Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تحليل في المختبر للكشف عن النشاط ترانسفيراز إيسوبينتينيل الحمض الريبي النووي النقال

Published: October 8, 2018 doi: 10.3791/58100
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Department of Genome Sciences, University of Washington, 3Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتوصيف البيوكيميائية إنزيم الرنا--تعديل الخميرة، Mod5، ومناقشة كيف يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الإنزيمات الأخرى تعديل الحمض النووي الريبي.

Abstract

ن6-إيسوبينتينيلادينوسيني الحمض النووي الريبي التعديلات متنوعة وظيفيا وحفظت عاليا بين بدائيات النوى وحقيقيات النوى. يحدث أحد أشد المصانة ن6-إيسوبينتينيلادينوسيني التعديلات في A37 بمجموعة فرعية من ترنس. ويحسن هذا التعديل الترجمة الكفاءة والإخلاص بزيادة التقارب من الحمض الريبي النووي النقال الريبوسوم. طفرة إنزيمات المسؤولة عن هذا التعديل في حقيقيات النوى ترتبط مع العديد من الدول المرض، بما في ذلك خلل mitochondrial والسرطان. ولذلك، فهم خصوصية الركيزة والبيوكيميائية أنشطة هذه الإنزيمات مهم لفهم البيولوجيا التوكسينات طبيعية ومرضية. قد استخدمت مجموعة متنوعة من الأساليب لتوصيف أنا التعديلات6A. وهنا يتم وصف نهج مباشر للكشف عن إيسوبينتينيلاتيون من Mod5. ويستخدم هذا الأسلوب الحضانة للكشف مع ترانسفيراز isopentenyl المؤتلف، تليها T1 رناسي الهضم، وتحليل التفريد جل 1-الأبعاد للكشف عن أنا التعديلات6A. وبالإضافة إلى ذلك، يناقش التكيف المحتملة لهذا البروتوكول لتوصيف الإنزيمات الأخرى تعديل الحمض النووي الريبي.

Introduction

وقد حددت 163 على الأقل تعديلات الحمض النووي الريبي بوسترانسكريبشونال متميزة، مع هذه التعديلات إسناد مهام متنوعة وتعتمد على السياق للكشف، والتأثير على بنية الحمض النووي الريبي مباشرة، والتي تؤثر على التفاعلات من الجيش الملكي النيبالي مع الآخر جزيئات1،2. كما يزيد من تقدير لعدد ومتنوعة من الحمض النووي الريبي التعديلات، من الضروري تطوير فحوصات يمكن استجواب موثوق بالتعديلات الجيش الملكي النيبالي والأنزيمات التي تحفيز لهم.

واحدة من أول التعديلات الحمض النووي الريبي تحديد يحدث في قاعدة 37 في ترنس، المتاخمة كودون المضادة على3،4الجانب 3 '. يتم نقل مجموعة إيسوبينتينيل من ديميثيلاليلبيروفوسفاتي (دماب) إلى موقف N6 الادينوسين 37 (أنا6A37) 3،5 على مجموعة فرعية ترناس هيولى والميتوكوندريا على حد سواء. أنا6A37 يحسن الترجمة الإخلاص والكفاءة بزيادة تقارب للحمض الريبي النووي النقال الريبوسوم4،6 ، ومن6A37 مهم لإجهاد استجابة في البكتيريا7. الإنزيمات التي تقوم بهذا التعديل يسمى الحمض الريبي النووي النقال إيسوبينتينيل ترانسفيراسيس وهي شديدة المحافظة في البكتيريا8،9والفطريات10،11من الديدان، النباتات12وأعلى حقيقيات النوى13 ، بما في ذلك البشر14.

