Summary
Her beskriver vi en protokoll for biokjemiske karakterisering av gjær RNA-modifisere enzym, Mod5, og diskutere hvordan denne protokollen kan brukes til andre RNA-modifisere enzymer.
Abstract
N6- isopentenyladenosine RNA modifikasjoner er funksjonelt varierte og høyt konservert blant prokaryoter og eukaryoter. En av de mest høyt konservert N6- isopentenyladenosine modifikasjonene oppstår ved hovedvei A37 plassering i et delsett av tRNAs. Denne endringen forbedrer oversettelse effektivitet og kvalitet ved å øke affinitet av tRNA for ribosomet. Mutasjon av enzymer som er ansvarlig for denne endringen i eukaryoter er forbundet med flere sykdom stater, inkludert mitokondrie dysfunksjon og kreft. Forstå substrat spesifisitet og biokjemiske aktiviteter av disse enzymer er derfor viktig for forståelse av normal og patologisk eukaryote biologi. Et variert utvalg av metoder har vært ansatt som karakteriserer jeg6en modifikasjoner. Her er beskrevet en direkte tilnærming for påvisning av isopentenylation av Mod5. Denne metoden bruker inkubasjonstiden for RNAs med en rekombinant isopentenyl transferase, etterfulgt av RNase T1 fordøyelsen og 1-dimensjonal geleelektroforese analyse for å oppdage6en modifikasjoner. I tillegg drøftes potensielle tilpasningsevne denne protokollen til å beskrive andre RNA-modifisere enzymer.
Introduction
Minst 163 distinkte posttranscriptional RNA endringer har blitt identifisert, med disse endringene overdragelse varierte og kontekst-avhengige funksjoner til RNAs direkte påvirke RNA struktur og påvirker interaksjoner av RNA med andre molekyler1,2. Som anerkjennelse for antallet og variasjonen av RNA modifikasjoner øker, er det avgjørende å utvikle analyser som kan pålitelig forhøre både RNA endringene og enzymer som katalysere dem.
En av de første RNA modifikasjonene identifiseres skjer ved base 37 i tRNAs, ved siden av anti-codon på 3 side3,4. En isopentenyl gruppe er overført fra dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) til N6 stillingen adenosin 37 (jeg6hovedvei A37) 3,5 på et delsett av både cytoplasmatiske og mitokondrie tRNAs. Jeg6hovedvei A37 forbedrer oversettelse kvalitet og effektivitet ved å øke den tRNA affinitet for ribosom4,6 og jeg6hovedvei A37 er viktig for stressrespons i bakterier7. Enzymer som utfører denne endringen kalles tRNA isopentenyl transferases og er svært bevart i bakterier8,9, sopp10, ormer11, planter12og høyere eukaryoter13 , inkludert mennesker14.
Mutasjoner i menneskelig tRNA isopentenyl transferase genet, TRIT1, er tilknyttet for menneskelig sykdom. For eksempel er en mutasjon i TRIT1 korrelert med en alvorlig mitokondrie sykdom, trolig forårsaket av en feil i mitokondrie protein syntese15,16. Videre TRIT1 har blitt beskrevet som en tumor suppressor genet17,18 og er involvert i flere typer kreft inkludert melanom19, bryst20, mage21og lunge kreft22 ,23. Til slutt, TRIT1 og Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl transferases er utsatt for aggregering proteiner som danner prion-lignende amyloid fiber24,25,26. Disse observasjonene implisere potensielt tRNA isopentenyl transferases i nevrodegenerative sykdommer, selv om direkte bevis for dette ikke har ennå vist.
Gitt rollen som isopentenyl transferases spiller i oversettelse og sykdom, metoder som direkte måler jeg6en isopentenyl transferase aktivitet er viktig for en mekanistisk forståelse av disse enzymer under normal og sykdomstilstander. Et økende antall metoder er tilgjengelige til å oppdage6A RNA endringer, inkludert i vitro isopentenylation analyser, positiv hybridisering i fravær av jeg6en (PHA6) søk, tynne lag kromatografi (TLC), aminosyre aksept aktivitet analyser og massespektrometri tilnærminger (anmeldt i Ref. 4).
