של RNA או הניידות של RNA באמצעות ג'ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הפרוטוקול הותאם מ הפניה למעורר 24.
1. לקבל RNA ואנזים עניין
- השתמש במבחנה עיבד RNAs פנימי עם התווית עם 32P, His6 רקומביננטי-Mod5 לידי ביטוי וטיהרו מ- e. coli, כפי שתואר לעיל24.
- להציג במבחנה עיבד RNAs (סעיף 3) באמצעות T7 RNA פולימראז בנוכחות ATP ללא תווית, זוג שזור, CTP, GTP ו- µCi 10 של ג'ל טהור, זירז אתנול α-ATP, resuspended ב 1 x TE (10 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 0.1 מ מ EDTA), והם מאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס 24.
- לחלופין, להשיג זמינים מסחרית fluorescently שכותרתו RNAs עניין. לייצר את enzyme(s) של עניין בכל מערכת ביטוי מועדף.
התראה: תגים פלורסנט פנימי RNA יכול לשנות מבנה רנ א והכרה על ידי אנזימים.
2. מכינים לזיהוי של 20% Denaturing ג'ל
הערה: על מנת לקבל מספיק ברזולוציה של קטעים RNA, ג'ל לוח אנכי אורך 40 ס"מ מומלץ. הרוחב של הג'ל משמש נקבעת על ידי מספר דוגמאות כדי להיות מנותח.
- ניקוי יסודי צלחות זכוכית. ראשית, לשטוף עם מים וסבון, לשטוף היטב עם מים יונים, ולנקות סוף סוף עם אלכוהול איזופרופיל ומגבונים ללא מוך.
- להרכיב את הצלחות ואת מפרידי.
- לערבב את ריאגנטים הבאים כדי להפוך 100 מ של אקרילאמיד 20%, אוריאה 7.5 מ', ג'ל x TBE 1: 80 מ של שתנן ג'ל להתרכז (237.5 g/L של אקרילאמיד, 12.5 g/L של מתילן bisacrylamide, אוריאה 7.5 מ' במים יונים), 10 מ של שתנן ג'ל diluent (7.5M אוריאה במים יונים) , ו- 10 מ"ל אוריאה ג'ל מאגר (0.89 מ' טריס-בוראט-20 מ מ EDTA מאגר pH 8.3 ו- 7.5 מ' שתנן).
הערה: הנפח של ג'ל הפתרון חייב להיות מותאם על פי הממדים של ג'ל. - להוסיף 40 µL של N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ו- 800 µL של 10% קירור הטרי (APS).
- להכין פתרון ג'ל לתוך מזרק גדול, לדלג בין לוחות זכוכית. הקש על הכוס עם האצבעות בעת המזיגה כדי למנוע היווצרות בועה.
- לאפשר ג'ל שבמהלכו למשך 30 דקות.
- תהדק את ג'ל הקרושה על גבי מכשירים ג'ל אנכית באמצעות קליפים בינדר.
- למלא את מאגר העליון והתחתון צ'יימברס 1 x TBE.
- שעתיים לפני טעינת הג'ל, להפעיל מראש את הג'ל בגיל 20. אימא, 2 h לאפשר את הגבול מאגר לברוח את oligonucleotides הקטן ביותר - אחרת הקטן נוקלאוטידים oligonucleotides נוטים לצמצם בחזית מאגר.
3. RNA Isopentenylation Assay
- להכין בתגובות נפח סופי של 17 µL, המכיל מ 58 טריס-HCl (pH 7.2), 1.2 מ מ ATP, 5.8 מ מ MgCl2, 0.2 מ מ DMAPP, מעכב U של RNase 10 (למשל, SuperRNaseIn), 40,000 CPM מ פנימי 32התווית על-ידי P RNA, מיקרומטר 5.3 Mod5, ו- 1.2 מ מ 2 - mercaptoethanol.
- דגירה תגובות ב 37 ° C עבור 1 h.