الطفرات في الإنسان الحمض الريبي النووي النقال إيسوبينتينيل ترانسفيراز الجينات، TRIT1، المرتبطة بالأمراض التي تصيب البشر. على سبيل المثال، يرتبط بطفرة في TRIT1 مع مرض المتقدرية شديدة، ناجمة على الأرجح عن خلل في البروتين المتقدرية توليف15،16. وعلاوة على ذلك، وصفت بأنها ورم المكثف جينات17،18 TRIT1 وتورط في عدة أنواع من السرطان بما في ذلك سرطان الجلد19،20من الثدي و المعدة21وسرطانات الرئة22 ،23. وأخيراً، TRIT1 و Mod5 ترانسفيراسيس إيسوبينتينيل (Saccharomyces cerevisiae) هي المعرضة لتجميع البروتينات التي تشكل ألياف اميلويد مثل بريون24،،من2526. يحتمل أن تكون هذه الملاحظات توريط الحمض الريبي النووي النقال إيسوبينتينيل ترانسفيراسيس في أمراض الأعصاب، على الرغم من أن الأدلة المباشرة لهذا لم تظهر بعد.

نظراً للدور الذي تؤديه ترانسفيراسيس إيسوبينتينيل في الترجمة، والمرض، وأساليب مباشرة قياس مدى6نشاطا ترانسفيراز إيسوبينتينيل هي هامة لفهم ميكانيكية لهذه الإنزيمات تحت العادي والحالات المرضية. عدد متزايد من أساليب متوفرة للكشف عن أنا6"الجيش الملكي النيبالي" التعديلات، بما في ذلك في المختبر فحوصات إيسوبينتينيلاتيون، التهجين إيجابية في غياب أنا رقيقة6فحوصات (PHA6)، طبقة اللوني (TLC)، الأحماض الأمينية قبول النشاط فحوصات، والنهج الكتلي (المراجعة في الرقم 4).

لقد وصفت الإنزيم إيسوبينتينيليشن في المختبر يستخدم 14ج-DMAPP وترنس غير مسمى. في هذا التحليل، يتم نقل الكربون المشعة للجيش الملكي النيبالي من 14ج-دماب من ترانسفيراز إيسوبينتينيل. أثناء هذا الفحص حساس بدرجة كبيرة، من الصعب غالباً تحديد بقايا المحددة التي يتم تعديل9،،من2027. فحوصات PHA6 تعتمد على ضخمة أنا التعديل6بالتدخل مع التهجين التحقيق المسمى ف 32تمتد بقايا تم التعديل. على هذا النحو، أكبر في غياب أنا التهجين6تعديل18،،من2829. فحوصات PHA6 حساسة للغاية، وقادرة على تحليل الحمض النووي الريبي الإجمالية المستخرجة من ليساتيس الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، يعطي القدرة على تصميم المجسات الخاصة بالجيش الملكي النيبالي لمصلحة هذه المرونة هدفا كبيرا في الأسلوب. ومع ذلك، تقتصر فحوصات PHA6 وصف التعديلات التي تحدث على بقايا داخل المنطقة المستهدفة من التحقيق وذلك هي أقل احتمالاً لتحديد مواقع تعديل رواية. وباﻹضافة إلى ذلك، كما غياب الربط إرشادي للتعديل، التعديلات أو الطفرات التي تؤثر على الحمض النووي الريبي ملزمة أخرى سوف يتيه تحليل البيانات.

نهج آخر يجمع البنزيل دي السليلوز (دينار بحريني) السليلوز اللوني مع الأحماض الأمينية قبول النشاط كقراءات أنا التعديلات6A في الحمض الريبي النووي النقال30. هذا النهج مباشرة فحوصات الوظيفة أنا التعديل6A، ولكن هو نهج غير مباشرة للكشف عن أنا التعديل6A ويفتقر إلى قرار لتعيين إدخال تعديلات على رواسب محددة في الجيش الملكي النيبالي. وقد استخدمت نهج TLC للكشف عن مجموع الحمض الريبي النووي النقال أنا التعديلات6A. في هذا النهج، داخليا يتم هضمها 32ترنس المسمى ف إلى النيوكليوتيدات واحدة ويستخدم ثنائي الأبعاد TLC التحليل لتحديد إيسوبينتينيليشن. وهذا النهج حساسة للغاية في الكشف عن مجموع أولاً6A في عينة الحمض النووي الريبي معين ولكن عند الهضم، كل تسلسل المعلومات المفقودة؛ وهكذا، المحقق على أي طريقة من تحديد أي بقايا تم تعديل31.