I vitro isopentenylation analysen har blitt beskrevet som benytter 14C-DMAPP og umerkede tRNAs. I denne analysen overføres radioaktivt karbon til RNA fra 14C-DMAPP av isopentenyl-transferase. Denne analysen er svært følsom, er det ofte vanskelig å fastslå den spesifikke resten som er endret9,20,27. PHA6 analyser stole på den store jeg6en endring forstyrrer blanding av en 32P-merket probe spenner endret rester. Slik hybridisering er større i fravær av en jeg6en endring18,28,29. PHA6 analyser er svært følsomme og i stand til å analysere total RNA utvunnet fra mobilnettet lysates. I tillegg gir muligheten til å utforme sonder spesielt for RNA rundt denne metoden betydelig målet fleksibilitet. PHA6 analyser er imidlertid begrenset til karakterisering av endringer som skjer på rester i målrettede området av sonden og er derfor mindre sannsynlig å identifisere romanen endring områder. I tillegg som fravær av binding er et tegn på endring, vil andre endringer eller mutasjoner som påvirker RNA bindende forvirre dataanalyse.
En annen tilnærming kombinerer benzyl DEAE cellulose (BD) cellulose kromatografi med aminosyre aksept aktivitet som en presentasjon av jeg6en endringer i tRNA30. Denne tilnærmingen direkte søk funksjonen av i6en endring, men det er en indirekte oppdage6en endring og mangler oppløsning å kartlegge endringer i en bestemt rester i RNA. En TLC tilnærming er brukt til å oppdage totalt tRNA jeg6en modifikasjoner. I denne tilnærmingen, internt 32P-merket tRNAs er fordøyd å enkelt nukleotider og todimensjonal TLC analyse brukes til å identifisere isopentenylation. Denne fremgangsmåten er svært følsom oppdage totalt jeg6en i en gitt RNA prøve men på fordøyelsen, alle oppstartsrekkefølgen er tapt; Dermed har etterforskeren ingen måte å bestemme hvilke rester er endret31.
Flere nylig, flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) metoder har blitt utviklet som kvantitativt sammenligner totalt RNA endringer mellom arter, celletyper og eksperimentelle forhold32,33, 34. En begrensning av denne metoden er at det er mindre i stand til å bestemme identiteten og posisjon i RNA som den endrede nukleosid var avledet34. Videre begrense kompetanse og utstyr som er nødvendig for å utføre disse eksperimentene praktisk bruk av denne tilnærmingen.
I tillegg er flere neste generasjons sekvensering teknologi utviklet for å tilordne RNA endringer transcriptome hele34. Immunoprecipitation av RNAs med antistoffer spesifikke for en bestemt endring (RIP-Seq) aktiverer etterforskeren å identifisere alle sekvenser som inneholder en bestemt endring35,36. I tillegg stole revers transkriptase tilnærminger som Chem-Seq og ikke tilfeldig konflikt sekvensering på forstyrrelser av omvendt transkripsjon reaksjon på endrede rester37,38,39. Til tross for fordelen av disse teknikkene til å tilordne RNA endringer transcriptome hele, er RIP-seq og Chem-Seq teknologier begrenset av mangel på pålitelige antistoffer eller reaktive kjemikalier tilgjengelig for hver bestemte endringer, henholdsvis34. Videre revers transkriptase enzym kreves for å utføre Chem-Seq og ikke tilfeldig konflikt sekvensering teknikker kan hindres av stabil RNA. TRNAs svært modifisert og strukturelt stabil natur gjør dem spesielt vanskelig å forhøre disse teknikkene. Hittil har neste generasjons sekvensering-baserte teknologier ikke ennå blitt benyttet til map6en modifikasjoner34.
Her beskriver vi en enkel og direkte tilnærming til å oppdage6en tRNA endringer i vitro. Denne metoden bruker inkubasjonstiden for RNAs med rekombinant S. cerevisiae isopentenyl transferase (Mod5), etterfulgt av RNase T1 fordøyelsen og 1-dimensjonal geleelektroforese analyse til map6en modifikasjoner. Denne tilnærmingen er direkte og krever lite spesialisert kompetanse til å analysere dataene. Videre, denne metoden er tilpasningsdyktig til andre RNA endre enzymer, inkludert enzymer som covalently endrer molekylvekt av RNA eller en RNA mobilitet gjennom en gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Protokollen ble tilpasset fra Ref. 24.
1. få RNA og enzym rundt
- Bruk i vitro transkribert RNAs internt merket med 32P, og rekombinant His6-Mod5 uttrykt i og renset fra E. coli, som beskrevet tidligere24.