- אתנול-התמיסה RNAs שימוש באמצעי אחסון 2.5 (42.5 µL) של 100% אתנול וביו -1/10 כרכים (1.7 µL) של 3.5 מ' סודיום אצטט pH 5.5 והמקום ב-20 ° C 1 h או לילה.
- צנטריפוגה RNA דגימות במשך 20 דקות-15,400 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
- בזהירות להסיר את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר RNA עם 500 µL של 70% אתנול.
- הדוגמאות צנטריפוגה-עבור 5 דקות 15,400 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
- הסר בזהירות את supernatant ואת air-dry RNA כדורי למשך 15 דקות, או עד כל אתנול התאדו.
- Resuspend RNA כדורי ב 10 µL של אוריאה שמונה מ'.
- להוסיף 150 U RNase T1, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- להוסיף 2 µL של 6 x טעינת מאגר (60% גליצרול, 0.1% קסילן cyanol).
- לטעון µL 10 של כל מדגם ה-RNA על לזיהוי מבחו, 20%, ג'ל אוריאה 7.5 מ' (ראו סעיף 2 של פרוטוקול).
הערה: Radiolabeled RNA גודל סולמות עשוי להיות כלול כמו סמן ניידות נוספות. - לרוץ ג'ל ח 2-25 מא.
- עוצרים ג'ל, להסיר את המנגנון.
- הפסקה לאטום בין שתי הזכוכיות ולהסיר באחד הלוחות זכוכית, עם הג'ל שנותרו על צלחת "התחתון".
הערה: להקפיד כדי לא לקרוע את הג'ל במהלך שלב זה. - מניחים שכבה של ניילון נצמד על הג'ל לחשוף על מסך זרחן על ה 3 לחלופין, במקום ג'ל על נייר כרומטוגרפיה, יבש עם ג'ל מייבש לפני חשיפה מסך זרחן.
- תמונת המסך זרחן על imager זרחן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mod5, נדגרה עם טירוזין tRNA או סרין tRNA, נוכחות או היעדרות של DMAPP. בעקבות התגובה השינוי, מוצרים היית RNase T1-מעוכלים, אשר cleaves 3' סוף כל guanosines עוזב בגודל 3' guanosine monophosphates (GMP)24 (איור 1). עיכול מלא של RNAs מפיק דפוס צפוי של שברי radiolabeled (איור 2א), ואז אתה נחוש לזיהוי 20% denaturing ג'ל. ההעברה של קבוצת isopentenyl מ- DMAPP ל הרנ א גורם משמרת ניידות של המקטע המכיל את שאריות ששונתה (איור 1).
פרוטוקול זה מזהה באופן אמין isopentenylation של שאריות tRNA הקנוני והן קאנונית שונה על-ידי Mod524. כך למשל, Mod5 הוא ניבא לשינוי תת-קבוצה של tRNAs, אשר מכילים את שתואר לעיל AAA36-38 רצף דרישה10, כולל של טירוזין tRNA, סרין tRNA השתמשו במחקר זה. Mod5 משנה את שאריות החזוי בנוכחות DMAPP כמצוין על-ידי ה-10 שהוסטו nt AAA36-38 המכיל שרסיס טירוזין tRNA (איור 2B). באופן דומה, כאשר סרין tRNA מודגרת עם Mod5, DMAPP, משמרת מלאה של 10 nt AAA36-38 המכיל מקטע נצפית (איור 2C). מעניין, שינוי חלקי של קטע nt 7 הוא ציין שלא מכיל AAA36-38 (איור 2C). נתונים אלו מראים רצף36-38 AAA ואת המבנה אינם נדרשים לפעילות Mod5 במבחנה ; עם זאת, מחקרים עתידיים באמצעות LC-MS/MS או בשיטות אחרות נדרשים לאשר את מהות הכימי המדויק השינוי.