في الآونة الأخيرة، أساليب السائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS) قد وضعت الكمية مقارنة مجموع التعديلات الحمض النووي الريبي بين الأنواع، أنواع الخلايا، وظروف تجريبية32،33، 34. حد من هذه المنهجية هو أنها أقل قدرة على تحديد هوية والموقف داخل الجيش الملكي النيبالي الذي كان نوكليوزيد المعدلة المستمدة34. وعلاوة على ذلك، بالخبرة الفنية والمعدات اللازمة لتنفيذ هذه التجارب تحد من إمكانية التطبيق العملي لهذا النهج.

وباﻹضافة إلى ذلك، وضعت العديد من تقنيات الجيل التالي التسلسل لخريطة الحمض النووي الريبي تعديلات على نطاق الترنسكربيتوم34. إيمونوبريسيبيتيشن من الكشف مع الأجسام المضادة المحددة لتعديل معين (RIP-Seq) تمكين المحقق لتحديد تسلسل كل تحتوي على35،تعديل محددة36. بالإضافة إلى ذلك، تعتمد النهج المستندة إلى المنتسخة العكسية مثل Seq تشيم وتسلسل عدم تطابق غير عشوائية على الاضطرابات من رد فعل النسخ العكسي في38،،من37بقايا تم التعديل39. على الرغم من الاستفادة من هذه التقنيات خريطة الحمض النووي الريبي التعديلات الترنسكربيتوم المنظومة، seq التمزق وتكنولوجيات Seq تشيم مقيدة بعدم وجود الأجسام المضادة موثوق بها أو المواد الكيميائية المتفاعلة متاحة لكل تعديل محددة، على التوالي34. وعلاوة على ذلك، الإنزيمات المنتسخة العكسية المطلوبة لأداء Seq تشيم وعدم تطابق غير عشوائية يسلسل تقنيات يمكن أن يعوقها هياكل الحمض النووي الريبي مستقرة. تعديل للغاية ومستقر هيكلياً طبيعة ترنس جعلها صعبة للغاية استجواب باستخدام هذه التقنيات. وحتى الآن، تقنيات الجيل القادم على أساس التسلسل قد لم تستخدم للخريطة الأول6تعديلات34.

هنا، يمكننا وصف نهج بسيط ومباشر للكشف عن أنا6A الحمض الريبي النووي النقال التعديلات في المختبر. ويستخدم هذا الأسلوب الحضانة للكشف مع المؤتلف S. cerevisiae إيسوبينتينيل ترانسفيراز (Mod5)، تليها T1 رناسي الهضم، وتحليل التفريد جل 1-الأبعاد الخريطة الأول6بالتعديلات. هذا النهج المباشر ويتطلب خبرة متخصصة قليلاً لتحليل البيانات. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب قابلة للتكيف للحمض النووي الريبي الأخرى تعديل الإنزيمات، بما فيها الإنزيمات التي تساهمي تغيير الوزن الجزيئي للحمض النووي الريبي أو التنقل رنا عبر هلام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: البروتوكول تم تكييفها من الرقم 24.

