Summary
Здесь мы описываем протокол для биохимических характеристик РНК изменение фермента дрожжей, Mod5 и обсудить, как этот протокол может применяться для других РНК модификация ферментов.
Abstract
N6- isopentenyladenosine РНК изменения функционально различных и весьма сохраняется среди прокариот и эукариот. Одним из наиболее сохранившихся N6- isopentenyladenosine изменений происходит в A37 позиции в подмножестве tRNAs. Эта модификация повышает эффективность перевода и верности, увеличивая сродство tRNA для рибосомы. Мутация ферментов, ответственных за этой модификации в эукариот связаны с несколькими государствами болезни, включая митохондриальной дисфункции и рак. Таким образом понимание субстратная специфичность и биохимические деятельности этих ферментов имеет важное значение для понимания нормальных и патологических эукариотических биологии. Разнообразные методы был нанят для характеристики я6A изменения. Здесь будет описано прямой подход для выявления isopentenylation по Mod5. Этот метод использует инкубации РНК с рекомбинантным изопентенил трансферазы, следуют RNase T1 пищеварение и 1-мерного гель электрофорез анализ для выявления я6A изменения. Кроме того обсуждаются потенциальные адаптируемость настоящего Протокола охарактеризовать другие изменения РНК ферменты.
Introduction
Было выявлено по крайней мере 163 отдельных модификаций посттранскрипционного РНК, с этими изменениями, предоставление разнообразных и контекстно зависимые функции РНК, непосредственно влияющие на структуре РНК и затрагивающих взаимодействия РНК с другими молекулы1,2. С увеличением признательность за количество и разнообразие модификаций РНК, важно развивать анализов, которые могут надежно допросить изменения РНК и ферменты, которые катализируют их.
Одним из первых изменений РНК идентифицировать происходит на базовый 37 в tRNAs, прилегающих к борьбе с кодоном на 3' стороне3,4. Группа изопентенил передается от dimethylallylpyrophosphate (ДМАФФ) в положение N6 аденозина 37 (я6A37) 3,5 на подмножестве цитоплазмы и митохондриальной tRNAs. я6A37 улучшает верности перевода и эффективности путем увеличения tRNA сродства рибосома4,6 и я6A37 имеет важное значение для реакции на стресс в бактерии7. Ферменты, которые выполняют эту модификацию называются трансферазы изопентенил тРНК и хорошо сохранились в бактерии8,9,10грибов, червей11, растения12и высших эукариот13 , включая14людей.
Мутации в изопентенил человека tRNA трансферазы генов, TRIT1, связаны с заболеваний человека. Например мутации в TRIT1 коррелирует с тяжелой формой болезни митохондрий, скорее всего вызвана дефектом синтеза белков митохондриальных15,16. Кроме того был описан как опухоль подавитель гена17,18 TRIT1 и замешан в нескольких типов рака, меланомы19, груди20, желудка21и рака легких22 ,23. Наконец TRIT1 и Mod5 изопентенил трансферазы (Saccharomyces cerevisiae) являются подверженных агрегации белков, которые формируют волокон амилоида китовая птичка как24,25,26. Эти наблюдения потенциально затрагивать трансферазы изопентенил tRNA в нейродегенеративных заболеваний, хотя прямых доказательств для этого еще не было показано.
Учитывая роль изопентенил трансферазы в перевод и болезней, методы, которые непосредственно измерить я6играть деятельность трансферазы изопентенил важны для механистического понимания этих ферментов в нормальных и болезни государства. Все большее количество методов для выявления я6РНК изменений, в том числе в пробирке isopentenylation анализов, позитивные гибридизации в отсутствие я6(PHA6) assays, тонкий слой хроматографии (ТСХ), аминокислоты прием анализов деятельности и масс-спектрометрии подходы (Проверено в ссылка 4).