איור 1 : איור של isopentenyl טרנספראז assay. tRNA, שכותרתו פנימי עם 32P-adeonsine, מוצג incubated עם cerevisiae ס tRNA isopentenyl טרנספראז (Mod5), ATP עם או בלי DMAPP. עמדות A36-לכביש המהיר A38 מצוינים בסמוך לאזור anticodon. כוכביות אדומות מייצגים נוקלאוטידים radiolabeled. בעקבות דגירה, RNAs מתעכל עם RNase T1, חילוץ, נפתרת על-ידי 20% denaturing-דף. ההעברה של קבוצת isopentenyl מ- DMAPP ל tRNA מסומן על ידי להקה מפגר במהלך אלקטרופורזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : RNase T1 עיכול התוצאות מפה ונציג של assay טרנספראז isopentenyl. (א) משולשים שחור מייצגים RNase T1 המחשוף אתרים, קווים שחורים מעל המשולשים מייצגים שברי וכתוצאה מכך מכילים אדנוזין התווית על-ידי P 32אחד לפחות. הם שאריות המסומן אפור חזה אני6א שינוי אתרים (קרי: A37). (ב) טירוזין tRNA, סרין (ג) tRNA פנימי תוויות עם 32P-אדנוזין. Cerevisiae ס isopentenyl טרנספראז, Mod5, נדגרה עם כל ה-RNA בתוך נוכחות או היעדרות של DMAPP. RNAs היו לאחר מכן מתעכל עם RNase T1, נפתר על עמודים denaturing. תלוי DMAPP שהוסטו להקות מצביעים על הנוכחות של משקע RNA ששונה. השינוי החזוי באתר, A37, יסומן בקו תחתון, ששונה A37 שאריות מסומנים בכוכבית. אתר שינוי בלתי צפויות ובלתי מזוהה ומצוינות כמו "אני6A?". דמות זו שונתה מ לקריאה. et al. 24 בעלי הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שינויים RNA להמשיך להציג את ממלאים תפקידים מגוונים וחשובים יותר בתפקוד הסלולר, organismal. ככזה, הפיתוח של מבחני לחקור RNA שינוי אנזימים הוא מרכזי כדי להבין טוב יותר את ההיבטים הבסיסיים של הביולוגיה. פרוטוקול זה מתאר assay ברזולוציה גבוהה במבחנה כדי לאפיין את פעילות שינוי tRNA Mod5.
פרוטוקול זה יש יתרון מובהק של מתן readout isopentenylation ישירה, interpretable בקלות. הפרוטוקול המתואר מאפשר חזקים איפיון ביוכימי של isopentenyl transferases. יתר על כן, מערכת זו יכולה לשמש עם גרסאות או שונו מצעים RNA, המאפשר קביעה ישירה של תפקידים שיש שאריות ספציפי או תחומים על השינוי. כדי להרוויח אפילו יותר רזולוציה, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם כדי לכלול במקביל digestions עם RNases אחרים, כגון RNase P1 ו/או RNase A, אשר קליב על כל ארבעה נוקלאוטידים או C ו- U, בהתאמה.
מגבלה של assay הזה הוא זה תפוקה נמוכה יחסית, ובכך RNAs פחות מסוגל למעשה לנתח בהשוואה ל- RNA-רצף, ספקטרומטר מסה מתקרבת34. לכן, לא מומלץ כי פרוטוקול זה לשמש לאלה שאינם שואפים לזהות רנ א שינוי אתרים transcriptome-wide.... פרוטוקול זה שימושי ביותר לחוקרים המעוניינים בחינת של RNA ספציפיים שינוי האנזים עם RNAs מסוים של עניין. עם זאת, רבים transcriptome רחב מתודולוגיות המשמש לזיהוי שינויים RNA לדרוש תוספת קוולנטיות moiety כימי כדי נוקלאוטיד ששונה. שיטה זו מספקת assay זול ויעיל שבו אחד שתוכלי לבחון שינוי הפרוטוקולים המצע בודדים כדי למטב את שינוי כימי לפני שתתחייב כדי מאמץ transcriptome ברוחב40. למרות פרוטוקול זה מספק וזמינותו פשוטה וישירה כדי לזהות isopentenyl טרנספראז פעילות, כמו זה מתואר כאן, רק את אחוז שונה של השבר RNA הכולל יכול להיות מחושב, בהשוואה בין קבוצות. חוקרים המעוניינים לעשות כמותית אנזים השוואות פעילות חייב לחשב קודם את היחידות של פעילות לפי ריכוז האנזים.