1-الحصول على الحمض النووي الريبي وإنزيم من الفائدة

  1. الاستخدام في المختبر نسخها الكشف المسمى داخليا مع 32ف، وأعرب في المؤتلف His6-Mod5 وتنقيته من كولاي، كما هو موضح سابقا24.
    1. إدخال في المختبر نسخها الكشف (الفرع 3) استخدام بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 حضور ATP غير مسمى والأداء النظري المركب، وأنشئ و UTP µCi 10 من تنقية هلام، عجلت الإيثانول α-ATP، حراكه في 1 x TE (10 ملم تريس-HCl الرقم الهيدروجيني 7.5، 0.1 مم يدتا)، وتخزينها في-80 درجة مئوية 24.
  2. وبدلاً من ذلك، الحصول على الكشف المسمى فلوريسسينتلي المتاحة تجارياً للفائدة. إنتاج enzyme(s) الفائدة في أي نظام التعبير المفضل.
    تنبيه: العلامات الفلورية الداخلية في الجيش الملكي النيبالي يمكن تغيير بنية الحمض النووي الريبي والاعتراف بالأنزيمات.

2-إعداد بولياكريلاميدي 20% من يشوه هلام

ملاحظة: من أجل الحصول على قرار كافية من الأجزاء رنا، ينصح هلام لوح عمودي طول 40 سم. يتم تحديد عرض جل يستخدم عدد من عينات تحليلها.

  1. دقة تنظيف ألواح الزجاج. أولاً، أغسل بالماء والصابون وشطف جيدا بالمياه. وأخيراً نظيفة مع الايزوبروبانول ومناديل خالية من الوبر.
  2. تجميع اللوحات والفواصل.
  3. مزيج الكواشف التالية لجعل 100 مل الاكريلاميد 20%، واليوريا 7.5 متر، 1 x TBE هلام: 80 مل من اليوريا جل التركيز (237.5 غ/لتر من مادة اكريلاميد، 12.5 غ/لتر من بيساكريلاميدي الميثيلين، اليوريا 7.5 متر في المياه)، 10 مل من اليوريا جل مخفف (7.5M اليوريا في المياه) ، و 10 مل من اليوريا جل المخزن المؤقت (0.89 M تريس-بورات-20 مم يدتا المخزن المؤقت الأس الهيدروجيني 8.3 و 7.5 م اليوريا).
    ملاحظة: يجب ضبط حجم حل جل وفقا لإبعاد هلام.
  4. إضافة 40 ميليلتر من N، N، N′، N′-تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) و 800 ميليلتر من فوق كبريتات الأمونيوم 10% طازجة (الجزائرية).
  5. وضع حل جل في محقن كبير والاستغناء عن بين ألواح الزجاج. اضغط على الزجاج بالاصابع بينما تتدفق إلى منع تكوين فقاعة.
  6. السماح لجل يصلب لمدة 30 دقيقة.
  7. المشبك جل طدت على جهاز جل الرأسي باستخدام مقاطع الموثق.
  8. تعبئة الدوائر المخزن العلوي والسفلي مع 1 x TBE.
  9. ساعتين قبل تحميل الهلام، قبل تشغيل الهلام في 20 mA، عن ح 2 للسماح بحدود المخزن المؤقت تفوق النوكليوتيد أصغر-خلاف ذلك أصغر النيوكليوتيدات والنوكليوتيد تميل إلى الانهيار في المخزن المؤقت الأمامي.