Был описан в пробирке isopentenylation assay который использует 14C-ДМАФФ и непомеченного tRNAs. В этот assay радиоактивного углерода передается РНК из 14C-ДМАФФ изопентенил трансферазы. Хотя этот assay очень чувствительна, часто бывает трудно определить, что конкретные остатки, изменен9,20,27. PHA6 assays полагаются на громоздкие я6A модификация, мешая гибридизация зонда 32P-меченых охватывающих изменение остатков. Таким образом, гибридизация больше в отсутствие я6модификация18,,2829. PHA6 анализов весьма чувствительны и способны анализа всего РНК, извлеченные из клеточных лизатов. Кроме того возможность разработки конкретных зонды для РНК интерес дает гибкость существенной цели этот метод. Однако PHA6 анализов, ограничиваются характеристика изменений, которые происходят на остатки в рамках целевого региона зонда и поэтому менее склонны идентифицировать новые модификации сайтов. Кроме того как отсутствие привязки является показателем изменения, другие модификации или мутации, которые влияют на РНК привязки будет смешивать анализа данных.
Другой подход сочетает бензил открытое целлюлозы (BD) целлюлозы хроматографии с аминокислоты признание деятельности как индикация я6A изменения в tRNA30. Этот подход непосредственно assays функции i модификация6A, но он является косвенный подход для выявления я6A модификация и не хватает резолюции для сопоставления изменений в конкретные остатков в РНК. TLC подход был использован для обнаружения всего tRNA я6A изменения. В этом подходе внутренне 32P-меченых tRNAs перевариваются в одном нуклеотидов и двумерных TLC анализ используется для идентификации isopentenylation. Этот подход очень чувствительна в выявлении всего я6A в данной выборке РНК, но после переваривания, теряется вся информация последовательности; Таким образом следователь не имеет возможности определить, какие остатки были изменение31.
Совсем недавно, жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии (LC-MS/MS) были разработаны методы которые количественно сравнить общее РНК изменения между видами, типы клеток и экспериментальных условиях32,33, 34. Ограничением этой методики является в меньшей степени способны определить, что личность и положение внутри РНК, из которого модифицированных нуклеозидов был производным34. Кроме того опыт и оборудование, необходимое для выполнения этих экспериментов ограничивают практичность этого подхода.
Кроме того были разработаны несколько технологий следующего поколения последовательности для сопоставления РНК модификации транскриптом общесистемной34. Иммунопреципитация РНК с антител специфических для конкретной модификации (RIP-Seq) позволяют следователю для выявления всех последовательностей, содержащих конкретные модификации35,36. Кроме того подходов, основанных на обратной транскриптазы, такие Chem-Seq и неслучайных несоответствие последовательности полагаются на возмущения обратной транскрипции реакции на изменение остатков37,,3839. Несмотря на преимущество этих методов сопоставления РНК модификации транскриптом общесистемной RIP-seq и Chem-Seq технологии ограничены отсутствием надежных антител или реактивной химических веществ, доступных для каждой конкретной модификации, соответственно34. Кроме того обратная транскриптаза ферменты, необходимые для выполнения Chem-Seq и методы неслучайной несоответствие последовательности может сдерживаться стабильных структур РНК. Сильно изменен и структурно стабильный характер tRNAs сделать их особенно трудно допросить с помощью этих методов. На сегодняшний день, технологии следующего поколения на основе последовательности не еще были использованы для сопоставления я6изменения34.
Здесь мы опишем простой и прямой подход для выявления я6A tRNA изменения в пробирке. Этот метод использует инкубации РНК с рекомбинантной S. cerevisiae изопентенил трансферазы (Mod5), следуют RNase T1 пищеварение и анализ электрофорез 1-мерного гель для сопоставления я6A изменения. Этот подход является прямым и требует мало специалистов для анализа данных. Кроме того этот метод адаптируется для других РНК, изменяя ферментов, в том числе ферментов, которые ковалентно изменить молекулярная масса РНК или РНК мобильности через гель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Протокол был адаптирован от Ref. 24.
1. получить РНК и фермента интереса
- Использование в vitro транскрипции РНК, внутренне помечены 32P, и рекомбинантных His6-Mod5 в и очищенного от кишечной палочки, как описано24.
- Ввести в vitro транскрипции РНК (раздел 3) используя T7 РНК-полимеразы в присутствии немеченого АТФ, UTP, CTP, GTP и 10 Μки гель очищенный, этанол осаждают α-АТФ, высокомобильна в 1 x TE (рН 7,5, 0,1 мм ЭДТА 10 мм трис-HCl) и температуре-80 ° C 24.