- Introdusere i vitro transkribert RNAs (del 3) bruker T7 RNA polymerase i nærvær av umerkede ATP, UTP, CTP, GTP og 10 µCi gel-renset, etanol-igangsatte α-ATP, resuspended i 1 x TE (10 mM Tris-HCl pH 7.5 0,1 mM EDTA) og lagret på-80 ° C 24.
- Du kan også få kommersielt tilgjengelig fluorescently merket RNAs rundt. Produsere enzyme(s) rundt i ethvert system med foretrukket uttrykk.
Forsiktig: Intern fluorescerende koder i RNA kan endre RNA struktur og anerkjennelse av enzymer.
2. Forbered en 20% polyakrylamid Denaturing Gel
Merk: For å få tilstrekkelig oppløsning av RNA fragmenter, en 40 cm lengde loddrett skive gel anbefales. Bredden på gel brukes bestemmes av antall eksempler som skal analyseres.
- Rengjør glassplater. Først vaske med såpe og vann, skyll godt med deionisert vann, og til slutt ren med isopropanol og lofri kluter.
- Montere platene og avstandsstykker.
- Bland følgende reagensene å gjøre 100 mL 20% akrylamid, 7,5 meter urea, 1 x TBE gel: 80 mL av urea gel konsentrere (237.5 finans av akrylamid, 12.5 finans av methylene bisacrylamide, 7,5 meter urea i deionisert vann), 10 mL av urea gel fortynner (7.5M urea i deionisert vann) , og 10 mL urea gel buffer (0.89 M Tris-Borate-20 mM EDTA buffer pH 8.3 og 7.5 M urea).
Merk: Volumet av gel løsning må justeres i henhold til dimensjonene av gel. - Legge til 40 µL av N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) og 800 µL av nylagde 10% ammonium persulfate (APS).
- Utarbeide gel løsning til en stor sprøyte og dispensere mellom glassplater. Trykk på glass med fingrene mens pouring for å hindre boble formasjon.
- Tillate gel å stivne i 30 min.
- Klemme befestet gel på loddrett gel apparater bruker bindemiddel klipp.
- Fylle øvre og nedre buffer kamre med 1 x TBE.
- To timer før lasting gel, kjøre pre gel på 20 mA, 2 h å tillate buffer grensen å løpe de minste oligonucleotides - ellers den minste nukleotider og oligonucleotides tendens til å kollapse midt på bufferen.
3. RNA Isopentenylation analysen
- Forbereder reaksjoner i et siste volum på 17 µL, som inneholder 58 mM Tris-HCl (pH 7.2), 1.2 mM ATP, 5,8 mM MgCl2, 0.2 mM DMAPP, 10 U av RNase hemmer (f.eksSuperRNaseIn), 40.000 CPM internt 32P-merket RNA, 5,3 µM Mod5, og 1,2 mM 2 - mercaptoethanol.
- Inkuber reaksjoner på 37 ° C i 1 time.
- Etanol-utløse RNAs bruker 2,5 volumer (42,5 µL) 100% etanol og 1/10 volumer (1,7 µL) 3,5 natrium acetate pH 5.5 og sted ved 20 ° C for 1 time eller over natten.
- Sentrifuge RNA prøver for 20 min på 15 400 x g og 4 ° C.
- Nøye fjerne nedbryting og vask RNA pellets med 500 µL av 70% etanol.
- Sentrifuger eksempler på for 5 min 15 400 x g og 4° C.
- Fjern forsiktig RNA pellets supernatant og air-dry i 15 minutter, eller til alle etanol har fordampet.
- Resuspend RNA pellets i 10 µL av 8 M urea.
- Tilsett 150 U av RNase T1 og ruge på 37 ° C over natten.
- Legg 2 µL av 6 x lasting buffer (60% glyserol, 0,1% xylen cyanol).
- Laste inn 10 µL av hver RNA prøve på en pre løp, 20% polyakrylamid, 7,5 meter urea gel (se § 2 i protokollen).
Merk: Radiolabeled RNA størrelse stiger kan bli inkludert som en ekstra mobilitet markør. - Kjøre gel 2 h 25 mA.
- Stopp gel og fjerne fra apparatet.
- Pause sel mellom de to glassplater og fjerne en av glassplater, med gel på "bunnplaten".