3-الجيش الملكي النيبالي إيسوبينتينيليشن الإنزيم

  1. إعداد ردود الفعل بحجم نهائي في 17 ميليلتر، التي تحتوي على 58 ملم تريس-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.2)، 1.2 مم ATP، 5.8 مم مجكل2، 0.2 مم DMAPP، مثبط "يو رناسي" 10 (مثلاً، سوبيرناسين)، ظهور 40,000 داخليا 32ف المسماة الجيش الملكي النيبالي، 5.3 ميكرومتر Mod5، و 1.2 مم 2- ميركابتوثانول.
  2. احتضان ردود الفعل في 37 درجة مئوية ح 1.
  3. إيثانول-متسرعا الكشف باستخدام أحجام 2.5 (42.5 ميليلتر) من الإيثانول 100% و 1/10 وحدات التخزين (1.7 ميليلتر) 3.5 م خلات الصوديوم الهيدروجيني 5.5، ومكان في-20 درجة مئوية ح 1 أو بين عشية وضحاها.
  4. الطرد المركزي عينات الحمض النووي الريبي لمدة 20 دقيقة في 15,400 س ز و 4 درجة مئوية.
  5. بعناية إزالة المادة طافية وتغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي مع 500 ميليلتر من الإيثانول 70%.
  6. عينات من أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق 15,400 س ز و 4 درجة مئوية.
  7. بعناية إزالة الكريات الحمض النووي الريبي طافية وأيردري لمدة 15 دقيقة، أو حتى قد تبخرت جميع الإيثانول.
  8. ريسوسبيند الكريات الجيش الملكي النيبالي في 10 ميليلتر من اليوريا م 8.
  9. إضافة 150 يو من T1 رناسي واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  10. إضافة 2 ميليلتر من 6 × تحميل المخزن المؤقت (والغليسيرول 60%، 0.1% زيلين نفط زايلين).
  11. تحميل 10 ميليلتر من كل عينة الحمض النووي الريبي في polyacrylamide تشغيل مسبقاً، 20%، 7.5 م اليوريا هلام (انظر المادة 2 من البروتوكول).
    ملاحظة: يمكن أن تدرج كعلامة تنقل إضافية سلالم حجم الجيش الملكي النيبالي راديولابيليد.
  12. تشغيل جل ح 2 في 25 اماه.
  13. وقف جل وإزالتها من الجهاز.
  14. كسر ختم بين ألواح الزجاج اثنين وإزالة واحد من ألواح الزجاج، مع هلام المتبقية على لوحة "أسفل".
    ملاحظة: الحرص على عدم تمزق الهلام أثناء هذه الخطوة.
  15. ضع طبقة من البلاستيك فوق الجل وتعرض على شاشة فوسفور حاء 3 بدلاً من ذلك، وضع جل على الورق اللوني وجاف مع هلام مجفف قبل التعرض الشاشة الفوسفور.
  16. صورة الشاشة الفوسفور في تصوير فوسفور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كان المحتضنة Mod5 مع تيروزين الحمض الريبي النووي النقال أو سيرين الحمض الريبي النووي النقال في وجود أو عدم وجود دماب. في أعقاب رد الفعل التعديل، كانت منتجات يهضم T1 رناسي، الذي كليفس 3 'نهاية جميع جانسينس ترك 3' جانسين مونوفوسفاتيس (GMP)24 (الشكل 1). وتنتج الهضم الكامل للكشف نمط يمكن التنبؤ به من شظايا راديولابيليد (الشكل 2A)، التي يتم حلها ثم في بولياكريلاميدي 20% يشوه هلام. نقل مجموعة إيسوبينتينيل من دماب للجيش الملكي النيبالي يسبب تحول تنقل في الجزء الذي يحتوي على بقايا تم التعديل (الشكل 1).

يكشف هذا البروتوكول موثوق بها إيسوبينتينيليشن بقايا الحمض الريبي النووي النقال كل المقبول وغير المقبول تعديل بواسطة Mod524. على سبيل المثال، هو توقع Mod5 لتعديل مجموعة فرعية ترنس، التي تحتوي على وصفه سابقا AAA36-38 تسلسل شرط10، بما في ذلك التيروزين الحمض الريبي النووي النقال وسيرين الحمض الريبي النووي النقال المستخدمة في هذه الدراسة. Mod5 يعدل بقايا توقع حضور DMAPP كما يتبين من 10 تحول nt AAA36-38 التي تحتوي على جزء في التيروزين الحمض الريبي النووي النقال (الشكل 2ب). وبالمثل، عندما سيرين الحمض الريبي النووي النقال هو المحتضنة مع Mod5 ودماب، تحولاً كاملا 10 nt AAA36-38 التي تحتوي على جزء من الملاحظ (الشكل 2-ج). من المثير للاهتمام، يلاحظ تحول جزئي لجزء من الإقليم الشمالي 7 التي لا تحتوي على AAA36-38 (الشكل 2-ج). تشير هذه البيانات إلى أن تسلسل36-38 AAA وهيكل ليست مطلوبة من أجل Mod5 في المختبر نشاط؛ ومع ذلك، الدراسات المستقبلية باستخدام LC-MS/MS أو أساليب أخرى مطلوبة لتأكيد الطبيعة الكيميائية الدقيقة للتعديل.