- Кроме того получите коммерчески доступных дневно обозначенные RNAs интерес. Производят enzyme(s) интерес к любой системе предпочтительным выражение.
Предупреждение: Внутренний флуоресцентные метки в РНК может изменить структуры РНК и признание ферментами.
2. Подготовьте 20% полиакриламида Денатурирующий гель
Примечание: Чтобы получить достаточное разрешение фрагменты РНК, рекомендуется гель вертикальные плиты длиной 40 см. Ширина геля используется определяется количество проб для анализа.
- Тщательно очистите стеклянные пластины. Во-первых вымыть с мылом и водой, хорошо промойте деионизованной водой и наконец чистый изопропиловый спирт и безворсовой салфетки.
- Соберите пластины и прокладки.
- Смешайте следующие реагентов сделать 100 мл 20% акриламида, мочевина 7,5 М, 1 гель x TBE: 80 мл геля мочевины концентрат (237.5 г/Л акриламида, 12,5 г/Л bisacrylamide метиленовой, 7,5 М мочевины в деионизированной воде), 10 мл разбавителя гель мочевины (7.5M мочевины в деионизированной воде) и 10 мл мочевины гель буфера (0.89 М трис-Борат-20 мм ЭДТА буфер рН 8.3 и 7,5 М мочевины).
Примечание: Объем гель решения должны быть скорректированы по размерам геля. - 40 мкл N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) и 800 мкл свежеприготовленные Персульфат аммония 10% (APS).
- Нарисуйте решения гелем в большой шприц и распределять между пластинами стекла. Нажмите на стекле пальцами во время заливки для предотвращения формирования пузыря.
- Разрешить гель закрепить за 30 мин.
- Зажим затвердевших геля на вертикальных гель аппарат с помощью зажимы.
- Заполнения буфера верхняя и Нижняя камеры с 1 x TBE.
- Два часа до погрузки гель, предварительно запустите гель 20 мА, 2 h разрешить границы буфера обогнать маленьких олигонуклеотидов - в противном случае наименьший нуклеотидов и олигонуклеотидов склонны свернуть в передний буфер.
3. РНК Isopentenylation Assay
- Подготовить реакции в окончательном объеме 17 мкл, содержащий 58 мм трис-HCl (рН 7,2), 1,2 мм АТФ, 5,8 мм MgCl2, 0,2 мм ДМАФФ, 10 U РНКазы ингибитора (например, SuperRNaseIn), 40000 CPM внутренне 32P-меченых РНК, 5.3 мкм Mod5 и 1,2 мм 2 - меркаптоэтанолом.
- Инкубируйте реакции при 37 ° C в течение 1 ч.
- Этанол осадок РНК, с использованием 2,5 томов (42,5 мкл) 100% этанола и 1/10 томов (1.7 мкл) 3,5 М натрия ацетата рН 5,5, а место при-20 ° C для 1 h или на ночь.
- Центрифугуйте образцы РНК для 20 минут 15,400 x g и 4 ° C.
- Тщательно удалить супернатант и помыть лепешка РНК с 500 мкл на 70% спирте.
- Центрифуга образцы на 5 минут 15,400 x g и 4° C.
- Осторожно удалите супернатант и воздушно-сухой РНК гранул на 15 мин, или до тех пор, пока все этанола испарилась.
- Ресуспензируйте РНК окатышей в 10 мкл 8 M мочевины.
- Добавить 150 U RNase T1 и инкубировать и при 37 ° C на ночь.
- 2 мкл 6 x загрузки буфера (60% глицерина, 0.1% ксилола cyanol).
- Загрузите 10 мкл каждого образца РНК на предварительного хода, 20% полиакриламида, 7,5 М мочевиной гель (см. раздел 2 протокола).
Примечание: Размер лестницы Radiolabeled РНК могут быть включены как маркер дополнительную мобильность. - Побегите гель на 2 ч 25 мА.
- Остановить гель и снимите с аппарата.
- Перерыв уплотнение между двух стеклянных пластин и удалить один из стекла, с гелем, оставшиеся на пластину «снизу».
Примечание: не заботиться слеза гель во время этого шага. - Поместите гель слоем полиэтиленовой пленкой и разоблачить на экране фосфора на 3 ч. Кроме того, поместите гель на бумаге хроматографии и сухой с сушилкой перед воздействием люминофора экрана гель.