הצלחתה של שיטת מתבסס בעיקר על כמה צעדים קריטיים. חשוב כי בשלמות הרנ א עניין הוא אישר לפני isopentenylation. השפלה של המדגם RNA לפני isopentenyl טרנספראז וזמינותו יכולה להיות השפעה משמעותית על שינוי RNA, וחיסול פרשנות הנתונים. יתר על כן, השפלה כזאת קשה לזהות לאחר עיכול RNase T1 התרחש. לכן, מומלץ כי RNA תקינות נבדק על-ידי denaturing דף. יתר על כן, באופן מלא ומדויק לאפיין את מידת השינוי RNA, זה חיוני כדי להבטיח RNase T1 העיכול יש המשיך עד לסיומו. RNases נוספים, כגון RNase P1 ו/או RNase A, עשוי לשמש לעיכול RNAs במקביל RNase T1 להגדיל את הרזולוציה של זה וזמינותו. Radiolabeled oligonucleotide סולמות של אורך ידוע ואת רצף ודוגמאות מעוכל RNA יכול לשמש כדי להעריך את תהליך העיכול. לבסוף, עבור כמה אנזימים, יחודיות של השינוי תלוי הרנ א להיות במצב מקופל "כהלכה". בעוד tRNAs רוב מסונתז במבחנה מקפלים לתוך מבנים הדומה המבנה שלהם ויוו , זה פחות בטוח עבור מחלקות אחרות של RNAs, במיוחד עם RNAs עוד41.
למרות הפרוטוקול המתואר הוא ספציפי Mod5 isopentenylation של tRNAs, שיטה זו יכול להיות מותאם בקלות לאפיין אנזימים אחרים שינוי RNA covalently להוסיף moiety כימי שמשנה באופן משמעותי את משקל מולקולרי או הניידות ג'ל של הרנ א.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ד ר דוד Engelke שלו הדרכה והערות מועילות על כתב היד הזה. פיג'מה - אוניברסיטת המדינה של הכדור מעבדה הפעלה כספים; כי אמחה קלות - להעניק 1R15AI130950-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
- Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions. Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).
- Soll, D.
- Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA. RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).
- Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA. Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).
- Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications. EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).
- Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation. RNA. 22 (5), 729-742 (2016).
- Caillet, J., Droogmans, L. Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA. Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop. Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).
- Dihanich, M. E., et al. Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).
- Lemieux, J., et al. Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria. Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).
- Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).
- Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells. Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).
- Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase. Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).
- Kernohan, K. D., et al. Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene. Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).
- Yarham, J. W., et al. Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA. PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).
- Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer. Gene. 556 (1), 13-18 (2015).
- Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).
- Swoboda, R. K., et al. Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1. Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).
- Yue, Z., et al. Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information. Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).
- Chen, S., et al. Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population. Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).
- Spinola, M., et al. Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer. Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).
- Spinola, M., et al. Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival. Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).
- Read, D. F., et al. Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing. FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).
- Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro. Gene. 612, 19-24 (2017).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues. Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).
- Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases. Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).
- Lamichhane, T. N., et al. Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).
- Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).
- Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence. Cell. 18 (1), 11-26 (1979).
- Yan, M., et al. A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes. Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).
- Su, D., et al. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry. Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Dominissini, D., et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
- Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Schwartz, S., et al. Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA. Cell. 159 (1), 148-162 (2014).
- Schwartz, S., et al. High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis. Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).
- Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA. Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).
- Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tackling structures of long noncoding RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).