Figure 1
الشكل 1 : شكل توضيحي للمقايسة ترانسفيراز إيسوبينتينيل- الحمض الريبي النووي النقال، المسمى داخليا مع 32فأديونسيني، يرد المحتضنة مع S. cerevisiae الحمض الريبي النووي النقال إيسوبينتينيل ترانسفيراز (Mod5)، و ATP مع أو بدون دماب. يتم الإشارة إلى مواقف A36-A38 المتاخمة لمنطقة أنتيكودون. النجمة الحمراء تمثل النيوكليوتيدات راديولابيليد. بعد الحضانة، يهضم مع T1 رناسي الكشف، استخراج، وحل بالصفحة يشوه على 20%. يتم الإشارة إلى نقل مجموعة إيسوبينتينيل من دماب إلى الحمض الريبي النووي النقال عصابة المتخلفين أثناء التفريد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : T1 رناسي الهضم نتائج خريطة والممثل للمقايسة ترانسفيراز إيسوبينتينيل- (A) مثلثات سوداء تمثل مواقع الانقسام رناسي T1، وخطوط سوداء فوق المثلثات تمثل الشظايا الناتجة التي تحتوي على واحد على الأقل الادينوسين المسمى ف 32. المخلفات الرمادية المميزة توقع أنا مواقع التعديل6A (أي، A37). (ب) تيروزين الحمض الريبي النووي النقال وسيرين (ج) كانت المسمى الحمض الريبي النووي النقال داخليا مع 32فالادينوسين. وكان المحتضنة S. cerevisiae ترانسفيراز إيسوبينتينيل، Mod5، مع كل من الجيش الملكي النيبالي في وجود أو عدم وجود دماب. ثم يهضم مع T1 رناسي الكشف وحل يشوه الصفحة. تحولت العصابات تعتمد على دماب وتشير إلى وجود بقايا الجيش الملكي النيبالي معدلة. توقع تعديل الموقع، A37، مسطراً، وتعديل A37 بقايا يشار إليها بعلامة نجمة. تحديد موقع تعديل غير متوقعة ورواية وأشارت إلى أنها "أنا6ألف؟". وقد تم تعديل هذا الرقم من القراءة et al. 24 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لا تزال التعديلات الحمض النووي الريبي سيظهر على القيام بأدوار هامة ومتنوعة أكثر من أي وقت مضى في وظيفة الخلوية والعضوي. على هذا النحو، تطوير فحوصات استجواب رنا تعديل الإنزيمات المركزية لتحسين فهم الجوانب الأساسية لعلم الأحياء. ويصف هذا البروتوكول مقايسة عالية الدقة في المختبر تميز نشاط تعديل الحمض الريبي النووي النقال Mod5.

هذا البروتوكول له ميزة واضحة لتوفير قراءات مباشرة، والتفسير بسهولة من إيسوبينتينيليشن. يسمح البروتوكول وصف لتوصيف البيوكيميائية قوية من ترانسفيراسيس إيسوبينتينيل. وعلاوة على ذلك، هذا النظام يمكن استخدامها مع المتغيرات إنزيم أو تعديل ركائز الجيش الملكي النيبالي، مما يسمح لمباشرة تحديد أدوار بقايا محددة أو مجالات لها على التعديل. للحصول على قرار أكبر، يمكن أن يكون هذا البروتوكول سهولة معدّة لتشمل ديجيسشنز متوازية مع رنسيس الأخرى، مثل رناسي P1 و/أو رناسي A، التي تهزم في جميع النيوكليوتيدات الأربعة أو في ج و U، على التوالي.