- Изображения люминофора экрана на тепловизор фосфора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mod5 был инкубировали с тирозин tRNA или Серин tRNA в наличие или отсутствие ДМАФФ. После изменения реакции товары были RNase T1-переваривается, который расщепляет 3' конца всех guanosines, оставляя 3' гуанозина monophosphates (GMP)24 (рис. 1). Полное усвоение RNAs производит предсказуемой radiolabeled фрагментов (рисA), которые затем решаются на 20% полиакриламида Денатурирующий гель. Передачи изопентенил группы из ДМАФФ РНК приводит перенос удобоподвижности фрагмента, содержащего измененные остатки (рис. 1).
Этот протокол надежно обнаруживает isopentenylation остатков канонического и неканонических tRNA изменена Mod524. К примеру, Mod5 по прогнозам изменения подмножества tRNAs, которые содержат вышеописанные ААА36-38 последовательности требование10, включая тирозин тРНК и серина tRNA используемые в данном исследовании. Mod5 изменяет прогнозируемый остаток в присутствии ДМАФФ как обозначается сдвигом 10 nt AAA36-38 , содержащий фрагмент в тирозин tRNA (рис. 2B). Аналогичным образом, когда Серина tRNA инкубировали с Mod5 и ДМАФФ, полный сдвиг 10 nt AAA36-38 , содержащий фрагмент наблюдается (рис. 2C). Интересно, что частичное смещение фрагмента 7 nt наблюдается, которые не содержат AAA36-38 (рис. 2C). Эти данные позволяют предположить, что AAA36-38 последовательность и структура не требуются для Mod5 в пробирке деятельности; Однако будущих исследований с использованием LC-MS/MS или другие методы необходимы для подтверждения точный характер химической модификации.
Рисунок 1 : Иллюстрация пробирного трансферазы изопентенил. tRNA, внутренне помечены 32P-adeonsine, показано инкубируют с S. cerevisiae тРНК изопентенил трансферазы (Mod5) и СПС с или без ДМАФФ. Позиции А36-A38 указаны рядом с антикодон региона. Красные звездочки представляют radiolabeled нуклеотидов. После инкубации РНК переваривается с RNase T1, извлекаются и решается денатурации 20%-страницы. Передачи изопентенил группы из ДМАФФ tRNA указывается отсталые группы во время электрофореза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : RNase T1 пищеварение карта и представитель результаты assay трансферазы изопентенил. (A) черные треугольники представляют RNase T1 расщепления сайтов, а черные линии выше треугольники результирующие фрагменты, которые содержат по крайней мере один 32P-меченых аденозина. Серый выделенный остатков являются предсказал я6A модификация сайты (то есть, A37). (B) Серина (C) и тирозин tRNA tRNA внутренне были помечены 32P-аденозин. S. cerevisiae трансферазы изопентенил, Mod5, был инкубировали с каждой РНК в наличие или отсутствие ДМАФФ. РНК были затем переваривается с RNase T1 и решены на денатурации странице. Смещенные полосы зависит от ДМАФФ указывают на наличие изменение остатков РНК. Прогнозируемые изменения сайта, A37, подчеркнул, и изменение остатков A37 помеченные звездочкой. Непредвиденные и новые модификации сайта определяется и указано как «я6A?». Эта цифра была изменена от чтения и др. 24 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изменения РНК продолжают отображаться играть все более важную и разнообразные роли в клеточном и научные функции. Таким образом разработка анализов допросить РНК, изменяя ферменты центральное значение для лучшего понимания основополагающих аспектов биологии. Этот протокол описывает высокого разрешения в vitro пробирного характеризовать деятельность tRNA модификация Mod5.
Этот протокол имеет явное преимущество предоставления прямой и легко интерпретируемых индикация isopentenylation. Протокол описал обеспечивает надежный биохимическая характеристика изопентенил трансферазы. Кроме того эта система может использоваться с вариантами фермента или изменения РНК субстратов, позволяя для непосредственного определения ролей, которые домены или конкретными остатков на модификации. Чтобы получить еще большее разрешение, этот протокол легко могут быть адаптированы к включать параллельно пищеварения с другими полиадениновый, например РНКазы P1 или РНКазы A, которые Рассекающий удар на всех четырех нуклеотидов или C и U, соответственно.