Merk: ta vare ikke for å rive gel i dette trinnet. - Plasser et lag med plastfolie over gel og utsette på fosfor skjerm for 3 h. Alternativt, plasser gel på kromatografi papir og tørr med en gel tørketrommel før fosfor skjermen eksponering.
- Bilde fosfor skjermen på en fosfor imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mod5 ble inkubert med en tyrosin tRNA eller serine tRNA i tilstedeværelse eller fravær av DMAPP. Etter modifisering reaksjonen var produkter RNase T1-fordøyd, som innstiftet 3 slutten av alle guanosines forlate en 3 guanosine monophosphates (GMP)24 (figur 1). Full fordøyelsen av RNAs produserer et forutsigbart mønster av radiolabeled fragmenter (figur 2A), som er så løst på en 20% polyakrylamid denaturing gel. Overføring av en isopentenyl fra DMAPP til RNA fører et mobilitet skifte av fragment som inneholder det endrede resten (figur 1).
Denne protokollen oppdager pålitelig isopentenylation av både kanoniske og ikke-kanoniske tRNA rester modifisert av Mod524. For eksempel Mod5 er spådd til å endre et delsett av tRNAs, som inneholder beskrevet tidligere AAA36-38 sekvens krav10, inkludert tyrosin tRNA og serine tRNA brukt i denne studien. Mod5 endrer den anslåtte resten i nærvær av DMAPP som er angitt av skiftet 10 nt AAA36-38 inneholder tekstfragment i tyrosin tRNA (figur 2B). Tilsvarende, når serine tRNA er ruges med Mod5 og DMAPP, en komplett Skift av 10 nt AAA36-38 inneholder fragment er observert (figur 2C). Interessant, er en delvis forskyvning av en 7 nt-fragment observert som ikke inneholder AAA36-38 (figur 2C). Disse data tyder på at AAA36-38 sekvensen og struktur ikke er nødvendig for Mod5 i vitro aktivitet. imidlertid må fremtidige studier med LC--MS-/ MS eller andre metoder bekrefte nøyaktige kjemisk natur endring.
Figur 1 : Illustrasjon av isopentenyl transferase analysen. tRNA, internt merket med 32P-adeonsine, vises inkubert med S. cerevisiae tRNA isopentenyl transferase (Mod5) og ATP med eller uten DMAPP. Posisjoner A36-A38 angis ved regionen anticodon. Røde stjerner representerer radiolabeled nukleotider. Etter inkubasjon RNAs fordøyd med RNase T1, pakket ut og løses ved 20% denaturing-siden. Overføring av en isopentenyl fra DMAPP til tRNA angis av en tilbakestående bandet under geleelektroforese. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : RNase T1 fordøyelsen kart og representant resultatene av isopentenyl transferase analysen. (A) trekanter representerer RNase T1 cleavage nettsteder, og svarte linjer over trekanter representerer resulterende fragmenter som inneholder minst ett 32P-merket adenosin. Grå uthevede rester er spådd jeg6en endring nettsteder (dvs. hovedvei A37). (B) tyrosin tRNA og (C) serine var internt tRNA merket med 32P-adenosin. S. cerevisiae isopentenyl transferase, Mod5, ble inkubert med hver RNA i tilstedeværelse eller fravær av DMAPP. RNAs ble deretter fordøyd med RNase T1 og løst på denaturing-siden. Skiftet band avhengig av DMAPP indikerer tilstedeværelse av en modifisert RNA rester. Webområdet spådd modifisering, motorveien A37, understrekes, og endret hovedvei A37 rester er merket med en stjerne. En uforutsett og romanen endring nettstedet er identifisert og angitt som "jeg6en?". Dette tallet har blitt endret fra lese et al. 24 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA modifikasjoner fortsette å vises å spille stadig mer viktig og ulike roller i mobilnettet og organismebiologi funksjon. Slik er utvikling av analyser avhøre RNA endre enzymer sentralt for bedre forstå de grunnleggende sidene ved biologi. Denne protokollen beskriver en høy oppløsning i vitro analysen betegner tRNA endring aktiviteten til Mod5.
Denne protokollen har klar fordel av å gi en direkte og enkelt interpretable avlesning av isopentenylation. Protokollen beskrevet gir robust biokjemiske karakterisering av isopentenyl transferases. Videre, dette systemet kan brukes med enzym varianter eller endret RNA underlag, slik at for direkte fastsettelse av roller som bestemte rester eller domener har på endring. For å få enda større oppløsning, kan denne protokollen lett tilpasses med parallell digestions med andre RNases, som RNase P1 og/eller RNase A, som holde seg på alle fire nukleotider eller C og U, henholdsvis.