حد من هذا التحليل هو أن الإنتاجية منخفضة نسبيا وهكذا الكشف أقل يمكن تحليلها عمليا بالمقارنة مع تسلسل الحمض النووي الريبي والطيف الكتلي النهج34. ولذلك، من غير المستحسن أن تستخدم هذا البروتوكول لأولئك الذين تهدف إلى التعرف على الحمض النووي الريبي تعديل مواقع الترنسكربيتوم على نطاق. هذا البروتوكول الأكثر فائدة للمحققين الذين يرغبون في دراسة الحمض النووي الريبي محددة تعديل الإنزيم مع الكشف خاصة للاهتمام. مع ذلك، تتطلب العديد من الترنسكربيتوم واسعة المنهجيات المستخدمة لتحديد التعديلات الحمض النووي الريبي التساهمية إضافة moiety الكيميائية النوكليوتيدات معدلة. يوفر هذا الأسلوب مقايسة رخيصة وفعالة حيث يمكن اختبار واحد تعديل البروتوكولات المتعلقة الركيزة فردية لتحسين التعديل الكيميائية قبل الالتزام ب جهد على نطاق الترنسكربيتوم40. على الرغم من أن هذا البروتوكول ينص مقايسة بسيطة ومباشرة للكشف عن النشاط ترانسفيراز إيسوبينتينيل، كما هو موضح هنا، يمكن أن تحسب فقط النسبة المئوية لتعديل الأجزاء رنا مجموع والمقارنة بين المجموعات. يجب حساب الباحثين المهتمين في مقارنات كمية الإنزيم النشاط أولاً وحدات النشاط لكل تركيز الإنزيم.

نجاح هذه الطريقة تعتمد اعتماداً كبيرا على عدد قليل من الخطوات الحاسمة. من المهم أن يؤكد سلامة الحمض النووي الريبي للفائدة قبل إيسوبينتينيليشن. تدهور عينة الحمض النووي الريبي قبل الفحص ترانسفيراز إيسوبينتينيل يمكن أن يكون لها تأثير كبير على تعديل الحمض النووي الريبي وارباك تفسير البيانات. وعلاوة على ذلك، مثل هذا التدهور يصعب اكتشافها بعد الهضم T1 رناسي قد حدث. ولذلك، من المستحسن أن يتم فحص سلامة الحمض النووي الريبي قبل يشوه الصفحة. وعلاوة على ذلك، من الضروري تماما وبدقة وصف مدى تعديل الحمض النووي الريبي، ضمان الهضم T1 رناسي شرعت في إنجاز. يمكن هضم الكشف بالتوازي مع T1 رناسي رنسيس إضافية، مثل رناسي P1 و/أو رناسي، لزيادة دقة هذا الفحص. يمكن استخدام سلالم اليغنوكليوتيد راديولابيليد طول المعروفة والتسلسل وعسر الهضم عينات الحمض النووي الريبي لتقييم عملية الهضم. وأخيراً، لبعض الإنزيمات، خصوصية التعديل يعتمد على الجيش الملكي النيبالي يجري في الدولة "بشكل صحيح" مطوية. بينما معظم المركب في المختبر ترنس حظيرة في هياكل تشبه بنيتها في فيفو ، هذا أقل معينة لفئات أخرى من الكشف، لا سيما مع أطول الكشف41.

على الرغم من أن البروتوكول وصف معين إلى إيسوبينتينيليشن Mod5 من ترنس، هذا الأسلوب يمكن تكييفها بسهولة لتوصيف الإنزيمات تعديل الحمض النووي الريبي الأخرى إضافة تساهمي مجموعة المواد كيميائية أن يغير إلى حد كبير بالوزن الجزيئي أو هلام تنقل الجيش الملكي النيبالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا شيء الكشف عنها.