Этот assay ограничение заключается в том, что это сравнительно низкой пропускной способности и таким образом меньше молекул РНК, которые могут быть проанализированы практически по сравнению с РНК последовательности и масс-спектрометрии подходы34. Поэтому не рекомендуется использовать этот протокол для тех, кто стремится выявить РНК модификации сайтов транскриптом широкий. Этот протокол является наиболее полезным для следователей, которые заинтересованы в изучении конкретных РНК, изменяя фермента с конкретной RNAs интерес. Однако многие транскриптом широкий методологий, используемых для определения РНК изменения требуют ковалентных добавления химических общие для модифицированных нуклеотидов. Этот метод обеспечивает экономичные и эффективные пробирного, где одно может испытать протоколы изменения на отдельных субстрат для оптимизации химической модификации до совершения транскриптом общесистемных усилий40. Хотя этот протокол обеспечивает простой и прямой проба для выявления изопентенил трансферазы деятельности, как это описано здесь, только процент изменения всего фрагмент РНК может рассчитывается и сравнении между группами. Исследователей, заинтересованных в принятии количественных фермента сравнения деятельности необходимо сначала вычислить единиц активности за концентрации фермента.
Успех этот метод опирается на несколько важных шагов. Важно, что целостность РНК интерес подтверждается до isopentenylation. Деградации РНК образца до изопентенил assay трансферазы может иметь существенное влияние на изменения РНК и смешаем интерпретации данных. Кроме того такая деградация трудно обнаружить после переваривания RNase T1 имело место. Поэтому рекомендуется, что целостность РНК проверяется денатурации страницы. Кроме того чтобы полностью и точно характеризуют степень изменения РНК, важно убедиться, что пищеварение RNase T1 приступила к завершению. Дополнительные полиадениновый, например РНКазы P1 или РНКазы A, может использоваться для дайджест RNAs параллельно с RNase T1 для увеличения разрешения этот assay. Radiolabeled олигонуклеотида лестницы известной длины и последовательности и непереваренных образцов РНК может использоваться для оценки пищеварение. И наконец для некоторых ферментов, специфика модификации зависит от РНК, находясь в «правильно» сложенном состоянии. Хотя большинство tRNAs синтезированные в vitro раза в структуры, напоминающие их структуры в естественных условиях , это менее определенные для других классов РНК, особенно с более RNAs41.
Хотя протокол, описанный для Mod5 isopentenylation tRNAs, этот метод может быть легко адаптирована для характеристики других РНК изменение ферменты, которые ковалентно добавить химических остаток, который значительно изменяет молекулярного веса или гель мобильности РНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дэвида Engelke за его руководство и полезные комментарии на этой рукописи. PJS - Ball государственного университета Лаборатория запуска средств; DAB - Грант 1R15AI130950-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
- Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions. Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).
- Soll, D. Enzymatic modification of transfer RNA. Science. 173 (3994), 293-299 (1971).
- Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA. RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).
- Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA. Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).
- Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications. EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).
- Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation. RNA. 22 (5), 729-742 (2016).
- Caillet, J., Droogmans, L. Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA. Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop. Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).
- Dihanich, M. E., et al. Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).
- Lemieux, J., et al. Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria. Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).
- Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).
- Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells. Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).
- Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase. Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).
- Kernohan, K. D., et al. Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene. Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).
- Yarham, J. W., et al. Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA. PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).
- Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer. Gene. 556 (1), 13-18 (2015).
- Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).
- Swoboda, R. K., et al. Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1. Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).
- Yue, Z., et al. Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information. Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).
- Chen, S., et al. Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population. Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).
- Spinola, M., et al. Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer. Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).
- Spinola, M., et al. Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival. Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).
- Read, D. F., et al. Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing. FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).
- Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro. Gene. 612, 19-24 (2017).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues. Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).
- Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases. Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).
- Lamichhane, T. N., et al. Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).
- Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).
- Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence. Cell. 18 (1), 11-26 (1979).
- Yan, M., et al. A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes. Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).
- Su, D., et al. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry. Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Dominissini, D., et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
- Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Schwartz, S., et al. Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA. Cell. 159 (1), 148-162 (2014).
- Schwartz, S., et al. High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis. Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).
- Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA. Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).
- Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tackling structures of long noncoding RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).