En begrensning av denne analysen er at det er relativt lav gjennomstrømming og dermed færre RNAs som kan analyseres praktisk sammenlignet RNA-sekvensering og massespektrometri tilnærminger34. Derfor anbefales det ikke at denne protokollen brukes til de som mål å identifisere RNA endring nettsteder transcriptome hele. Denne protokollen er nyttigst for etterforskerne som er interessert i å undersøke et bestemt RNA endring av enzymet med bestemte RNAs av interesse. Men krever mange transcriptome bredt metoder brukes til å identifisere RNA endringer kovalente tillegg av en kjemisk moiety til en modifisert nukleotid. Denne metoden gir en billig og effektiv analysen der en kan teste endring protokoller på en individuell substrat å optimalisere kjemisk endring før du forplikter deg til en transcriptome-bred innsats40. Selv om denne protokollen gir en enkel og direkte analysen for å oppdage isopentenyl transferase aktivitet, slik det er beskrevet her, kan bare prosent endret av totale RNA fragment beregnes og forhold mellom grupper. Forskere interessert sammenlikner kvantitative enzym aktivitet må først beregne enhetene med aktivitet per konsentrasjon av enzymet.
Suksess med denne metoden avhenger svært mye av noen viktige skritt. Det er viktig at integriteten til RNA rundt bekreftes før isopentenylation. Nedbrytning av RNA prøven før isopentenyl transferase analysen kan ha en betydelig effekt på RNA modifikasjoner og forvirre data tolkning. Videre er slike fornedrelse vanskelig å oppdage etter RNase T1 fordøyelsen har funnet sted. Det anbefales derfor at RNA integritet kontrolleres av denaturing siden. Videre å fullstendig og nøyaktig karakterisere omfanget av RNA endring, er det viktig å sikre RNase T1 fordøyelsen har gått til ferdigstillelse. Flere RNases, som RNase P1 og/eller RNase A, kan brukes å fordøye RNAs parallelt med RNase T1 for å øke oppløsningen for denne analysen. Radiolabeled oligonucleotide stiger kjent lengde, sekvens og ufordøyd RNA prøver kan brukes til å vurdere fordøyelsen. Endelig avhenger noen enzymer, spesifisitet av endring RNA i "riktig" falset staten. Mens de fleste tRNAs syntetisert i vitro fold i strukturer som ligner strukturen i vivo , er dette mindre sikkert for andre klasser av RNAs, spesielt med lengre RNAs41.
Selv om protokollen beskrevet spesifikke for Mod5 isopentenylation av tRNAs, kan denne metoden være enkelt tilpasses til å beskrive andre RNA-modifisere enzymer covalently legger en kjemisk moiety som vesentlig endrer molekylvekt eller gel mobilitet RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dr. David Engelke for hans veiledning og nyttige kommentarer på dette manuskriptet. PJS - Ball State University laboratorium oppstart kapital; DAB - gi 1R15AI130950-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
- Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions. Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).
- Soll, D.
- Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA. RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).
- Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA. Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).
- Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications. EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).
- Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation. RNA. 22 (5), 729-742 (2016).
- Caillet, J., Droogmans, L. Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA. Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop. Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).
- Dihanich, M. E., et al. Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).
- Lemieux, J., et al. Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria. Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).
- Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).
- Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells. Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).
- Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase. Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).
- Kernohan, K. D., et al. Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene. Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).
- Yarham, J. W., et al. Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA. PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).
- Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer. Gene. 556 (1), 13-18 (2015).
- Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).
- Swoboda, R. K., et al. Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1. Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).
- Yue, Z., et al. Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information. Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).
- Chen, S., et al. Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population. Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).
- Spinola, M., et al. Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer. Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).
- Spinola, M., et al. Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival. Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).
- Read, D. F., et al. Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing. FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).
- Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro. Gene. 612, 19-24 (2017).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues. Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).
- Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases. Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).
- Lamichhane, T. N., et al. Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).
- Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).
- Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence. Cell. 18 (1), 11-26 (1979).
- Yan, M., et al. A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes. Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).
- Su, D., et al. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry. Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Dominissini, D., et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
- Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Schwartz, S., et al. Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA. Cell. 159 (1), 148-162 (2014).
- Schwartz, S., et al. High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis. Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).
- Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA. Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).
- Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tackling structures of long noncoding RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).