Acknowledgments

ونود أن نشكر الدكتور ديفيد انجيلكي لقيادته وتعليقات مفيدة على هذه المخطوطة. نقابة الصحفيين الفلسطينيين-جامعة الدولة الكرة مختبر أموال بدء التشغيل؛ الدأب-منح 1R15AI130950-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
UreaGel Concentrate National Diagnostics EC-833 As part of a kit
UreaGel Diluent National Diagnostics EC-833 As part of a kit
UreaGel Buffer National Diagnostics EC-833 As part of a kit
10x TBE National Diagnostics EC-833 As part of a kit
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich 7727-54-0
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) Sigma-Aldrich T9281
Tris base Sigma-Aldrich T1503
Boric acid Sigma-Aldrich 10043-35-3
EDTA Sigma-Aldrich 60-00-4
ATP Sigma-Aldrich 34369-07-8
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
DMAPP Caymen Chemical 1186-30-7
Super RNaseIN ThermoFisher Scientific AM2694
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich 60-24-2
Ethanol Sigma-Aldrich 64-17-5
Sodiume acetate Sigma-Aldrich 127-09-3
Rnase T1 ThermoFisher Scientific EN0541
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5
Xylene cyanol Sigma-Aldrich 2650-17-1
Equipment and Supplies
Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) The Gel Company
Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) The Gel Company
Vertical gel apparatus The Gel Company S2-3040
50 mL disposable syringe Fisher Scientific 03-377-26
Stainless steel binder clips Idea Scientific 1066
Phosphoscreen Sigma-Aldrich 28-9564-74
Plastic wrap (local grocery store)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
  2. Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions. Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).
  3. Soll, D. Enzymatic modification of transfer RNA. Science. 173 (3994), 293-299 (1971).
  4. Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA. RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).
  5. Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA. Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).
  6. Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications. EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).
  7. Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation. RNA. 22 (5), 729-742 (2016).
  8. Caillet, J., Droogmans, L. Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA. Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).
  9. Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop. Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).
  10. Dihanich, M. E., et al. Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).
  11. Lemieux, J., et al. Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria. Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).
  12. Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).
  13. Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells. Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).
  14. Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase. Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).
  15. Kernohan, K. D., et al. Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene. Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).
  16. Yarham, J. W., et al. Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA. PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).
  17. Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer. Gene. 556 (1), 13-18 (2015).
  18. Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).
  19. Swoboda, R. K., et al. Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1. Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).
  20. Yue, Z., et al. Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information. Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).
  21. Chen, S., et al. Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population. Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).
  22. Spinola, M., et al. Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer. Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).
  23. Spinola, M., et al. Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival. Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).
  24. Read, D. F., et al. Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing. FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).
  25. Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro. Gene. 612, 19-24 (2017).
  26. Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
  27. Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues. Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).
  28. Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases. Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).
  29. Lamichhane, T. N., et al. Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).
  30. Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).
  31. Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence. Cell. 18 (1), 11-26 (1979).
  32. Yan, M., et al. A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes. Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).
  33. Su, D., et al. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry. Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).
  34. Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).
  35. Dominissini, D., et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
  36. Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  37. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  38. Schwartz, S., et al. Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA. Cell. 159 (1), 148-162 (2014).
  39. Schwartz, S., et al. High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis. Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).
  40. Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA. Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).
  41. Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tackling structures of long noncoding RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 140، وتعديل الحمض النووي الريبي، الحمض الريبي النووي النقال، ترانسفيراز إيسوبينتينيل، MOD5، TRIT1، وأنا6أ، أنا6A37، دماب
تحليل <em>في المختبر</em> للكشف عن النشاط ترانسفيراز إيسوبينتينيل الحمض الريبي النووي النقال
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chambers, A. E., Richardson, A. E.,… More

Chambers, A. E., Richardson, A. E., Read, D. F., Waller, T. J., Bernstein, D. A., Smaldino, P. J. An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity. J. Vis. Exp. (140), e58100, doi:10.3791/58100 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter